Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

19.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55205

⸱

6 февраля 2017 г.

 ,  , 
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

В этой статье

Краткое содержание

Была разработана и оценена методология отбора проб на основе макропены для обнаружения и количественной оценки норовируса на твердых поверхностях окружающей среды.

Аннотация

Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической гастроэнтерита во всем мире. Поскольку большинство инфекций либо передаваться непосредственно по маршруту от человека к человеку или косвенно через экологические поверхностей или продуктов питания, загрязненных фомиты и неживые поверхности являются важными инструментами для распространения вируса во время вспышек норовируса.

Мы разработали и оценили протокол с использованием макропена мазки для обнаружения и типирования человека норовирусами с твердых поверхностей. По сравнению с волокном тампоны или антистатическими салфетками, макропена тампоны позволяют восстановление вируса (диапазон 1.2-33.6%) от поверхностей сиденье для унитаза до 700 см 2. Протокол включает в себя шаги для извлечения вируса из смывов и дальнейшей концентрации вирусной РНК с использованием спиновых столбцов. В общей сложности 127 (58,5%) из 217 образцов мазков, которые были собраны с поверхности в круизных судах и учреждениях длительного ухода, где были норовирус гастроэнтеритсообщили положительный результат на GII норовируса по RT-КПЦР. Из них 29 (22,8%), может быть с успехом проведено генотипирование. В заключение, обнаружение норовируса по экологическим поверхностей с использованием протокола было разработано может помочь в определении уровня загрязнения окружающей среды во время вспышек, а также обнаружения вируса, когда клинические образцы не доступен; она может также способствовать мониторинг эффективности стратегий реабилитации.

Введение

Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической острого гастроэнтерита во всем мире 1, 2, 3. Вирус чрезвычайно заразен и передача происходит путем прямого человека к человеку взаимодействия или косвенно через контакт с зараженной пищей, водой или экологических поверхностей. Норовирусы может быть пролита в течение длительных периодов времени и длительное выживание вируса на экологических поверхностях было зарегистрировано 1, 2, 3. В пик линьки миллиарды вирусных частиц освобождаются на грамм фекалий, а также рвотные массы содержит достаточное количество вирусных частиц , чтобы вызвать инфекцию 4, 5, 6, 7, 8,эф "> 9, 10. Кроме того, передача вируса между неодушевленных поверхностей и кожи человека может произойти легко 2, 11, 12. Таким образом, мониторинг загрязнения окружающей среды может помочь в расследовании вспышек эпидемий и при оценке эффективности очистки и процедуры дезинфекции.

Несколько протоколов отбора проб окружающей среды были описаны для обнаружения ротавирусов, колифага МС2, калицивироз (FCV), и бактериофаг Р22 13, 14, 15, 16. Тем не менее, условия проверки , описанные в этих исследованиях, в том числе быстрого иссушения (<1 час) и небольших участков поверхности (25 х 100 см 2), не может адекватно представлять настройки полей. Кроме того, ожидается, низкие уровень загрязнения ENVIROnmental поверхности требуют протоколы, которые способны обнаружить очень мало вирусных частиц.

Мы разработали макропена на основе метода дискретизации поверхности для обнаружения и типирования норовирус. Этот метод был утвержден в течение нескольких норовируса вспышек. Протокол включает в себя 1), как собирать образцы мазков из окружающей среды поверхностей (2), как наилучшим образом сохранить целостность образцов во время сбора и доставки в лабораторию, и 3) лабораторные испытания и типирование норовирус.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Тампон Отбор проб в поле

  1. Носите чистую пару перчаток.
  2. Измерьте размер области выборки, не касаясь поверхности с помощью измерительной ленты или линейки. Попробуйте оценить область как можно более точно и заполнить форму отчета (Дополнительная таблица 1).
  3. Проверьте комплект тампон на предмет возможных утечек и транспортных мешков образцов этикеток и мазков комплектов.
  4. Переместить тампон через область отбора проб следующим образом: один удар в горизонтальном направлении, один удар в вертикальном направлении, и один удар в диагональном направлении. Не тампоном площадь поверхности больше , чем 700 см 2.
  5. Поместите каждый тампон в пробирку и плотно закройте крышку.

2. Хранение и транспортировка мазков в лаборатории

  1. Держите тампоны при 4 ° С в течение до 48 часов. Если требуется хранение в течение более длительных периодов, хранить тампоны при -20 ° С (или -70 ° С).
  2. Храните пробирки при температуре 0-4 ° С (т.е., , Используйте холодные компрессы) в изолированном контейнере во время транспортировки в лабораторию и корабля в течение 24-48 ч сбора.

3. Вирус Концентрация РНК вируса экстракции и очистки

Примечание: Все стадии центрифугирования используют настольную центрифугу при 5000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, если не указано иное. Будьте особенно осторожны при работе с универсальным экстракция нуклеиновой кислоты (UNEX) буфера. Надеть очки или маску.

  1. Этикетка один 15 мл трубки и один столбец РНК Midi для каждого образца. Включите отрицательного контроля экстракции в каждом эксперименте.
  2. Для приготовления раствора лизис в течение 10 тампонов, смешайте 25 мл буфера UNEX 25 мл PBST (PBS, рН 7,2, содержащем 0,02% твина-80).
  3. Добавьте 50 мкл колифага MS2 суспензии (10 6 БОЕ / мкл) в 50 мл раствора лизиса.
  4. Поместите тампон в 15 мл пробирку и добавляют 5 мл раствора лизиса. Смешать и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Добавить 5 мл 100% этанола в каждую пробирку и вихря в течение 10 с.
  6. Осторожно удалите тампон из 15 мл трубки (она содержит UNEX буфер) нажав его осторожно по отношению к стороне трубки, чтобы удалить лишнюю жидкость, а затем выбросить тампон. Остальные объемы должны быть в пределах 9-10 мл.

4. Midi Колонка вирусной нуклеиновой кислоты экстракции

  1. Тщательно передачи 4,5 мл смеси UNEX / этанол из стадии 3.6 на миди колонку, центрифугу и отбросьте фильтрат.
  2. Загрузите еще 4,5 мл из той же смеси на ту же колонку, центрифугу, и отбросьте фильтрат.
  3. Для первой промывки, добавляют 3,5 мл 70% -ного этанола на Midi колонке, центрифугу и отбросьте фильтрат.
  4. Для второй промывки, добавляют еще 3,5 мл 70% -ного этанола на колонку Midi. Центрифуга и отбросьте фильтрат.
  5. Для сухого спина, центрифугировать столбцы Midi, чтобы удалить все следы этанола (что может негативно повлиять на восстановление вирусной РНК).
  6. Поместите колонку Midi в новой 15 мл центрифужную пробирку. Добавьте 250 мкл буфера для элюции на колонку Midi; ждать в течение 1 мин перед тем центрифугирование, чтобы получить самую высокую вирусную РНК восстановления.
  7. Хранить извлеченную нуклеиновую кислоту, при температуре -70 ° С или немедленно перейти к шагу 5.

5. Концентрация вирусной нуклеиновой кислоты с использованием РНК Clean и обогатительной наборы

  1. Добавить 500 мкл буфера для связывания РНК в 250 мкл РНК элюировали в стадии 4.7 выше и вихре в течение 10 с.
  2. Добавить 750 мкл 100% -ного этилового спирта и перемешивают механически в течение 10 с.
  3. Добавьте столбец спина для каждого образца. Загрузите образец 750 мкл на ротационную колонку.
  4. Центрифуга спин колонки при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
  5. Загрузите оставшиеся 750 мкл на ротационную колонку и центрифуге при 12000 мкг в течение 1 мин.
  6. Для предварительной стирки, добавьте 400 мкл РНК Prep буфера в каждую ротационную колонку и центрифуге при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
  7. Для первой промывки, добавляют 800 мкл РНК промывочного буфера в каждую ротационную колонку и центрифугировать при 12000 х г в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
  8. Для второй промывки, добавьте 400 мкл РНК промывочного буфера в ротационную колонку и центрифугу при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
  9. Для сухого спина, центрифугировать столбец спина, чтобы удалить все следы промывочного буфера при 12000 мкг в течение 2 мин.
  10. Аккуратно перенести спиновую колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  11. Добавьте 25 мкл буфера для элюции на ротационную колонку и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Это увеличит восстановление вирусной РНК из колонки.
  12. Накопление РНК путем центрифугирования колонки спина при 10000 мкг в течение 1 мин.
  13. Либо перейти непосредственно к RT-кПЦР (стадия 6), или магазин РНК при -70 ° С.

