Методическая статья

Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и В Ситу Пробирной Расстояние Лигирование

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 января 2017 г.

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белок-белковые взаимодействия могут происходить как в ядре, так и в цитоплазме клетки. Для исследования этих взаимодействий применяются традиционная ко-иммунопреципитация и современный анализ бесконтактного лигирования. В этом исследовании мы сравниваем эти два метода, чтобы визуализировать распределение взаимодействий NF90-RBM3 в ядре и цитоплазме.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белок-белковые взаимодействия участвуют в тысячах клеточных процессов и происходят в определенном пространственном контексте. Традиционно, ко-иммунопреципитация является популярным методом обнаружения белок-белковых взаимодействий. Последующий вестерн-блоттинг является наиболее распространенным методом визуализации ко-иммунопреципитированных белков. В последнее время анализ бесконтактного лигирования стал мощным инструментом для визуализации белок-белковых взаимодействий in situ и дает возможность количественно оценить белок-белковые взаимодействия с помощью этого метода. Подобно обычной иммуноцитохимии, метод анализа близости-лигирования также основан на доступности первичных антител к антигенам, но, в отличие от этого, анализ близости-лигирования обнаруживает белок-белковые взаимодействия с помощью уникальной методики, включающей ПЦР по скользящему кругу, в то время как обычная иммуноцитохимия показывает только колокализацию белков.

Nuclear factor 90 (NF90) и РНК-связывающий мотив белок 3 (RBM3) ранее были продемонстрированы как взаимодействующие партнеры. Они преимущественно локализуются в ядре, но также мигрируют в цитоплазму и регулируют сигнальные пути в цитоплазматическом компартменте. Здесь мы сравнили взаимодействие NF90-RBM3 как в ядре, так и в цитоплазме с помощью ко-иммунопреципитации и анализа близости-лигирования. Кроме того, мы обсудили преимущества и ограничения этих двух методов в визуализации белок-белковых взаимодействий в отношении пространственного распределения и свойств белок-белковых взаимодействий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ядерный фактор 90 (NF90) является мульти-изоформы белка с многочисленными функциями , включая ответ на вирусную инфекцию, регуляции интерлейкина-2 после транскрипции и регуляции миРНК биогенеза 1-3. RBM3 представляет собой РНК-связывающий белок, участвует в переводе и микроРНК биогенеза и могут быть вызваны различными стрессорами включая гипотермию и гипоксией 4-6. В последнее время мы нашли NF90 и RBM3 в белковом комплексе 7. Взаимодействие NF90 и RBM3 имеет важное значение для модуляции РНК-как эндоплазматический ретикулум киназы (PERK) активность протеинкиназы в развернутом ответе белка 7. Оба NF90 и RBM3 расположены преимущественно в ядре , но небольшая часть NF90 и челнока RBM3 в цитоплазму и связываются там друг с другом для определенных функций, например , для регулирования Перк активности. Поэтому, важно, чтобы визуализировать распределение NF90-RBM3 взаимодействий в субклеточном отсеке, что может указывать наих различные роли в соответствующем отсеке.

Несколько десятилетий назад, был разработан дрожжи двух гибридных (Y2H) для определения взаимодействия между двумя белками 8. Тем не менее, из-за искусственной конструкции слитых белков, ложноположительных результатов ограничили применение этого метода. В течение долгого времени, со-иммунопреципитации была основным методом для анализа белок-белковых взаимодействий, особенно в условиях эндогенными 9. Для анализа со-иммунопреципитации белкового комплекса, Вестерн-блот является наиболее удобным способом, в то время как масс-спектрометрия используется, когда супер чувствительность и точность желательны. В последние годы, близость Лигирование анализ был разработан в качестве нового способа выявления белок-белковых взаимодействий в обеих клетках и тканях на месте 10,11.

