Method Article

Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы отличить деление клеток от вариаций клеточного цикла в кардиомиоцитах, мы представляем протоколы с использованием двух трансгенных линий мышей: трансгенных мышей Myh6-H2B-mCh для однозначной идентификации ядер кардиомиоцитов и мышей CAG-eGFP-анилин для отличия деления клеток от вариаций клеточного цикла.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, таким как эндоредупликация (продолжение циклов синтеза ДНК без кариокинеза и цитокинеза) и ацитокинетический митоз (кариокинез, но без цитокинеза). Такие атипичные вариации клеточного цикла приводят к образованию полиплоидных и многоядерных клеток, а не к делению клеток. Таким образом, для определения сердечного оборота и регенерации крайне важно правильно определить ядра кардиомиоцитов, количество ядер в клетке и статус их клеточного цикла. Это особенно верно для использования ядерных маркеров для идентификации активности клеточного цикла, таких как аналоги тимидина Ki-67, PCNA или pHH3. Здесь мы представляем методы распознавания кардиомиоцитов и их ядерной принадлежности, а также для определения активности их клеточного цикла. Мы используем две опубликованные трансгенные системы: трансгенную мышиную линию Myh6-H2B-mCh для однозначной идентификации ядер кардиомиоцитов и мышиную линию CAG-eGFP-анилин для дифференциации деления клеток от вариаций клеточного цикла. Объединенные вместе, эти две системы облегчают изучение регенерации и пластичности сердца.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правильная идентификация ядер кардиомиоцитов и состояния клеточного цикла имеет решающее значение для определения сердечного оборота мышц и регенерации. Это особенно верно для использования ядерных маркеров, таких как pHH3, Ki-67, или аналоги тимидина, для идентификации клеточного цикла активности. По мере того как пролиферативную способность взрослых кардиомиоцитов млекопитающих очень мала 1, ложная идентификация ядра положительного для маркера пролиферации ядра кардиомиоцитов может внести существенное различие в результатах анализе пролиферации. Кроме того, кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, такие как эндоредупликации и acy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры этого протокола с участием животных в соответствии с этическими нормами Боннского университета и соответствовали руководящим принципам из Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента по защите животных, используемых для научных целей.

1. Экстракорпоральное Визуализация клеточного цикла активность в послеродовом кардиомиоцитов

  1. Послеродовая кардиомиоциты диссоциации
    1. Предварительно экспериментальные препараты
      1. Подготовка культуральной среды (IMDM, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 0,1% β-меркаптоэтанол); среда 1: добавить FCS до 2%; среда 2: добавить FCS до 20%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы проанализировать влияние миРНК / микроРНК на активность клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов в пробирке, кардиомиоцитов двойных трансгенных мышей Myh6-Н2В-МЧ / CAG-EGFP-anillin были выделены на постнатальный день 3 (P3) и трансфицировали клеточный цикл активности индуцирующего miR199 5, миРНК p27 и миРНК Fzr1. По сравнению с отрицательным контролем (рисунок 1А), картины miR199- (Фиг.1В) и миРНК p27-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует спор по поводу того, кардиомиоциты способны повторно клеточный цикл и разделить после травмы и в течение гомеостаза тканей. Значения для основного оборота кардиомиоцитов были даны в диапазоне от 1% до 1 и 80% 7. Кроме того, после повреждения сердца, индукция активности клеточного цикла и генерацию новых кардиомиоцитов сообщили в пограничной зоне, со значениями между 0,0083% 8 и 25 - 40% 7. Эти расхождения отчасти м.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим С. Грюнберга (Бонн, Германия) и. Фрайтага (Бонн, Германия) за их техническую помощь.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 см чашка ПетриSarstedt821472
100 &микро; m клеточное ситечкоBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-бутандион моноксим (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ канюля для инъекций, StericanBraun, Melsungen4657519
игла 20 калибраBecton Dickinson GmbH301300
24-луночные пластиныBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Метил-бутанCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% раствор формальдегидаAppliChem GmbH A0936,1000
3-ходовой запорный кранB. Braun Medical Inc.16494C
Шприц 50 млB. Braun Medical Inc.8728810F
70% этанолOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-конъюгированное вторичное антителоJackson ImmunoResearch115-605-205
Альфа-актинин EA-53, мышиный IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Микропланшет для клеточной культуры, 96 Хорошо, Half AreaGreiner bio-one675986
коллагеназой BRoche11088815001
конфокальный микроскоп Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
ослиная сывороткаJackson Immuno Research, Саффолк, GB017-000-121
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический растворSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
фетальная телячья сывороткаPromoCell, Heidelberg
Раствор формальдегида (4%)PanReac AppliChemA3697
Желатин из свиной кожи, тип АSigma-Aldrich, SteinheimG2500
стеклянные покровные стеклаVWR631-0146
ГлюкозаSigma-AldrichG7021
Удлинительная трубка HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Гепарин-НатриумРатиофарм5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
Слайды микроскопа HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  мг/мл)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Инсулиновый шприцBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
лазерное сканирование Mikroskop Eclipse tiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Дармштадт13778075
мыши IgG Cy5 (осел)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
микроцентрифужная трубкаSarstedt72690
Мини-шейкерVWR12620-940
miVana miРНК имитатор, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/VWR4565
M-slide 8-луночный ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
отрицательный control (скремблированная РНК)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Набор для диссоциации сердца новорожденныхMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Заменимые аминокислоты, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, среда с пониженным содержанием сывороткиGibco51985-026
p21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
p27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
пенициллин/стрептомицинGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Монтажная среда из поливинилового спирта с DABCO®, противовыцветающаяSigma-Aldrich10981
РНКаза АQiagen1007885
РНКазаZapInvitrogen/Life Technologies, ДармштадтAM9780
контейнеры для образцовVitlab80731
Серологическая пипеткаGreiner607180
программное обеспечение NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 йодид (642/661)Молекулярный зонды/ThermoFisher ScientificT3605
Tris Sigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
ТрипсинSigma-AldrichT1426
Агглютинин зародышей пшеницы (WGA) Флуоресцеин меченыйVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&альфа;-актининовое антителоSigma-AldrichA7811
β-меркаптоэтанолSigma-Aldrich, SteinheimM3148

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles