Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55204

⸱

24 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы отличить деление клеток от вариаций клеточного цикла в кардиомиоцитах, мы представляем протоколы с использованием двух трансгенных линий мышей: трансгенных мышей Myh6-H2B-mCh для однозначной идентификации ядер кардиомиоцитов и мышей CAG-eGFP-анилин для отличия деления клеток от вариаций клеточного цикла.

Аннотация

Кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, таким как эндоредупликация (продолжение циклов синтеза ДНК без кариокинеза и цитокинеза) и ацитокинетический митоз (кариокинез, но без цитокинеза). Такие атипичные вариации клеточного цикла приводят к образованию полиплоидных и многоядерных клеток, а не к делению клеток. Таким образом, для определения сердечного оборота и регенерации крайне важно правильно определить ядра кардиомиоцитов, количество ядер в клетке и статус их клеточного цикла. Это особенно верно для использования ядерных маркеров для идентификации активности клеточного цикла, таких как аналоги тимидина Ki-67, PCNA или pHH3. Здесь мы представляем методы распознавания кардиомиоцитов и их ядерной принадлежности, а также для определения активности их клеточного цикла. Мы используем две опубликованные трансгенные системы: трансгенную мышиную линию Myh6-H2B-mCh для однозначной идентификации ядер кардиомиоцитов и мышиную линию CAG-eGFP-анилин для дифференциации деления клеток от вариаций клеточного цикла. Объединенные вместе, эти две системы облегчают изучение регенерации и пластичности сердца.

Введение

Правильная идентификация ядер кардиомиоцитов и состояния клеточного цикла имеет решающее значение для определения сердечного оборота мышц и регенерации. Это особенно верно для использования ядерных маркеров, таких как pHH3, Ki-67, или аналоги тимидина, для идентификации клеточного цикла активности. По мере того как пролиферативную способность взрослых кардиомиоцитов млекопитающих очень мала 1, ложная идентификация ядра положительного для маркера пролиферации ядра кардиомиоцитов может внести существенное различие в результатах анализе пролиферации. Кроме того, кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, такие как эндоредупликации и acytokinetic митоза, которые приводят к полиплоидных и многоядерные клетки, а не в делении клеток. С этой целью, интерпретация меченых антител против маркеров общего клеточного цикла не является окончательным во всех случаях.

Здесь мы представляем методы прямой-forwa й признание кардиомиоцитов мышей и их ядерность в родных изолированных клеток и участков толстой ткани на послеродовом и взрослых этапах путем однозначной идентификации их ядер. Для этой цели, трансгенной линии мышей с кардиомиоциты экспрессией слитого белка , состоящего из Н2В человеческого гистона и mCherry под контролем промотора Myh6 (Myh6-Н2В-MCH) использовали 2. Скрещивание этой мыши линии с трансгенной индикатором пролиферации линии мыши, в которой экспрессия слитого белка EGFP-anillin находится под контролем повсеместной курица актина с CMV энхансер (CAG-EGFP-anillin), допускает определение статуса клеточного цикла. Подмости белок anillin специфически экспрессируется в клеточном цикле активных клеток 3, а его дифференциал субклеточном локализации во время клеточного цикла позволяет прогрессии клеточного цикла живого слежения с высоким разрешением M-фазыЭФ "> 4. Таким образом, двойной трансгенные мыши могут быть использованы для различения между пролиферирующих кардиомиоцитов и те , которые претерпевают изменения клеточного цикла. Это доказывает , особенно полезным при скрининге пролиферации индуцирующих веществ в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры этого протокола с участием животных в соответствии с этическими нормами Боннского университета и соответствовали руководящим принципам из Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента по защите животных, используемых для научных целей.

1. Экстракорпоральное Визуализация клеточного цикла активность в послеродовом кардиомиоцитов