Здесь мы сравнили самый популярный метод совместного иммунопреципитации и относительно новое соседство перевязки метод анализа в захвате NF90-RBM3 взаимодействие в субклеточных фракциях. Мы также обсудили преимущества и недостатки обоих методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Со-иммунопреципитации

  1. Семенной НЕК293 в 2 х 10 5 клеток на лунку в одном 6-луночные планшеты в 2 мл модифицированной среде Игла (DMEM) добавка Дульбекко Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep) ,
  2. Рост клеток в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
  3. Промыть клетки с холодным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в три раза. Урожай клетки центрифугированием при 500g в течение 5 мин при 4 ° С.
  4. Подготовка ядерных и цитоплазматических фракций с использованием коммерческих реагентов ядерных и цитоплазматических извлечения. Следуйте инструкциям изготовителя с некоторыми изменениями.
    1. С помощью 3 х 10 6 клеток для одного со-иммунопреципитации эксперимента (примерно с 90% сплошности из 3 -х скважин из одного 6-луночный планшет). Добавьте 300 мкл холодного цитоплазматический экстракционного раствора (CER I) и вихрь в течение 15 секунд при максимальной скорости.
    2. Инкубировать в течение 30 мин на льду. Во время инкубации, vorteх в течение 5 секунд каждые 10 мин.
    3. Добавить 16,5 мкл холодного цитоплазматический экстракции раствора II (CER II), вихревое течение 5 сек и инкубировать в течение 5 минут на льду.
    4. Вихревые в течение 5 секунд и центрифуге при 16000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    5. Перенести супернатант (цитоплазматический экстракт) в новую предварительно охлажденной трубки, и держать на льду до использования.
    6. Вымойте нерастворимые гранулы (содержащие ядра) три раза с 1 мл холодного PBS каждый раз с помощью пипетки вверх и вниз в пять раз. Удалить PBS после мытья.
    7. Добавьте 150 мкл холодного раствора ядерной экстракции (NER), вихревое течение 15 сек и инкубировать 1 час на льду. Во время инкубации, вихревое течение 15 сек и пипеткой 10 раз с наконечником 200 мкл каждые 10 мин.
    8. Вихревые в течение 15 с и центрифуге при 16,000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    9. Перенести супернатант (ядерный экстракт) в новую предварительно охлажденной трубки, держать на льду до использования.
  5. Возьмите 10% от объема ядерных и цитоплазматических экстрактов каждый в качестве входных данных.
  6. д.д. холодного PBS для оставшихся экстрактов до конечного объема 1 мл. Хранить на льду до использования.
    Примечание: Предварительная очистка не является существенным при использовании G-протеина с сопряженными магнитных шариков. Тем не менее, если фон высокой, выполнить предварительную очистку путем инкубирования 40 мкл протеин G-конъюгированные магнитные гранулы (50% суспензии) и 1 мл разбавленного лизата от этого шага при температуре 4 ° С в течение 30 мин на ротатора. Отдельный супернатант (предварительно очищенного лизата) из бисера с магнитной стойкой. Откажитесь бусы.
  7. Для пары первичного антитела с белком G-конъюгированные магнитные шарики, инкубировать 40 мкл белка G-конъюгированных магнитных шариков (50% суспензии) с 4 мкг кроличьи поликлональные анти-RBM3 антителом или кроличьих IgG (отрицательный контроль) в 200 мкл PBS плюс Tween 20 буфере (PBST, 0,02% твин-20) при комнатной температуре (КТ) в течение 40 мин на поворотное устройство.
  8. Отдельные антитела в сочетании бусинки и супернатанта с магнитной стойке, и отбросить супернатант. Вымойте бисером один раз 200 мкл PBST (0,02%).
  9. Добавьте 1мл разбавили лизатов (или в случае необходимости, предварительно очищен лизатов) к гранулам, и инкубировать на ротатор при 4 ° С в течение ночи.
  10. На следующий день, отделить бусинки и супернатант магнитной стойке, и отбросить супернатант. Промыть 3 х 10 мин с 0,5 мл PBST (0,02%) для каждой пробирки при температуре 4 ° C на поворотное устройство с фиксированной скоростью 20 оборотов в минуту.
  11. Элюции белки из шариков путем добавления 40 мкл буфера для образцов (1x коммерческого буфера для образцов и 50 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT)). Нагревают при 70 ° С в течение 10 мин. Спин вниз и транспортировки жидкостей в новый 1,5 мл трубки.
  12. Развести входные лизатов в буфере для образцов (конечная концентрация: 1x коммерческого буфера для образцов и 50 мМ DTT) и высокую температуру при 70 ° С в течение 10 мин. Нагрузка входы и иммунопреципитации белки от последнего шага к сборного 4-12% бис-трис-гель. Объем загрузки каждой лунки не должна превышать 20 мкл. Выполните электрофорез в 1x коммерческого рабочего буфера на льду в течение 35 мин.
    Примечание: Нагрузка ядерной и цитоплазматической экстрактs в соотношении 1: 2 (V / V), который отражает то же начальное количество клеток.
  13. Перенос белков на PVDF мембрану в 1x коммерческий буфер передачи на 30 В, в течение 2 ч при 4 ° С.
  14. Блок мембрана с 5% обезжиренным молоком в PBST (0,1% Tween 20) при комнатной температуре в течение 40 мин на шейкере.
  15. Инкубируйте мембрану с первичными антителами (как разбавленный в соотношении 1: 1,000) в PBST (0,1%) при 4 ° С в течение ночи.
  16. Промыть 3 х 10 мин с помощью PBST (0,1%) при комнатной температуре на шейкере.
  17. Инкубируйте мембраны с пероксидазой хрена (HRP) против мышиных или анти-кроличий вторичными антителами (как разбавленный в соотношении 1: 5000) в PBST (0,1%) при комнатной температуре в течение 1 часа.
  18. Промыть 3 х 10 мин с помощью PBST (0,1%) при комнатной температуре на шейкере.
  19. С помощью 0,2 мл усиленной хемилюминесценции (ECL) субстратной смеси на см 2 мембраны, инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Избегайте весь свет от этого шага и далее, за исключением красных огней.
  20. Откажитесь жидкость и подвергать воздействию рентгеновской пленки в кассете пленки. Разработка фильма с использованием автоматического пр пленкиocessing машина.

