Методическая статья

Человеческие клетки легких Дендритные: Пространственное распределение и фенотипической идентификации в Эндобронхиальная Биопсию Использование иммуногистохимии и проточной цитометрии

DOI:

10.3791/55222

⸱

20 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Резидентные в легких иммунные клетки, включая дендритные клетки (ДК) у человека, имеют решающее значение для защиты от ингаляционных патогенов и аллергенов. Однако из-за нехватки легочной ткани человека исследования ограничены. В данной работе представлены протоколы обработки эндобронхиальной биопсии слизистой оболочки человека для изучения ДК легких с использованием иммуногистохимии и проточной цитометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легкие постоянно подвергаются воздействию внешней среды, которая, помимо безвредных частиц, также содержит болезнетворные микроорганизмы, аллергены и токсины. Чтобы поддерживать толерантность или вызывать иммунный ответ, иммунная система должна надлежащим образом обрабатывать вдыхаемые антигены. Дендритные клетки легких (ДК) играют важную роль в поддержании хрупкого баланса для инициирования иммунитета, когда это необходимо, не вызывая сопутствующего повреждения легких из-за чрезмерной воспалительной реакции. В то время как существует подробное понимание фенотипа и функции иммунных клеток, таких как ДК в крови человека, знания об этих клетках в менее доступных тканях, таких как легкие, гораздо более ограничены, поскольку исследования образцов легочной ткани человека, особенно здоровых людей, скудны. В данной работе представлена стратегия создания детальной пространственной и фенотипической характеристики резидентных ДК легочной ткани у здоровых людей, которым проводится бронхоскопия для отбора проб эндобронхиальной биопсии. У каждого человека может быть взято несколько небольших биопсий, которые впоследствии могут быть введены для ультратонкого среза или ферментативно разложены для расширенного проточного цитометрического анализа. Изложенные протоколы были оптимизированы для получения максимальной информации из небольших образцов тканей, которые в стационарных условиях содержат только низкую частоту ДК. В то время как настоящая работа сосредоточена на ДК, описанные методы могут быть непосредственно расширены за счет включения других (иммунных) клеток, представляющих интерес, обнаруженных в слизистой ткани легких. Кроме того, протоколы также непосредственно применимы к образцам, полученным от пациентов, страдающих легочными заболеваниями, для которых бронхоскопия является частью установления диагноза, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), саркоидоз или рак легких.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легкие находятся в постоянном контакте с внешней средой, и высоко подвергают воздействию как безвредные частиц и микробов со способностью вызывать заболевания. Поэтому крайне важно для иммунной системы, чтобы смонтировать сильные иммунные ответы против вторгшихся патогенов, но в равной степени важно для поддержания толерантности к вдыхаемых антигенов, которые не вызывают заболевания. Для обеспечения мощного иммунного надзора, дыхательной системы выстлана сети иммунных клеток, в том числе дендритные клетки (ДК). Контроллеры домена являются профессиональными антиген-представляющими клетками с уникальной способностью активировать наивные Т-клетки. В легких человека, РС - резиденты сталкиваются с антигеном , а затем обработать и транспортировать его в легких осушение лимфатических узлов для представления и активации Т - клеток , 1, 2, 3.

В иммунной системе человека, РС можно разделить на несколько подмножеств, с DistinКТ , но пересекающиеся функции: CD1c + и CD141 + миелоидных ДК (Главгосслужбы) и CD123 + плазмоцитов контроллеры домена (PDCs) 4, 5. В то время как самые подробные знания о человеческом ГЦ проистекает из исследований в крови, теперь очевидно , что человеческие легкие также питают редкие популяции DC подмножеств с Т-клеточным стимулирующим емкостью 6, 7, 8, 9. Тем не менее, аккумулирующие данные показывают , что иммунные клетки, в том числе контроллеры домена, различаются по частоте, фенотип, и функции в зависимости от их анатомического расположения 10. Таким образом, важно, чтобы изучить иммунные клетки из соответствующей ткани, чтобы понять их вклад в местный иммунитет и толерантности. Взятые вместе, это подчеркивает необходимость изучения легких резидентные РС при решении заболеваний легких, несмотря на контроллеры домена крови быть более доступными и доступными в людях.