6. Мультиплех RT-КПЦР Обнаружение геногруппа I и II Норовирусы и колифага MS 2 (Дополнительный таблица 2)

  1. Чистые рабочие поверхности, pipettэс, и центрифуг с обеззараживающим раствором РНКазы для уменьшения возможного загрязнения.
  2. Оттепель RT-КПЦР реагенты на льду. Оттепель РНК на льду (в отдельной области / комнате).
  3. Определить количество реакций и добавить по крайней мере , на 10% больше из них (например , если требуется 10 реакций, сделать мастер смеси для 11).
  4. Вихревые компоненты индивидуальные мастер-микс, для 25х RT-КПЦР фермента, в течение 5 с исключением. Тщательно перемешать фермент слегка ударяя по пробирке с пальцем.
  5. Кратко компонентов смеси центрифуг мастер в течение 5 с.
  6. Подготовка мастер смеси для реального времени RT-PCR обнаружения норовирусной GI и GII согласно инструкции к набору и добавления Норовирусная-специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов в 1,5 мл микроцентрифужных трубки (Дополнительный таблица 3).
  7. Смешайте мастер смеси с помощью пипетки в 5-10 раз вверх и вниз (вортексе не рекомендуется). Аликвоты 22 мкл мастер смеси в каждую лунку ПЦР в реальном времени 96-луночного планшета.
  8. Vortex РНК образцав течение 5 сек, и собирать кратковременным (5 с) центрифугированием.
  9. Добавьте 3 мкл образца РНК и GI и GII положительного контроля к пластине RT-КПЦР (следовать шаблон из таблицы 2). Добавить 3 мкл нуклеазы-Freewater в не-шаблон контроля (NTC) скважин.
  10. Печать в режиме реального времени пластина с оптической клейкой пленкой.
  11. Тщательно центрифугировать в режиме реального времени пластины при 1300 х г в течение 1 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха или капли жидкости, которые могут присутствовать в лунках.
  12. Настройка ПЦР в реальном времени инструмента и настройки следующие термоциклирования условия: 1) RT шаг в течение 10 мин. при 45 ° C (2) активация Taq-полимеразы, 10 мин. при температуре 95 ° С и (3) 45 циклов по 15 с при 95 ° С и 60 с при 60 ° С.

7. Количественное норовирус в тампон Образцы

  1. Проверьте результаты положительного и отрицательного контроля для проверки результатов RT-КПЦР (Дополнительный таблица 3).
  2. Определите, соответствует ли каждый стандарт КриваяДопустимые значения приведены в таблице 2 Дополнительной и рассчитать общее стандартное отклонение для стандартной кривой , используя уравнение 1.
    (Уравнение 1)% КПД = 100 х 10 ( в среднем Ct Значения-Intercept) / Slope.
  3. Если Термоциклер программное обеспечение ПЦР не вычисляет наклон для каждой стандартной кривой, определяют наклон и R 2 значения с помощью регрессии с помощью статистического программного обеспечения (например , Excel, SPSS, или SAS). Кроме того, рассчитать КПД% для стандартных кривых следующим уравнением I
  4. Запишите номер РНК копий , рассчитанное с помощью программного обеспечения термоциклера для всех испытательных образцов , основанных на стандартных кривых , которые соответствуют критериям , указанным в дополнительном таблице 4. Перезапустите любые образцы со стандартными кривыми тствия не отвечают критериям или имеют ложноположительные управления. Проверьте значения Ct из колифага MS2, который был добавлен в качестве внутреннего контроля для контроля ингибирования ПЦР.
  5. Определить общее количество копий РНК робразец эр умножающими количества РНК копий, вычисленное на этапе 7.2 отношением объема (от 25 до 50 мкл) Общую РНК в качестве элюента до, что РНК (от 3 до 5 мкл), используемого для реакции RT-КПЦР. В качестве альтернативы, рассчитать плотность РНК путем деления общего количества РНК копий на площадь поверхности объекта (см 2) анализируемый.