  1. Послеродовая кардиомиоциты диссоциации
    1. Предварительно экспериментальные препараты
      1. Подготовка культуральной среды (IMDM, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 0,1% β-меркаптоэтанол); среда 1: добавить FCS до 2%; среда 2: добавить FCS до 20%.
      2. Шерсть 96-луночного блюдо культуры (площадь половинной рост: 15 мм 2) с 0,1% желатина в растворе PBS.
    2. Сердце рассечение
      1. Приготовьте чашку Петри с 15 мл PBS и хранить его на льду. Стерилизовать два пинцета и маленькие ножницы, помещая их в сухое стекло шарика стерилизатор.
      2. Жертвоприношение неонатальной трансгенных мышей (CAG-EGFP-anillin / Myh6-Н2В-MCH) путем обезглавливания. Откройте грудную клетку, рассекают сердце, как описано в Ehler и др. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 DOI: 10,3791 / 50154), и передать его на ледяной PBS. Переход к следующей мыши.
      3. При использовании не-гомозиготные гнездящихся пар, выявить трансгенные сердца с флуоресцентным микроскопом. Положите сердца в PBS под флуоресцентным микроскопом. Проверьте выражение EGFP-anillin (Напр .: 488 нм; Em .: 509 нм) и экспрессию H2B-МЧ (напр .: 587 нм, Em .: 610 нм) с соответствующими наборами фильтров.
    3. изоляция кардиомиоцитов
      1. Диссоциируют выбранные сердца с помощью неонатального набора сердца диссоциации. Выдержите смеси ферментов 1 при 37 ° С в течение 5 мин. Для получения 1 мл конечного ферментной смеси, добавляют 945 мкл смеси ферментов 1 до 55 мкл смеси ферментов 2.
      2. Трансфер до 4 сердца от P1 - P3 мышей или до 2-х сердец от P4 - P6 мышей к 1,5 мл гeaction пробирку, содержащую 1 мл смеси ферментов и вырезать сердце на мелкие кусочки ножницами. Переносят раствор в 15 мл реакционных труб.
      3. Инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин. Для того, чтобы максимально увеличить контакт между тканью и ферментами, положить трубку объемом 15 мл почти горизонтально в инкубаторе. Смешайте с помощью пипетки 5 - 10 раз вверх и вниз с помощью пипетки 5 мл. Повторите этот шаг три раза.
      4. Добавить 7,5 мл среды 2 (20% FCS), чтобы остановить реакцию фермента. Фильтр суспензии клеток через клеточный фильтр 70 мкм. Промыть фильтр грубой очистки клеток 3 мл среды 2.
      5. Центрифуга клеточной суспензии при 300 × г в течение 15 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды 1; красных клеток крови лизис не требуется для дальнейших экспериментов. Пипеткой 10 мкл суспензии клеток в счетной камере и клеток определяют количество клеток.
      6. Для 96-луночного планшета: семян 10000 клеток на лунку в 120 мкл среды 1 (2% FCS). Местоклетки в инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) и сразу же приступить к трансфекции.
  2. Трансфекция неонатальных кардиомиоцитов с миРНК или микроРНК
    1. Протрите скамью с обеззараживающим раствором РНКазы, чтобы удалить РНКазы. Очистите следующий материал с обеззараживающим раствором РНКазы: 10-мкл, 100 мкл, и 200-мкл пипетки и коробку льда. Оттепель миРНК акции аликвоты (100 мкМ) на льду.
    2. Приготовьте 2 мкм рабочие запасы Si / микроРНК в уменьшенном сыворотки среде (98 мкл восстановленного сыворотки среды + 2 мкл миРНК 100 мкМ акций). Рабочий запас должен быть использован в тот же день. Замораживание не рекомендуется.
    3. Добавить 4 мкл 2 мкМ запаса до 6 мкл восстановленного сыворотки среды в реакционную пробирку 0,5 мл (количество для одного 96-луночного, окончательная концентрация Si / микроРНК в 140 мкл: ~ ​​57 нм). Выберите подходящий объем для количества скважин, предназначенных для трансфекции с определенным отношением Si / микроРНК.