Первые работы, изучающие легочные резидентные РС в организме человека в основном полагались на морфологии и экспрессии отдельных маркеров, таких как HLA-DR и CD11c, в срезах ткани с помощью иммуногистохимии 11, 12, 13. В противоположность этому, более поздние исследования, как правило, полагаются на проточной цитометрии анализа для изучения различных подмножеств иммунных клеток. Однако, так как трудно найти хотя бы одну клеточной поверхности маркер, который однозначно идентифицирует определенное подмножество постоянного тока, потенциальное ограничение исследований применения только четыре цвета проточной цитометрии является риск в том числе клеточных популяций с аналогичными фенотипических маркеров в качестве контроллеров домена. Например, CD11c экспрессируется на всех миелоидных ДК и подавляющее большинство моноцитов. С другой стороны, в исследованиях применения более совершенных проточная цитометрия панелей, незлокачественный легочной ткани от хирургических резекций пациентов, как правило, используютсяXref "> 10, 14, 15, 16, хотя остается неясным , являются ли эти редкие популяции действительно представительными ДКБ , присутствующих в здоровых субъектов. В целом, исследования ограничены во многом связано с тем , что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает.

Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, эта работа описывает, как выполнить детальный анализ пространственного распределения и фенотипической идентификации контроллеров домена в слизистой оболочке эндобронхиальные биопсий, полученных у здоровых добровольцев, которые подвергаются бронхоскопию. Несколько небольших биопсий могут быть получены от каждого отдельного человека и впоследствии могут быть внедрены для секционирования и анализ с помощью иммуногистохимии или ферментативно переваривается для расширенного анализа проточной цитометрии. Использование легочной ткани в виде эндобронхиальные биопсий из bronchoscopies дает то преимущество, что позволило выполнить стУды на здоровых добровольцах, в отличие от открытой хирургии легких, что, по понятным причинам, ограничивается пациентами, которые требуют торакальной хирургии. Кроме того, ткань, которая оцифровывается во время бронхоскопии от здоровых добровольцев является физиологически нормальным, в отличие от не-пораженный участок легочной ткани у пациентов с легочным заболеванием. С другой стороны, биопсий невелики, и количество клеток, извлекаемых, даже при объединении нескольких биопсий, ограничивает тип анализов, которые могут быть выполнены.

Хотя настоящая работа сосредоточена на контроллерах, описанные способы могут быть непосредственно расширен за счет включения других (иммунные) клетки, представляющие интерес, которые находятся в тканях человека через слизистую оболочку легких. Кроме того, протоколы также непосредственно применимы к образцам, полученным от пациентов, страдающих легочными заболеваниями, где бронхоскопии является частью установления диагноза, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), саркоидоз, или рак легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Данное исследование было одобрено областным советом этической экспертизы в Умео, Швеция.

1. бронхоскопия для отбора проб Эндобронхиальная биопсий человека субъектов

  1. Получить информированное согласие от всех участников.
  2. Рассматривать предметы с оральной мидазолама (4-8 мг) и внутривенного гликопиррония (0.2-04 мг) за 30 мин до бронхоскопии. Применение местной анестезией с лидокаином в гортани и бронхах. Пусть предмет полоскание с ~ 3 мл лидокаина 4% и применяют 3 мл к основанию языка и в гортань через гортань шприц. Оптимизация под местной анестезией с 8-10 доз лидокаина спрея. Выполните этот шаг с темой заседания.
  3. Вставьте гибкий бронхоскоп видео через рот с помощью пластмассового мундштука с субъектом в положении лежа на спине. С помощью специального назначения спрей катетер для завершения местной анестезией дистальной трахеи и бронхов через бронхоскоп. При этом используют дозу приблизительно5-10 мл лидокаина 2%.
  4. Возьмите 6-9 эндобронхиальных слизистых оболочек биопсию из основного киля и основные бронхиальных подразделений с использованием Фенестрированные щипцов (Рисунок 1). После бронхоскопии и перед выходом из больницы, чтобы объект съемки покоя в течение 2-4 ч и обеспечить его / ее с легкой закуской.