2. Иммуноцитохимическая и Пробирной Расстояние Лигирование

  1. Семенной НЕК293 при 1,5 х 10 4 клеток на камеру в слайде с покрытием из 8-камера поли-D-лизина в 0,4 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл Pen-Strep.
  2. Рост клеток в течение 48 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
  3. Отберите среда, и зафиксировать клетки с 4% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Отберите PFA и мыть 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
  5. Проницаемыми и блокировать клетки с помощью 0,5% Тритона Х-100 и 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Инкубируйте с первичными антителами в 0,1% Triton X-100 и 5% NGS в PBS на шейкере при температуре 4 ° С в течение ночи. Развести мышиное моноклональное анти-NF90 антитела и кроличье поликлональное антитело против RBM3 антитела 1: 100 в PBS для двойного окрашивания. Для отрицательного контроля, опускать независимо друг от друга либо из двух первичных антител, и опускать оба антитела в третьем контролем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте коммерческую блокировку и разбавление реагентов.
  7. Вымойте 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
  8. С учетом иммуноцитохимию или близости протоколов анализа лигирования
    1. Иммуноцитохимическая
      1. Инкубируйте с 1: 500 разбавленный зеленый флуоресцентный краситель связью анти-мышь и красный флуоресцентный краситель связью анти-кроличьи вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 часа. Избегайте света от этого шага вперед.
      2. Проводят контрастное ядер с 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI), разбавленный 1: 5000 в PBS при комнатной температуре в течение 10 мин.
      3. Вымойте 3 х 10 мин с 0,5 мл PBS в камере.
      4. Удалите из камеры предметного стекла и сухой. Крепление с 250 ц, монтаж среды на слайде.
    2. Близость анализа лигирования
      1. Приготовьте Пробирной Расстояние Лигирование зондов. Смешайте и разбавьте две Пробирной Расстояние Лигирование зондов (анти-мышь и анти-кроличьи вторичные антитела, прикрепленные с различными олигонуклеотидами, которые могут перевязывать тысгрубое сложение двух других олигонуклеотидов в лигирования растворе) оба 1: 5 в 0,1% Triton X-100 и 5% NGS в PBS, с общим объемом 320 мкл в течение одного 8-камеры горкой (примерно 40 мкл на см 2) , Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
      2. Удалите камеры из предметное стекло и добавляют разбавленные зондов. Инкубируют в термостате влажности при 37 ° С в течение 1 часа.
      3. Приготовьте раствор перевязки. Смешайте 8 мкл лигазы, 64 мкл 5 х лигирование запас и 248 мкл H 2 O.
      4. Отпайки жидкость из ползуна, и мыть 2 х 5 мин в 1x промывочного буфера А (поставляется с комплектом).
      5. Добавить лигирования раствор и инкубировать в термостате влажности при 37 ° С в течение 30 мин.
      6. Приготовьте раствор амплификации. Смешайте 4 мкл полимеразы, 64 мкл 5х амплификации состава и 252 мкл H 2 O. Избегайте света от этого шага вперед.
      7. Отпайки жидкость из слайде, и моют 2 х 2 мин в 1x промывочного буфера А.
      8. Добавьте усилительРешение lification и инкубировать в темном инкубаторе влажности при 37 ° С в течение 100 мин.
      9. Отпайки жидкость из ползуна и промывки 2 х 10 мин в 1x промывочного буфера В (входит в комплект). Промыть в течение 1 мин в 0.01x промывочного буфера B.
      10. Сушат слайд и смонтировать 250 мкл коммерческой монтажной среды (с DAPI) на слайд.