    4. Подготовка мастер смеси реагента для трансфекции. Используйте 10 мкл (0,6 мкл реагента для трансфекции + 9,4 мкл восстановленного сыворотки среды) для каждой лунки (всего 96 лунок).
    5. Добавьте си / микроРНК смешивания в смесь трансфекция реагента. Инкубировать в течение 5 минут на льду. Пипеткой 20 мкл в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% СО 2 , а затем заменить среду в каждую лунку с 120 мкл среды 1. Через 24 ч или более, перейти к фиксации и иммунофлуоресцентного окрашивания.
  3. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание
    1. Удалите среду и промыть клетки один раз PBS. Накройте клетки с 4% -ным раствором формальдегида в течение 20 мин. Снимают раствор формальдегида и промыть клетки один раз PBS, а затем покрывают их PBS для хранения или перейти к иммунным окрашиванием.
    2. Инкубируйте с первичным антителом (концентрация в соответствии с инструкциями изготовителя) в 0,2% Triton-X и 5% осла сыворотки в течение не менее 2 ч.Если окрашивание на альфа-актинин (разбавление 1: 400; моноклональное анти-α-актинины), пятно в течение ночи при температуре 4 ° С.
    3. Удалить первичное антитело и промыть 3 раза PBS. Разведите вторичные антитела в Hoechst растворе 1: 400 и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Удалить антитело, промывают PBS, 3 раза, и покрывают клетки с PBS для хранения при 4 ° С.
  4. Конфокальной микроскопии видео
    1. С помощью конфокальной микроскопии для получения изображения. Откройте программу обработки изображений. Откройте "Настройки A1plus" и установите флажки для CH1, CH2 и СН3. Установите СН1 DAPI, СН2- к EGFP, Ch3 к Cy3 и СН4 к Cy4, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите Смещение 0, используя ползунки, и нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню.
      2. Нажмите Оптимизировать, чтобы открытьОкно "XYZ Размер установки". Флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)". Увеличение интенсивности лазерного излучения, пока изображение не является ни недоэкспонирован, ни передержано.
        Примечание: Например; Ch1 (DAPI): 16%, СН2- (EGFP): 12%, СН3 (Су3): 100%, СН4 (Cy5): 1%. Задать смещение для всех каналов до 0.
    2. Делайте снимки с использованием объектива 20X (200-кратное увеличение). Сканирование большое изображение , состоящее из плитки изображений (например, 3 х 3).
      1. В программном обеспечении визуализации, перейдите в раздел "Приобретите" и выберите "Сканировать большое изображение" из выпадающего меню. Под "Площадь", выберите "текущая позиция находится в верхнем левом углу" из выпадающего меню и установите "Количество полей в X и Y" до 3 х 3. Нажмите кнопку "Сканировать".
  5. анализ изображений
    1. Определить количество ядер кардиомиоцитов путем подсчета Н2В-Ch сигналов и количество кардиомиоцитов путем подсчета α-актинин сигналы.
      1. Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Нажмите на ядрах с сигналами Н2В-МЧ, таким образом, маркировки и подсчета их. Сделайте то же самое для α-актинин-позитивных клеток, чтобы получить число кардиомиоцитов.
    2. Граф G2 фазы кардиомиоциты S / с сигналами ядерных EGFP-anillin (EGFP-anillin + / + H2BmCh ядер). Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Все ядра с EGFP-anillin сигналов и сигналов Н2В-МЧ, нажав на них.
    3. Граф кардиомиоциты с митозом конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), таких как цитоплазматических сигналов, сократительных кольца и midbodies. Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" со следующего импldown меню. Марк кардиомиоцитов с митоза конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), цитоплазматических сигналов, сократительных колец и midbodies, нажав на них.