2. Вложение биопсий в гликоле метилакрилата (ГМА) Смола

Примечание: Протокол иммунное GMA первоначально была разработана в Университете Саутгемптона, Гистохимия Research Unit 17.

  1. Фиксация: Для иммуногистохимии, удалите биопсий пинцетом и поместить их непосредственно в стеклянные пробирки, содержащие 3 мл обезвоженного ингибиторов ацетона и протеазы охлажденного льдом (фенилметилсульфонилфторид (35 мг / 100 мл ацетона) и иодацетамид (370 мг / 100 мл ацетона )). Закрепить ткань в течение ночи при -20 ° С (рисунок 2).
    Примечание: Следующие шаги должны быть PERFOrmed в вытяжном шкафу с соответствующими нитриловые перчатки. Комплект вложение содержит компоненты, которые могут вызвать реакцию сенсибилизации, раздражение, и / или аллергический кожи. Все отходы должны быть утилизированы как опасные отходы.
  2. Обезвоживание: удаления ацетона с ингибиторами и заменить свежим обезвоженного ацетона (без ингибиторов) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Удалите ацетон и заменить его метилбензоатом в течение 15 мин.
  3. Проникновение: Подготовка обработки раствора 5% -ного раствора метилбензоат в гликоль метакрилата мономера; 10 мл достаточно для одного флакона. Используя пластиковые пипетки Пастера, отсос от раствора метил бензоат и заменить с 3 мл раствора для обработки. Инкубацию биопсий и избытка раствора для обработки при 4 ° С в течение 2 ч; Пипетки Пастера может быть использован для всех последующих изменений решения, включая встраивание решение.
  4. Обмен на это решение для обработки через каждые 2 ч (3x 2 ч инкубациями), так что общее время инфильтрации биоpsies в растворе для обработки составляет по меньшей мере 6 ч. Вставьте бумажные этикетки в верхней части вложения капсулы идентифицировать биопсию.
  5. Готовят вложение раствора 75 мг перекиси бензоила в 10 мл этиленгликоля метакрилата мономера. Добавить 0,25 мл N, N - диметиланилин поли (этиленоксида) (ускоритель) к раствору вложения , чтобы начать реакцию полимеризации. Удалите систему обработки и поместите одну биопсию в соответствующую капсулу вложения с помощью щипцов.
  6. Медленно заполнить вложение капсулу в верхней части с вложением раствора и закройте крышку. Избегайте нарушения биопсию и создания больших пузырьков воздуха. Инкубируйте капсулы при температуре 4 ° С до тех пор, пока смола полностью полимеризуется.
  7. Хранить встроенные биопсий при -20 ° С в 50 мл пробирку, содержащую приблизительно 5 г силикагеля.