8. генотипирование в режиме реального времени RT-PCR положительных образцов с помощью Hemi вложенную обычных ПЦР-амплификации

  1. Приготовьте первый раунд мастер - смеси для каждого праймера набор анализа RT-PCR (дополнительные таблицы 2 и 5).
  2. Добавьте 5 мкл норовирусной положительной РНК 20 мкл основной смеси.
  3. Запуск RT-PCR при следующих условиях: (1) RT шагом в течение 30 мин при 42 ° C (2) активация Taq-полимеразы, 15 мин при 95 ° С, и (3) 40 циклов 30 с при 95 ° C , 30 сек при 50 ° С и 60 с при 72 ° С. После 40 циклов, инкубировать еще в течение 10 мин при 72 ° С.
  4. Подготовьте второй раунд матер смеси для каждого праймера набор анализа RT-PCR (дополнительные таблицы 2 и 5).
  5. Добавьте 23 мкл основной смеси и добавьте 2 мкл первого раунда продуктов RT-PCR (от первого раунда) в каждую пробирку (в идеале первый круглый продукт должен быть разбавлен 1/10 в РНКазы свободной воды).
  6. Повторите шаг 8.3.
  7. Готовят гель 2% -ном агарозном в 100 мл 1x Трис-ацетат ЭДТА (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА при рН 8,3). После растворения агарозы путем нагревания смеси в микроволновой печи, добавить 10 мкл красителя нуклеиновой кислоты на 100 мл приготовленного гель после охлаждения смеси до 60-70 ° С, влить гель и вставьте гребни. Пусть гель оседать в течение не менее 30 мин.
  8. Смешайте по 15 мкл каждого продукта RT-PCR с 3 мкл 6х красителем. Нагрузка 15 мкл каждого образца и electrophorese агарозном геле при 100 В в течение 1 ч.
  9. Акцизный мишень ОТ-ПЦР фрагменты соответствующего размера (330 пар оснований для GI и 341 пар оснований для GII) из геля А.Н.d очищают РНК с использованием набора для экстракции из геля коммерчески. Очищенный продукт ПЦР теперь может быть использован для Sanger секвенирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана блок - схема протокола отбора проб тампоном. Этот протокол состоит из четырех основных этапов; 1) сбор образцов, 2) хранения и транспортировки пробы, 3) вирусной РНК очистки и концентрирования и 4) RT-КПЦР анализ и генотипирование.

figure-results-1
Рисунок 1: Блок - схема итогового протокола для отбо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Норовирусы имеют 50% человеческого инфекционную дозу между 18 и 10 3 вирусных частиц 20. Поэтому, даже загрязнение низкого уровня поверхности может представлять опасность для здоровья населения. Некоторые аспекты протокола отбора проб тампоном были оценены в том числе: 1) различные мазков материалы, 2) хранение состояние тампонов во время транспортировки, 3) концентрации вирусной РНК, и 4) колифага MS2 как внутреннего контроля экстракции.

До недавнего време...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтующих интересов. Выводы и заключения в этом отчете принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную позицию Центров по контролю и профилактике заболеваний.

Благодарности

У авторов нет благодарностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Общее название наборов
Macrofoam swabPremoistened EnviroMax Swab kit Puritan2588060PFUW
буфер для лизиса сильно>РНК  CDC UNEX буферMicrobiologicsCat No MR0501
RNA extraction spin columnMidi columnOmega BiotekCat No R6664-02
очистка РНК spin columnZymol RNA Clean and Concentrator kit Zymo ResearchCat No R1016
Набор для ОТ-ПЦР в реальном времениAgPath Набор для ОТ-ПЦР в один этап<Life TechnologiesCat No 4387391
strong>Обычный набор для ОТ-ПЦРQiagen Набор для ОТ-ПЦР в реальном времени Набор для ОТ-ПЦРCat No
210212Набор для экстракции геляQiagen QIAнабор для быстрой экстракции геляQiagen kitCat No 28704 или 28706
Колифаг MS2ATCCCat No 15597-B1
Транскрипты
Платформа для ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемыМодель ABI 7500
MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo ScientificCat No 4306311
<стока РНКОптическая 96-луночная реакционная пластина Thermo Scientific Cat No 4316813

Ссылки

  1. Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
  2. Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
  3. Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
  4. Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
  5. Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
  6. Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
  7. Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
  8. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277(2015).
  9. Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
  10. Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
  11. Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
  12. Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
  13. Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
  14. Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
  15. Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
  16. Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
  17. Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
  18. Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
  19. Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
  20. Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
  21. Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
  22. Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
  23. Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
  24. Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
  25. Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
  26. Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
  27. Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
  28. Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
  29. Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.