2. Определение нуклеации у взрослых кардиомиоцитов по Лангендорфа Диссоциация и Толстые тканевых секций

  1. Выделение взрослых кардиомиоцитов путем Лангендорфа диссоциации
    1. Подготовка перед рассечением сердца
      1. Заполните инсулиновый шприц (30-го калибра иглы) с гепарином (20 ед / г массы тела). Захватите мышью на загривок. Поднимите и поверните мышь назад, чтобы обнажить живот для инъекций.
      2. Выполните внутрибрюшинную инъекцию. Поместите гепарином мышь обратно в клетку и ждать по крайней мере за 15 минут до начала сердца рассечение. Промыть и проветрить аппарат Лангендорфа с 5 - 10 мл перфузионного буфера (перфузии буфер: 135 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 2,5 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, и 25 мМ БДМ в DDH 2 O, доведения рН до 7,4 с помощью NaOH).
    2. Сердце рассечение
      1. Подготовьте 10 см чашку Петри с охлажденной (4 ° С) PBS и поместить его на льду. Заполнить и проветривать 1-мл шприц, соединенный с канюлей (20 калибра) с PBS. Закрепите канюлю с пластилином на границе чашки Петри. Поместите кончик полой иглы чуть ниже поверхности PBS.
      2. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков. Протрите живота с 70% -ным раствором этанола. Сделайте надрез от середины живота к грудине с хирургическими ножницами. Снимите диафрагму и разрезать грудную клетку на двусторонней основе с хирургическими ножницами.
      3. Поднимите и закрепите грудины с 20-го калибра иглы, откройте грудную полость, и осторожно возьмитесь за сердце с анатомическими щипцов. Поднимите сердце и удалить его из легких и сосудистую систему, сокращая сосуды тракта оттока.
        Примечание: Для того, чтобы определить аорту, расположите сердцеего вентральной стороной вверх. Это уменьшает расстояние между обоими предсердиями, поэтому аорта с ее ветвей можно найти между предсердиями. В зависимости от индивидуальных особенностей архитектуры сердца, ветви могут быть удалены, если главная ветвь аорты все еще достаточно долго.
      4. Передача сердце в 10-см чашки Петри, содержащей охлажденным PBS (смотри стадию 2.1.2.1). Сердце иглу, потянув за восходящую аорту на инъекционной канюлей G20x1 ½, который был тупого колеблющимся многофункциональный инструмент, чтобы избежать повреждения тканей. Закрепите аорту с резьбой на канюлю. Осторожно промыть сердце PBS, чтобы удалить лишнюю кровь, нажав на поршень шприца. Небольшое расширение сердца должно быть видно.
    3. Langendorff сердце диссоциации
      1. Подключите каннюлирован сердце быстро к адаптеру замка Luer в перфузионной аппарате Лангендорфа. Заливать сердца с 30 мл насыщенной кислородом буфера перфузионного при 37 ° С в течение 5 мин со скоростью потока 1 капли / с. ThСкорость потока д может быть адаптирован путем регулирования потока O 2 в устройстве Лангендорфа с использованием редукционного клапана (давление в диапазоне от 0 до 200 мбар).
      2. Подготовка пищеварения буфера непосредственно перед использованием: перфузионной буфера с 6 U коллагеназы B, 10000 единиц трипсин, и 50 мкМ CaCl 2. Удалить буфер перфузию и начать ферментативного расщепления путем добавления 30 мл теплого (37 ° С) и насыщенным кислородом буфера пищеварения.
        Примечание: Количество коллагеназы B должно быть титруют в зависимости от активности различных партий.
      3. Отрегулируйте поток в размере 1 капля / с и переварить сердце в течение 10 - 13 мин. Во избежание загрязнения, не используйте оттоку снова. Перенести сердце к 10-см чашки Петри с 5 мл буфера пищеварения. Рассеките ткани вручную с помощью щипцов, удерживая сердце с одной парой щипцов и с помощью другой пары, чтобы разорвать сердце на мелкие кусочки.
        Примечание: На этом шаге предсердия могут быть разделены, разрезают на небольшиештук (с радужной оболочки глаза ножницами), и переваривают в течение 30 мин в 750 мкл буфера для переваривания в инкубаторе при 37 ° С, чтобы получить изолированные предсердных клеток. Для того, чтобы получить чистые предсердные кардиомиоциты, пипетку вверх и вниз несколько раз с использованием 1-мл пипетки. Остановить ферментативную реакцию путем добавления 750 мкл стоп-раствора.
      4. Остановить пищеварение путем добавления 5 мл останавливающего раствора (перфузионное буфер с 5% FBS и 50 мкМ CaCl 2). С помощью серологической пипетки, фильтровать суспензии клеток через клеточный фильтр 100 мкм и собирают клетки в центрифужную пробирку на 50 мл. Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      5. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл останавливающего раствора с помощью серологической пипетки на 10 мл. Центрифуга клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      6. После центрифугирования, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в 1 мл культуральной среды (IMDM с 20% FCS, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг / мл каждого из пенициллина и стрептомицина и 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола) с последующим культивированием. С другой стороны, перейдите к шагу 2.2, "иммунофлюоресценции окрашивание" и зафиксировать клетки.