3. Секционирование ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию

  1. Микроскоп слайд-покрытие: Вымойте стекла микроскопа вПосудомоечная машина на обычном цикле. Накройте слайды и дайте им высохнуть на воздухе.
  2. Готовят раствор для нанесения покрытия из 10% поли-L-лизина (ФАПЧ) в дистиллированной воде. Погрузите слайды в растворе для нанесения покрытия в течение 5 минут, а затем дайте им высохнуть на воздухе. Хранить в сухом месте слайды ФАПЧ покрытием в оригинальных коробках.
  3. Промыть листового стекла полоски с 0,1% Tween 20 в дистиллированной воде. Промыть стекла с 70% -ным этанолом и насухо бумажным полотенцем. Разрежьте стеклянные ножи из стеклянной полосы с использованием ножа производителя. Храните ножи в контейнере, который предотвращает движение, чтобы гарантировать, что передний край не повреждены или поцарапан.
  4. Биопсия обрезки: Поместите капсулу биопсии в капсулу сплиттер и вырубить каждую сторону с использованием углеродистой стали одной кромки лезвия. Удалите ГМА Встраиваемый биопсию и поместить его твердо в тисках. Обрезают избыток ГМА из вокруг биопсии с использованием стального лезвия.
  5. GMA секционирования.
    1. Готовят 0,05% раствор аммиака с дистиллированной водой. Поместите стеклянный нож и биопсию гое микротома. Тщательно выровняйте блок биопсии с лезвием путем регулировки держателя ножа и угла блока биопсии, так что лезвие лежит плоско к поверхности блока.
    2. Вырезать толстые секции 2 мкм с использованием микротома на медленной скорости резания и использовать пинцет для передачи и всплывают из секций на воде аммиака. Поплавок секции на 45-90 сек, что позволяет нежную извлечение антигена и раскладывания секции.
    3. Возьмите секции с предметного стекла микроскопа. Проверьте гистологию биопсии, быстро окрашивания толуидиновым синим.
    4. Высушить слайды на горячей пластине набора до 50 ° С и применять 500 мкл фильтруется толуидиновым синим красителем в секцию с помощью пластиковой пипетки Пастера. Подогреть раздел на горячей плите, пока зеленое кольцо не начнет появляться на краю пятна, а затем смыть водой.
    5. С помощью светового микроскопа, проверьте гистологию биопсии. Разделы, используемые для иммуногистохимии должны содержать хорошие участки неповрежденной листовой пластинкиPropria и эпителий, с наименьшим количеством желез и как мало гладких мышц, насколько это возможно.
    6. Как и в разделе 3.4.2, вырезать участки, которые имеют хорошую гистологию и забрать их с ФАПЧ покрытием микроскопа для иммуногистохимического окрашивания. Вырезать по меньшей мере, две секции из каждой биопсии для анализа. Сухие скользит по меньшей мере, 1 ч. После сушки, секции могут быть завернуты в фольгу и хранили при -20 ° С в течение до 2-х недель, или они могут быть немедленно иммуноокрашиванию.

4. Иммуногистохимическое Окрашивание ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию

Примечание: Азид натрия является токсичным. Готовят 0,1% раствор азида натрия в вытяжном шкафу и вдали от кислот. При контакте с кислотами выделяет токсичный газ.

  1. Нарисуйте вокруг участков с использованием алмазным пером и организовать слайдов на окрашивании стойку.
  2. Выполните пероксидазы блок. Приготовьте пероксидаза блок раствор 0,3% перекиси водорода в 0,1% растворе азида натрия. Applу 1 мл блока пероксидазы к разделам и инкубировать в течение 30 мин.
  3. Приготовьте промывочный раствор 0,05 М Трис-буферном солевом растворе (TBS), рН 7,6. Вымойте слайды в TBS, 3x 5 мин.
  4. Готовят 1% раствор БСА блока в DMEM. Сделайте это заранее и в больших объемах, аликвоты и заморозить его до тех пор, пока это необходимо. Слить слайды и инкубировать секций в блоке растворе в течение 30 мин, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Если неспецифическое связывание все еще имеет место, включают в себя 30-минутной инкубации шаг с 5% блок сыворотки из того же вида в качестве второго антитела.
  5. Развести первичных антител (CD45 или CD1a) в TBS до нужной концентрации (CD45, разбавленного в соотношении 1: 1000; CD1a разводили в соотношении 1: 1,00) и применить его к слайдам. Покровное секций и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
  6. Вымойте слайды в TBS три раза. Развести биотинилированного вторичного антитела (направленное против первичных вида хозяина антител, в данном случае кролика против мышиного F (аb '2)) в TBS до нужной концентрации (1:300 разведение) и применить его к слайдам. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  7. Приготовьте стрептавидин биотин-пероксидаза сложный, по крайней мере за 30 минут до использования. Убедитесь в том, что есть достаточно, чтобы охватить все слайды. Вымойте слайды в TBS три раза. Нанесите раствор на слайдах и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  8. Вымойте слайды в TBS три раза. Приготовьте 3-амино-9-ethylcarbazole (AEC) раствора субстрата пероксидазы (сделано в соответствии с инструкциями завода-изготовителя). Применить его к слайдам и инкубировать в течение 20-30 мин или до желаемой интенсивности пятна развивается.
  9. Промыть слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин. Контрастное секции раствором гематоксилином Майера фильтруется в течение 2 мин. Вымойте слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
  10. Слить слайды и охватывают участки с постоянной водной монтажной среды. Высушить слайды при температуре 80 ° С в сушильной печи. Разрешить слайды остыть, а затем установить их с DPX и поместите покровное.

