Методическая статья

Количественное определение поведения дрозофилы

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55231

⸱

19 июля 2017 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Williams College

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается масштабируемая индивидуальная методика анализа grooming у Drosophila, которая дает надежные количественные данные для измерения поведения ухода. Метод основан на сравнении различий в накоплении красителя на телах ухоженных и ухоженных животных за определенный период времени.

Аннотация

Drosophila - это сложная многоступенчатая локомоторная программа, которая требует скоординированного движения как передних, так и задних конечностей. Здесь мы представляем протокол анализа grooming и новую конструкцию камеры, которая экономична и масштабируема для небольших или крупномасштабных исследований по уходу за Drosophila . Мухи пылиются по всему телу с помощью блестящей желтой краски и дают время для удаления красителя из их тел внутри камеры. Мухи затем осаждаются в заданном объеме этанола для солюбилизации красителя. Измеряют и регистрируют относительную спектральную абсорбцию образцов красителя-этанола для ухоженных и неопытных животных. Протокол дает количественные данные о накоплении красителя для отдельных мух, которые можно легко усреднить и сравнить по выборкам. Это позволяет экспериментальным проектам легко оценивать способность ухаживать за мутантными исследованиями на животных или с помощью схемных манипуляций. Эта эффективная процедура универсальна и масштабируема. Покажем wOrk-поток протокола и сравнительные данные между животными WT и мутантными животными для Dopamine рецептора Drosophila I типа ( DopR ).

Введение

Уход в Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) - это надежное врожденное поведение, которое включает в себя координацию нескольких независимых моторных программ 1 . Фруктовые мухи очищают свои тела от пыли, микробов и других патогенов, которые могут препятствовать нормальной физиологической функции, такой как зрение и полет, или приводят к значительным иммунным проблемам. При восприятии и реагировании как на механическую 2, так и на иммунную активацию 3 , мухи повторно натирают свои ноги вместе или на целевую область тела, пока они не станут достаточно чистыми, а ходьба прог....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Подготовьте аспиратор для перемещения живой дрозофилы из культурального флакона в камеру для ухода. Аспираторы позволяют переносить сознательных животных в поведенческие камеры для обеспечения того, чтобы анестезия не влияла на последующие поведенческие наблюдения.
    1. Используя ножницы, отрежьте 1,5 фута трубки tygon ID ⅛ ", OD ¼". Нанесите, по крайней мере, 1 дюйм от кончика 1 мл одноразового наконечника микропипетки. Возьмите квадратный кусок сетки размером 1 см (отверстие 0,96 дюйма) над наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ. У большинства кончиков 1mL есть линия градации, где кончик находится в коробке с пакетом,....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ холинга дает количественные данные для оценки характеристик поведения, основанные на относительном остатке накопленной краски, оставшейся на телах мух после установленного времени измерения для ухода (30 мин). Образцы изображений конструкции камеры скольжения и основные этапы анализа показаны на рисунке 1 . Мухи объединяют значительное количество красителя от непосредственного напыления путем встряхивания в присутствии красителя ( рис. 2d, 2е ). П.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ холинга относительно прост, но мы будем предупреждать экспериментаторов, чтобы обратить особое внимание на следующие проблемы. Поддержание плотного уплотнения затягиванием винтов на верхней и нижней пластинах после введения мух и красителей имеет важное значение для воспроизводимых результатов. Блестящий желтый краситель очень тонкий, а свободные суставы позволят потерять краситель с краев камеры. Неравномерность содержания красителя для каждой скважины может легко сбросить количественную оценку, поскольку неравн.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Брайана Шепарда, Тата Удомриттируджа, Аарона Вилли, Руби Фрума, Элиз Питмон и Роуз Хедрин за раннюю работу по тестированию и установлению этой методологии и камерных проектов. Мы благодарим Келли Теллеса и Грэма Бьюкена за чтение и редактирование рукописи. Мы благодарим Эндрю Семса и Джули Симпсон за их новаторскую работу и их советы и поддержку, предлагая использовать Brilliant Yellow Dye (Sigma). Эта работа частично поддерживается благотворительным фондом хирургических и медицинских исследований и образования Мэри Э. Грофф, Научным центром Бронфмана и Программой стипендиатов Хелмана.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Прозрачная трубка из высокогибкого ПВХ TygonMcMaster-Carr5229K54ID 1/8", наружный диаметр 1/4", используется с наконечниками микропипеток и сеткой для создания аспираторов
для рта Наконечники для микропипеток (1 мл и 200 μ L)Genesee Scientific24-165, 24-150R
Нейлоновая сетчатая сетка, 2 x 2.6McMaster-Carr9318T44Используется для изготовления аспираторов камеры груминга и рта
Dumont #5 ЩипцыRoboz Surgical InstrumentRS-5050
Brilliant Yellow DyeSigma-Aldrich201375-25Gмы рекомендуем использовать нитриловые перчатки при работе с этим продуктом
VortexerFisher Scientific12-812набор для "прикосновения"
ЭтанолCarolina Biological Supply86-1282
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиVWR International10025-726
0,65 мл микроцентрифужные пробиркиVWR International20170-293могут быть повторно использованы с последовательными анализами
UV 96-луночный планшетCorning
BioTek Synergy HTX PlatereaderBioTekнеобходимо скачать каталог для доступа к программному
микропланшетов и имидж-сканера Gen5BioTek
Microsoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Инкубатор дрозофилыTritechDT2-CIRC-TK
1/4" акриловый пластикMcMaster-Carr8473K341
8 - 32 гайкиMcMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1" винты с шестигранной крышкойMcMaster-Carr92185A199нижняя пластина должна быть нарезана резьбой для этого размера винт
8 - 32 x 1/2" винт с шестигранной крышкойMcMaster-Carr92185A194вторая пластина сверху должна быть нарезана резьбой
2 - 56 3/8" плоская головка крестообразные винтыMcMaster-Carr91500A088они удерживают две средние пластины вместе
0,175" ID, 1/4" OD, 0,34" алюминиевая трубаMcMaster-Carr92510A044Собственное производство; Указанный продукт имеет примерно одинаковые размеры и должен подойти для винтов размера 8. Они действуют как оболочки для винтов 1 дюйм и устанавливают шестигранный колпачок немного вверх от поверхности верхней пластины
"26014017 обеспечению для чтения http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview

Ссылки

  1. Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
  2. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
  3. Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Brilliant Yellow

Похожие статьи