      7. Для фиксации на 24-луночные планшеты, пластины 10000 изолированных клеток на лунку на 8 мкг / мл ламинин покрытием покровные в 24-луночные планшеты с 500 мкл культуральной среды при 37 ° С и 5% СО 2 в течение по меньшей мере 3 ч ,
  2. Иммунофлуоресценции окрашивание на Langendorff-изолированных кардиомиоцитов в суспензии
    1. Закрепить Лангендорфа-изолированные кардиомиоцитов в 1 мл 4% PFA в PBS, рН 7,4, в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре, удалите закрепитель, и промыть клетки дважды PBS.
    2. Ресуспендируют фиксированные кардиомиоцитов в 1 мл PBS и либо продолжить иммунофлюоресценции окрашиванием или хранить их в 500 мкл PBS на лунку на24-луночный планшет при температуре 4 ° С. Перенести часть клеточной суспензии (~ 100 - 200 мкл) в микроцентрифужных трубки. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
    3. Проницаемыми, блок, и окрашивать клетки с первичными антителами против альфа-актинин путем добавления 200 мкл первичного антитела, разбавленного 1: 400 в PBS с 0,2% тритона Х-100 и 5% ослиной сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Промывают осадок клеток ПБС, а затем центрифугируют при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и инкубировать в 200 мкл Alexa-Fluor-конъюгированного вторичного антитела (анти-мышиного IgG1), разведенным 1: 400 в Hoechst красителя (рабочий раствор: 1 мкг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    5. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Повторите этот шаг. Защита образца от света. рesuspend клеток в 200 - 500 мкл PBS и переносят 100 - 300 мкл суспензии клеток в лунку микроскопии камеры. Закройте крышку камеры и не хранить клетки при 4 ° С до обработки изображений. Защита от света.
  3. Анализ нуклеарностью Langendorff-изолированных кардиомиоцитов
    1. Возьмем изображения с α-актинины окрашенных кардиомиоцитов с целью 25X, что соответствует увеличении 250х. Подсчитайте количество ядер Н2В-MCH + только в тех кардиомиоцитов, которые регулярно окрашивали альфа-актинин и показывают типичные стержнеобразные морфологии и поэтому считаются неповрежденными.
    2. Граф, по крайней мере 100 кардиомиоцитов из трех разных сердец. Вычислить процент одноядерных, биядерных и трехъядерных кардиомиоцитов.
      Примечание: Как правило, двуядерные клетки должны составлять около 80 - 90%, в то время как трехъядерные клетки и те, с большим числом ядер встречаются редко (<1% в Langendorff-изолированные кардиомиоцитов, <3% в толстых ломтиков). Предсердные кардиомиоциты значительно меньше, чем желудочковых кардиомиоцитов. Как правило, одноядерные клетки составляют 90% от общей численности населения.
  4. Изоляция, фиксация и криоконсервация взрослых сердец как подготовка к толстых ломтиков
    1. Собирают перфузионное устройство для фиксации посредством соединения 50-мл шприц с 3-ходовым запорным краном с удлинительной трубкой Heidelberger и второй 3-ходовым запорным краном. Закрепить шприц в подставке таким образом, что проточный включена под действием силы тяжести. Заполните систему с 15 мл PBS.
    2. Выполните шаги 2.1.2.1-2.1.2.4, «Подготовка сердца." Подключите инъекции канюлю G20x1 ½ с сердцем блокировки адаптера Luer пузырьковой освобождающего PBS заполненный перфузионного устройства и заливать его с PBS. Заполните систему с 10 - 15 мл 4% -ного формальдегида в PBS, который затем увлажненную через сердце. Погружение исправить сердце в 4% растворе формальдегида в течение ночи.
    3. Заменить 4% формальдегидараствора ПБС, а затем моют сердце в PBS на горизонтальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 8 часов при комнатной температуре. Заменить PBS с 20% -ным раствором сахарозы к обезвоживанию сердца в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Замораживание сердце в крио-вложение среды в небольшой пресс-форме.
      1. Настроенный химический стакан, заполненный 2-метилбутана и поместить его в коробку с сухим льдом. Положите сердце в морозильную формы ранее наполовину заполненной с крио вложением среды и покрыть его полностью с крио вложение среды. Осторожно поместите форму в холодный химический стакан, предотвращая контакт крио-вложение среды с 2-метилбутана. Хранить замороженные ткани при -80 ° С до использования.
  5. Получение толстых срезов сердца
    1. Используйте следующую установку в замораживающий микротом: температура объекта от -18 до -20 ° С, температура в камере от -21 до -23 ° С, угол клиринговую на держателе ножа 4 °, и микротомных лезвия Перо R35.