5. StAining Анализ

  1. Проанализировать секции при 40-кратном увеличении с помощью светового микроскопа с смонтированной камерой, подключенной к компьютеру.
    Примечание: Для получения клеточного анализа, граф положительно окрашенных, ядросодержащих клеток в бронхиальном пластинке слизистой и неповрежденной эпителием, за исключением участков гладких мышц, желез, крупных кровеносных сосудов, а также несовпадением или поврежденной ткани.
  2. Среднее значение на основании количества клеток и корректировать среднее число клеток в области собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия. Площадь собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия можно рассчитать с помощью программы анализа изображений.

6. ферментативным расщеплением Эндобронхиальная Биопсию

  1. Стиральные биопсий: С помощью стерильного пинцета, место интактные биопсий в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл Хенкса солевом буферном растворе (HBSS) (рисунок 3). Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту. Передача биопсий в стерильную DМОГ декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS.
  2. Срыв мокроту с DTT: Заменить HBSS в пробирку с 10 мл HBSS, содержащем 5 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT). Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
  3. Vortex трубку осторожно в течение 15 сек. Перенесите биопсий на стерильную блюдо декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS и DTT.
  4. Перенос биопсий в культуральную среду: Заменить HBSS и DTT в пробирку с 10 мл среды RPMI 1640 культуральной среды. Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
  5. Переваривание биопсию с коллагеназой и ДНКазой.
    1. Приготовьте переваривания раствор коллагеназы II (0,25 мг / мл) и ДНКазы (0,2 мг / мл) в предварительно нагретую RPMI, содержащего 1 М раствора HEPES. Добавить 500 мкл раствора сбраживания на лунку в культе ткани 48-луночногоЮр пластины.
    2. Поместите 1 биопсию на лунку в пищеварении растворе. Инкубируют планшет на качалке платформу в течение 60 мин при 37 ° C при 220 оборотах в минуту. Пипетка вверх и вниз, после того, как 30 мин до повторного диспергирования биопсий, и через 60 мин, чтобы полностью детализировать ткани.
  6. Подготовка одноклеточных суспензий.
    1. Бассейн вместе переваренные биопсий лунки в 50 мл пробирку, пропуская его через сито 40 клеток мкм. Собрать оставшиеся клетки путем промывки лунок с охлажденным льдом буфером FACS (фосфатный буферный солевой раствор (PBS), содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки).
    2. Сожмите оставшиеся ткани на ситечко клеток с использованием задней части плунжера шприца. Центрифуга переваренные клетки при 400 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера FACS. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра и трипановым синим пятном для оценки жизнеспособности клеток.

