Мы описываем метод сортировки одиночных клеток млекопитающих и количественной оценки экспрессии до 96 целевых генов, представляющих интерес в каждой клетке. Этот метод включает в себя использование внутренних стандартов количественной ПЦР для оценки абсолютного количества транскриптов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Измерения экспрессии генов в объемных популяциях клеток могут скрыть значительную транскриптомную изменчивость отдельных клеток в этих популяциях. Измерения экспрессии генов отдельных клеток могут помочь оценить роль шума в экспрессии генов, выявить корреляции в экспрессии пар генов и выявить субпопуляции клеток, которые по-разному реагируют на стимул. В данной работе мы описываем процедуру измерения экспрессии до 96 генов в одиночных клетках млекопитающих, выделенных из популяции, растущей в культуре тканей. Клетки сортируются в буфер для лизиса с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS), а представляющие интерес виды мРНК подвергаются обратной транскрипции и амплификации. Затем экспрессия генов измеряется с помощью микрофлюидного ПЦР-аппарата в реальном времени, который выполняет до 96 количественных ПЦР-анализов на 96 образцах одновременно. Мы также описываем создание и использование стандартов ампликонов ПЦР, чтобы можно было оценить абсолютное число каждого транскрипта. По сравнению с другими методами измерения экспрессии генов в одиночных клетках, этот подход позволяет количественно определять более отчетливые транскрипты, чем РНК FISH, при меньших затратах, чем RNA-Seq.
Введение
Отдельные клетки в популяции могут показать сильно различающиеся ответы на единой физиологической стимул 1, 2, 3, 4. Генетическое изменение клеток в популяции является одним механизмом для этого разнообразия ответов, но есть также несколько не-генетические факторы, которые могут увеличить изменчивость реакций, даже в клональной популяции клеток. Например, уровни отдельных белков и других важных сигнальных молекул могут изменяться на основе ячейки за ячейкой, что приводит к изменению в последующих профилей экспрессии генов. Кроме того, актив....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Предварительная подготовка
- Выберите до 96 генов, представляющих интерес, экспрессия которых будет измеряться.
Примечание: По крайней мере, один из этих генов должно быть "ген домашнего хозяйства", такие как ACTB или GAPDH, которые, как известно, выражается в относительно высоком и постоянном уровне в условиях, используемых в эксперименте. Этот ген будет использоваться для идентификации положительно отсортированные скважин (шаг 8.1) и усиленных образцов (шаг 10.1).
Примечание: В примере эксперимента, хорошо охарактеризован, прямой мишенью р53 с помощью множества известных функций 11, 14
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общий обзор протокола показан на рисунке 1, в том числе шагов для лечения клеток, выделения отдельных клеток с помощью FACS, генерация и предварительной амплификации кДНК библиотек из одноклеточных лизатов, подтверждение библиотек кДНК одноклеточных в отсортированные скважин, а также измерение экспрессии гена КПЦР.
При подготовке к изоляции одноклеточного и анализа экспрессии генов, необходимо сначала определи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представили способ выделения отдельных клеток млекопитающих из популяции адгезивных клеток, выращенных в культуре, и будут анализироваться экспрессию приблизительно 96 генов в каждой клетке. Хорошая подготовка заранее имеет решающее значение для этого метода хорошо работать. В частности, проектирование и тестирование пар праймеров, специфичных для транскриптов, представляющих интерес (шаги 1.2-1.3) отнимают много времени, но важные шаги, как праймеры определяют качество измерений одноклеточных. После того, как надежн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить В. Капур в CCR ETIB проточной цитометрии Ядро для ее помощи в выполнении сортировки клеток во время разработки этого протокола. Мы также благодарим М. Raffeld и блок CCR LP молекулярной диагностики и J. Zhu и НИСЛК секвенирование ДНК и геномики Сердечник за помощь в выполнении КПЦР в процессе разработки этого протокола. Это исследование было поддержано очный программы НИЗ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости с ингибитором РНКазы | ThermoFisher | 4374966 | |
| высокоточной ДНК-полимеразой Phusion | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT Высокочувствительный набор для анализа | дцДНКThermoFisher | Q33120 | |
| Микроцентрифужные пробирки с низкой адгезией 2,0 мл | США Scientific | 1420-2600 | |
| Суспензия ДНК | Буфер Teknova | T0221 | |
| Axygen 0,2 мл Maxymum Recovery Тонкостенные ПЦР-пробирки | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Набор загрузочных реагентов для анализа | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная (США) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Антибиотик-антимикотический раствор | Corning | 30-004-CI | |
| неокарциностатин | Sigma | N9162 | |
| ЭЛИМИНАЗА | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli ДНК | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Герметизирующая пленка, стерильная | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0,05% | GE Здравоохранение Медико-биологические науки | SH30236,01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40 & микро; m Клеточный фильтр | Corning | 352340 | |
| Экзонуклеаза I | Новая Англия BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix с низким содержанием ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC для экспрессии генов (микрофлюидный чип для количественной ПЦР) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (загрузочная машина) | Fluidigm | ||
| BioMark или BioMark HD (микрофлюидная машина для количественной ПЦР) | Fluidigm | ||
| Программное обеспечение Fluidigm | |||
| MATLAB | MathWorks |
Ссылки
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