    2. Возьмите КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ Organ из морозильного контейнера и закрепить его на образец диска с крио-вложение среды с использованием быстрого замораживания шельфа. Поместите сердце таким образом, что секционирование начинается в вершине.
    3. Отрезать 50-мкм срезы, пока еще секущую плоскость не будет достигнута и орган становится видимым. Вырезать 50 мкм срезы тканей, используя замораживающий микротом в ручном режиме с малой скоростью и с противодействующего крену пластины, расположенной на ноже. Маунт ломтики на обработанных солевым раствором микроскопа. Пусть кусочки высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре и хранить слайды при температуре -80 ° С или пятна непосредственно.
  6. Окрашивание толстые ломтики сердца (ядра и клеточные мембраны)
    1. Застойная сердечная ломтиков РНКазой А (20 мкг / мл) в буфере для промывки (0,5 М NaCl, 0,1 М Трис, рН 7,5, и 50 мМ ЭДТА) в кювете в течение 1 ч при 37 ° С. Инкубируйте ломтики в 0,2% Triton-X в промывочном буфере в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть ломтики дважды в течение 5 минут каждый в буфере для промывки в кювете нагоризонтальном шейкере при комнатной температуре.
    2. Пятно на ночь с 1 мкМ до-Pro3 йодида (642/661) и флуоресцеин-связанных агглютинина зародышей пшеницы (WGA, 1: 100) в буфере для промывки при температуре 4 ° С. Промыть Срезы три раза в течение 5 мин каждый с промывочным буфером в кюветах на горизонтальном шейкере и покрывают их поливинилового спирта монтажной среды с анти-выцветания реагента и покровным стеклом.
  7. получение изображений
    1. В идеале, используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопа, оборудованного с целью NA воды Погружение 40X / 1.15. Поиск по глазом для области в срезе, который состоит из продольно выровненных кардиомиоцитов; для этой цели, канал флуоресцеин-WGA (напр .: 488 нм) лучше всего подходит.
      Примечание: Этот шаг имеет важное значение, поскольку верхний и нижний пределы кардиомиоциты должны быть видны в пределах Z-стека для последующих анализов. По мере того как глубина изображения ограничивается ~ 30 нм, а толщина среза составляет 50 мкм, не представляется возможным, чтобы имПоперечные возраст сечения этих клеток (длина ячейки: ~ 120 мкм).
    2. Отрегулируйте настройки в программном обеспечении визуализации. Откройте программу обработки изображений. Открыть A1plus Настройки и установите флажки для CH2, CH3 и СН4. Набор для EGFP Ch2, ch3 к Alx546 и СН4 к Alx647, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите смещение 0, используя ползунки. Нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню и нажмите кнопку оптимизации, чтобы открыть окно "XYZ Size Setup". Установите флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)".
    3. Нажмите на "живом" сканирования и настройки интенсивности лазерного излучения, нажав на ползунков на отдельных каналах. Установите флажок "Z Series" на окне "ND" Приобретение и нажмите на "определенную верхнюю кнопку" окно. Определить верхнюю иКнопка Z-стека, нажав на соответствующие кнопки после регулировки фокуса на микроскопе. Установите ширину Z-шага до 0,5 мкм.
      Примечание: Глубина Z-стека ограничен оптическим проникновением в ткани и отношением сигнал-шум.
    4. Перейти в раздел "Настройки A1plus" и установите Line Average / Integral 2-4, нажав на выпадающее меню. Тонкая настройка интенсивности лазерного излучения; пинхола должно быть как можно меньше, чтобы изображения в фокальной плоскости.
  8. Анализ нуклеации
    1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и загрузить Z-стек интерес.
    2. Вручную определить зарождение в Z-стеков путем прокрутки через различные уровни стека для того, чтобы идентифицировать клетки, которые лежат полностью в пределах стека; это тот случай, когда окрашивание РГА видна во всех измерениях. Подсчитайте число ядер (большинство из них будет двухядерный) и отметьте анализируемую ячейку аннотацией в программном обеспечении.
    3. Определить количество ядер CM (H2B-MCH +) и суммарных ядер (TO-Pro3 +) в 3D - реконструкций для отдельных каналов (рис 2D). В программном обеспечении формирования изображения, нажмите на кнопку "Binary" и выберите "Определение пороговых значений 3D" из выпадающего меню. Выберите из меню канала выпадающего меню либо Alx546 для числа ядер см или Alx647 для подсчета общего числа ядер. При нажатии на соответствующие стрелки, установите программу на "Smooth 4x", чистый 1x, и заполнить отверстия ON. Проверьте "Размер" окна и установить его на 5 мкм с помощью ползунка. Установите порог, используя ползунок, пока не появятся отдельные объекты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После применения фрагментации, окно результатов показывает таблицу количественных событий и цветной фрагментации изображения. Поскольку некоторые ядра непосредственно контактируют друг с другом, вручную корректировать автоматический результат измерения дублетов, которые не могут быть корректно