7. Flow Cytometric Анализ одиночных клеток эндобронхиальных Биопсию после ферментативного переваривания

  1. Ресуспендируют осадок клеток приблизительно 1 × 10 6 клеток в 200 мкл буфера FACS.
  2. Добавьте жизнеспособность клеток краситель для исключения мертвой ячейки в соответствии с протоколом производителя.
  3. Добавьте 5 мкл блокирующего реагента FcR и инкубировать в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  4. Добавить клеточной поверхности антитела против CD45 (2 мкл), линии (CD3, CD20, CD56, CD66abce и CD14, 2 мкл каждого), CD16 (0,5 мкл), HLA-DR (3 мкл), CD11c (5 мкл), CD123 (5 мкл), CD1c (3 мкл) и CD103 (2 мкл) и инкубировали в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Более подробная информация о антител можно найти в разделе методов, но титруют и оптимизации антител к точному проточного цитометра в использовании. Смыть избыток антител с PBS в течение 5 мин при 400 х г. Приобретать образцы свежей на проточном цитометре или фиксации клеток в 1% параформальдегидом до поздней acquisitиона.
  5. Идентификация человека контроллеры домена в биопсий легких с использованием проточной цитометрии анализа 18 (рисунок 4).
    Примечание: С помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, иммунные клетки отличаются от других легочных клеток путем стробирования на CD45. Мертвые клетки могут быть исключены как клетки, которые являются положительными для LIVE / DEAD красителя. Из всех живых CD45 + клеток, линии дифференцировки клеток (В - клетки, Т - клетки, NK - клетки, нейтрофилы и моноциты) могут быть исключены с помощью коктейль из антител против CD20, CD3, CD56, CD14, CD66abce и CD16 в одном канале. После этого, HLA-DR + клетки позволит идентифицировать человека всех контроллеров домена. MDCs можно отличить от контроллерах PDC на основе экспрессии CD11c или отсутствие CD11c, соответственно. MDCs можно дополнительно разделить на CD1c + MDCs или CD141 +.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, характеризующие дыхательные иммунные клетки человеческой ткани-резидентов, включая контроллеры домена, ограничены, в основном из-за того, что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает. При этом, менее инвазивный метод получения ткани легкого от эндобронхиальные биопсий (EBB) здоровых добровольцев и разработанных протоколов для изучения иммунных клеток в ткани с помощью иммуногистохимии или проточной цитометрии описаны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается, как создавать подробные пространственные и фенотипическую характеристику легочных тканей РС-резидентов у здоровых людей с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии на эндобронхиальные слизистых оболочек биопсий, собранных во время бронхоскопии. В следующих пунктах критические шаги в протоколе подробно обсуждаются.

Критические шаги с Протоколом

Секционирование и иммуногистохимия: Очень важно, чтобы держать блоки биопсии при -20 ° C,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить волонтеров, которые внесли свой вклад клинический материал для исследования. Мы также признательны сотрудникам кафедры общественного здравоохранения и клинической медицины, Отдел медицины / респираторной медицины, университетской больницы, Умео (Norrlands universitetssjukhus) для сбора всех клинического материала.