  9. Проверьте флуоресцентные сигналы под микроскопом с использованием 10X окуляра и 20X объектив. Получение изображений с помощью ПЗС-камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показано , что NF90 и RBM3 являются ядерные белки и лишь небольшая часть присутствует в цитоплазме. Следует отметить, что существуют три различные полосы окрашивали позитивно для RBM3. Наименьшее чуть ниже 20 кДа отражает правильный размер RBM3 (предсказанная молекулярная масса RBM3 составляет 17 кДа). Происхождение двух других групп остается предстоит исследовать. Co-иммунопреципитации эксперименты с RBM3 как белка приманки показали, что NF90-RBM3 взаимодей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько преимуществ, а также недостатки обоих методов. Будучи относительно новой технологии, очевидное преимущество близости лигирования анализа является возможность выяснить белок-белковых взаимодействий на уровне одной клетки, а не партии разнородных клеток. Изображения с высоким разрешением и величиной (например , с помощью конфокальной микроскопии) обеспечивают возможность количественной оценки путем подсчета одиночных флуоресцирующих пятен. В отличие от этого, обычный сочетание техники совместно имм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Швейцарским национальным научным фондом (SNSF, 31003A_163305).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированный орел Дульбекко s Среда (DMEM)SigmaD6429Высокий уровень глюкозы
4,500 мг/л
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Пенициллин-стрептомицин (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Ядерные и цитоплазматические экстракционные реагентыThermo Fisher Scientific78833
1,4-дитиотреитол (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) антителоBD Transduction Laboratories612154использовать 1:1,000 для WB и 1:100 для ICC/PLA
RBM3 антителоProteinTech14363-1-APиспользовать 1:1,000 для WB и 1:100 для ICC/PLA
Lamin A/C антителоCell Signaling Technology#2032используйте 1:1,000 для WB 
антитело против GAPDHAbcamab8245используйте 1:1,000 для WB 
нормальный кролик IgGSanta Cruzsc-2027
против кролика IgG, HRP-связанные вторичные антителаТехнология клеточной сигнализации#7074используйте 1:5,000 для WB 
вторичное антитело против мышиного HRPCarl Roth4759.1используйте 1:5,000 для WB 
Clarity Western ECL Blotting SubstrateBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Буфер для образцов (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0,2 PVDF мембранаGE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture SlideCorning BioCoat354632
параформальдегидом (PFA)SigmaP6148
Нормальная козья сыворотка (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
Козий антимышиный IgG (H+L антитело), Alexa Fluor 488 конъюгатThermo Fisher ScientificA-11001
козий антикроличий IgG (H+L антитело), Alexa Fluor 568 конъюгатThermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA зонд Anti-mouse PLUSSigma DUO92001
Дуолинк ПЛА  зонд Anti-rabbit MINUSSigmaDUO92005
Duolink Детектирующие реагентыRed SigmaDUO92008
Duolink Промывочные буферы FluorescenceSigmaDUO82049
Duolink Монтажная среда с DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
МикроскопOlympusAX-70
ПЗС-камераSPOTInsight 2МП Firewire
Рентгеновская пленкаFujifilmSuper RX
Машина для обработки пленкиFujifilmFPM-100A

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEK293NF90 RBM3

Похожие статьи