разделены программным обеспечением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того чтобы проанализировать влияние миРНК / микроРНК на активность клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов в пробирке, кардиомиоцитов двойных трансгенных мышей Myh6-Н2В-МЧ / CAG-EGFP-anillin были выделены на постнатальный день 3 (P3) и трансфицировали клеточный цикл активности индуцирующего miR199 5, миРНК p27 и миРНК Fzr1. По сравнению с отрицательным контролем (рисунок 1А), картины miR199- (Фиг.1В) и миРНК p27-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует спор по поводу того, кардиомиоциты способны повторно клеточный цикл и разделить после травмы и в течение гомеостаза тканей. Значения для основного оборота кардиомиоцитов были даны в диапазоне от 1% до 1 и 80% 7. Кроме того, после повреждения сердца, индукция активности клеточного цикла и генерацию новых кардиомиоцитов сообщили в пограничной зоне, со значениями между 0,0083% 8 и 25 - 40% 7. Эти расхождения отчасти м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Благодарим С. Грюнберга (Бонн, Германия) и. Фрайтага (Бонн, Германия) за их техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 см чашка ПетриSarstedt821472
100 &микро; m клеточное ситечкоBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-бутандион моноксим (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ канюля для инъекций, StericanBraun, Melsungen4657519
игла 20 калибраBecton Dickinson GmbH301300
24-луночные пластиныBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Метил-бутанCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% раствор формальдегидаAppliChem GmbH A0936,1000
3-ходовой запорный кранB. Braun Medical Inc.16494C
Шприц 50 млB. Braun Medical Inc.8728810F
70% этанолOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-конъюгированное вторичное антителоJackson ImmunoResearch115-605-205
Альфа-актинин EA-53, мышиный IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Микропланшет для клеточной культуры, 96 Хорошо, Half AreaGreiner bio-one675986
коллагеназой BRoche11088815001
конфокальный микроскоп Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
ослиная сывороткаJackson Immuno Research, Саффолк, GB017-000-121
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический растворSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
фетальная телячья сывороткаPromoCell, Heidelberg
Раствор формальдегида (4%)PanReac AppliChemA3697
Желатин из свиной кожи, тип АSigma-Aldrich, SteinheimG2500
стеклянные покровные стеклаVWR631-0146
ГлюкозаSigma-AldrichG7021
Удлинительная трубка HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Гепарин-НатриумРатиофарм5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
Слайды микроскопа HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  мг/мл)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Инсулиновый шприцBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
лазерное сканирование Mikroskop Eclipse tiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Дармштадт13778075
мыши IgG Cy5 (осел)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
микроцентрифужная трубкаSarstedt72690
Мини-шейкерVWR12620-940
miVana miРНК имитатор, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/VWR4565
M-slide 8-луночный ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
отрицательный control (скремблированная РНК)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Набор для диссоциации сердца новорожденныхMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Заменимые аминокислоты, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, среда с пониженным содержанием сывороткиGibco51985-026
p21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
p27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
пенициллин/стрептомицинGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Монтажная среда из поливинилового спирта с DABCO®, противовыцветающаяSigma-Aldrich10981
РНКаза АQiagen1007885
РНКазаZapInvitrogen/Life Technologies, ДармштадтAM9780
контейнеры для образцовVitlab80731
Серологическая пипеткаGreiner607180
программное обеспечение NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 йодид (642/661)Молекулярный зонды/ThermoFisher ScientificT3605
Tris Sigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
ТрипсинSigma-AldrichT1426
Агглютинин зародышей пшеницы (WGA) Флуоресцеин меченыйVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&альфа;-актининовое антителоSigma-AldrichA7811
β-меркаптоэтанолSigma-Aldrich, SteinheimM3148

Ссылки

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ядра кардиомиоцитовактивность клеточного циклатрансгены H2B-mCherryсигналы EGFP-аналинаконфокальная видеомикроскопияпереваривание тканей сердцаопределение ядерностидетектирование эндоредупликациивизуализация митозарегенерация сердца
Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.