Эта работа была выполнена при поддержке грантов для AS-S от Шведского исследовательского совета, шведского фонда Heart-Lung, Фонд шведского стратегических исследований и Каролинского института.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160OlympusBF1T160
Источник света OlympusExera CV-160
Фенестрированные щипцыOlympusFB21CИспользуется для взятия биопсии
Bite BlockConmed142920 мм x 27 мм
Глюкоза 25% 500 мл внутривенно
Гликопиррония бромид 0,2 мг/млвнутривенно. Предотвращает секрецию слизи и слюны
Mixt. Мидазолам 1 мг/мл вМожно использовать для дополнительного расслабления
Лидокаин, 40 мг/млПероральное и горло-ввод
горла 100 мг/мл спрейВводится в заднюю часть горла
Лидокаин 20 мг/мл спрейВводится через бронхоскоп в дыхательные пути
GMA обработка и встраивание
Стеклянные флаконы5 мл
АцетонSigma-Aldrich32201-1L
Молекулярные сита, 4 ÅAlfa Aesar88120гранулы диаметром 3-4 мм
ФенилметилсульфонилфторидSigma-AldrichP-76260,035 г/100 мл ацетон
ЙодоацетамидSigma-AldrichI-61250,37 г/100 мл ацетон
Полиэтилен-плоский  Капсулы для встраивания TAAB TAABlaboratoriesC094500x 8 мм диаметр, полиэтилен, капсулы с плоским дном
Держатель капсулTAAB laboratoriesC054Вмещает 25 капсул по 8 мм
JB-4 Набор для встраивания GMAPolysciences00226Содержит раствор JB-4 A (0026A-800), JB-4 раствор B (0026B-3.8), пероксид бензоила (02618-12)
МетилбензоатSigma-Aldrich27614-1L
Силикагель с индикатором влажностиScharlauGE00432,5-6 мм 
GMA sectioning
Стекло микроскопа слайдыThermoFisher Scientific10143562CEFОбрезанные края, матовый конец
Поли-L-лизин растворSigma-AldrichP8920-500mL1:10 для рабочего раствора
Листовые стеклянные полоски для ультрамикротомииAlkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287Wash раствор (0,1% Tween20)
LKB 7800B НайфмейкерLKB
Расщепитель капсулTAAB лабораторииC065
Однолезвийные лезвия из углеродистой сталиTAAB лабораторииB054
Vice Ammonia
, 25%VWR1133.10002 мл в 1 л, 1:500 (0,05%)
MicrotomeLeicaLeica RM 2165
Источник светаLeicaLeica CLS 150 XE
Микроскоп с подставкой с поворотным рычагомLeicaLeica MZ6
GMA ImmunohistochemistryРучка
алмазным наконечникомHistolab5218
Перекись водорода 30% растворAnalaR Normapur23619.264
Азид натрияSigma-AldrichS8032
Tris Roche10708976001
Хлорид натрияVWR химикаты27810.295
Бычий сывороточный альбуминMillipore82-045-2Пробумин BSA диагностического класса
модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Sigma-AldrichD5546
Антитела к человеческому CD45BioLegend304002Мышь моноклональная, клон HI30, изотип IgG1k. Рабочая концентрация 500 нг/мл антитела
Anti-human CD1aAbD SerotechMCA80GAMouse monoclonal, клон NA1/34-HLK, изотип IgG2a. Рабочая концентрация 10 & микро; г/мл
Мышиный моноклональный контроль изотипа IgG1Abcamab27479
Мышиный моноклональный контроль изотипа IgG2aDakoX094301-2
Vectastain ABC Elite стандартный наборVector LabsPK-6100
AEC (3-амино-9-этилкарбазол) пероксидазный субстрат воздушный змейVector LabsSK-4200
Mayers гематоксилинHistoLab01820
Стационарный водный монтаж MediumAbD SerotechBUF058C
Сушильный шкаф
DPX Решение для постоянного монтажа VWR360292F
Световой микроскопLeicaLeica DMLB
Камера для микроскопаLeicaLeica DFC 320
Программное обеспечениедля анализа LeicaLeica Qwin V3
Enzymatic Digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-Aldrich55021C
Дитиотреитол (DTT)Сигма-ОлдричDTT-RO
Коллагеназа IIСигма-ОлдричC6885
ДНКазаСигма-Олдрич10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
Щипцы
Платформа КачалкаИнструменты GrantPMR-30
50 мл конические трубкиFalcon14-432-22
40 &; m клеточный фильтрFalcon352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Salt (PBS)
LIVE/DEAD Aqua фиксируемый набор для окрашивания мертвых клетокLife TechnologiesL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD
CD56 Biolegend318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
CD16Biolegend302026
CD11cBD560369
CD1cMiltenyi130-098-009
CD141Милтеньи130-090-514
CD103Biolegend350212
параформальдегидSigma-AldrichF8775
LSR II Проточный цитометрBDПроточный цитометр
FlowJoFlowJoПрограммное обеспечение для анализа
сутки / Полоскание с 335829 555813

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи