Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55234

⸱

28 февраля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Biological Sciences, University of the Sciences, 3The Department of Small Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Department of Biology, College of Science, Technology, Engineering, & Mathematics, Eastern Washington University

В этой статье

Краткое содержание

Notch сигнализация — это форма клеточной связи, которая основана на прямом контакте между клетками. Чтобы правильно индуцировать передачу сигналов Notch in vitro, лиганды Notch должны быть представлены клеткам в иммобилизованном состоянии. Этот протокол описывает методы in vitro стимуляции передачи сигналов Notch в предшественниках остеокластов мыши.

Аннотация

Notch сигнализация является ключевым компонентом множества физиологических и патологических процессов. Однако природа передачи сигналов Notch делает исследование in vitro ее различных и иногда противоречивых ролей сложной задачей. Являясь компонентом прямой межклеточной коммуникации как с рецепторами, так и с лигандами, связанными с плазматической мембраной, передача сигналов Notch не может быть активирована in vitro путем простого добавления лигандов в питательные среды, как это возможно при использовании многих других сигнальных путей. Вместо этого лиганды Notch должны быть представлены клеткам в иммобилизованном состоянии.

Вариации методов активации сигналов Notch могут приводить к различным результатам в культивируемых клетках. В частности, у предшественников остеокластов различия в методах стимуляции Notch и культивирования и дифференцировки предшественников остеокластов привели к разногласиям по поводу того, является ли передача сигналов Notch положительным или отрицательным регулятором дифференцировки остеокластов. В то время как более тщательные сравнения дифференцировки остеокластов при различных условиях стимуляции Notch in vitro и генетических моделях в значительной степени разрешили споры относительно передачи сигналов Notch и остеокластов, стандартизированные методы непрерывной и временной стимуляции передачи сигналов Notch в культивируемых клетках могут предотвратить такие расхождения в будущем.

Этот протокол описывает два метода стимуляции передачи сигналов Notch конкретно в культивируемых предшественниках остеокластов мышей, хотя эти методы должны быть применимы к любому типу адгезивных клеток с незначительными корректировками. Первый метод обеспечивает непрерывную стимуляцию передачи сигналов Notch и включает в себя иммобилизацию лиганда Notch на поверхности культуры ткани до посева клеток. Второй, в котором используется лиганд Notch, связанный с шариками агарозы, позволяет временно стимулировать передачу сигналов Notch в клетках, которые уже прикреплены к поверхности культуры. Этот протокол также включает методы обнаружения активации Notch в предшественниках остеокластов, а также репрезентативные транскрипционные маркеры активации сигнализации Notch.

Введение

Сигнализацию Паз путь млекопитающим является гомологичной к тому же пути в дрозофилы и состоит из четырех рецепторов трансмембранный надрезом (Notch1-4) и пять связанных с мембраной лигандов зазубренных (jag1 & JAG2) и дельта-типа (Dll1, 3, & 4) семьи 1. Передача сигналов Notch инициируется , когда рецептор Notch на приемной клетке связана лиганда на передающей ячейки 2. Во время этого транс-активации, лиганд Notch мембраносвязанная производит растягивающее усилие на рецептор Notch мембраной 3, 4. Растягивающая сила связывания лиганда вызывает конформационные изменения рецептора Notch, которые облегчают внеклеточный расщепление рецептора с помощью TNF альфа-превращающего фермента (ТАСЕ) с последующим внутриклеточным событием расщепления, опосредованного пресенилин-содержащего гамма-секретазы комплекса (гамма-секретазы). γ-секретазы освобождает INT Notchracellular домен (NiCd), который транслоцирует в ядро, где он образует транскрипционной активации комплекса с CBF-1-Су (H) -Lag-1 (CSL), вдохновителя-подобный (MAML), и факторы конкретного типа клетки для того чтобы управлять экспрессией генов - мишеней 5.

Механические элементы сигнализации Notch результате активации в необходимости уникальных методов активации пути Notch в пробирке. Растворимые лиганды Notch могут связываться с рецепторами Notch, но не приводят к растягивающих сил, необходимых для высвобождения NICD в то время как в то же самое время, конкурентно ингибировать связывание лигандов Notch клеточно-ассоциированной. Таким образом, добавление растворимых лигандов Notch в культуральной среде может ослабить нормальный Notch сигнализации 6, 7. К счастью, лиганды Notch могут индуцировать высвобождение NICD , если они прикреплены к соответствующим жесткой подложке 5, 8, 9,10. Посев клеток на лиганд-покрытием культуральных субстратах или нанесения лиганд-покрытием бусин в клетки могут одновременно активировать передачу сигналов Notch, и выбор между ними зависит прежде всего от желаемого времени стимуляции Notch. Для немедленного, временного активации сигнализации Паз, как можно было бы желательно во время средней точке функциональной или дифференцировки анализа, лиганд Выемка может быть связан с агарозном бисером, наносимые на культивируемые клетки, и вымываются в любое время. Для получения более устойчивой передачи сигналов Notch с начала периода культуры, культуры тканей пластины могут быть покрыты оболочкой с лигандом до начала посева клеток.

Для целей настоящего протокола, способы осуществляются с помощью мыши предшественников остеокластов, но способы и варианты способов , описанных здесь , применимы к широкому разнообразию типов клеток 6, 11, 12, 13, 14. Остеокластов неизлечимо дифференцированные гемопоэтические клетки , которые построчная оплата ответственны за резорбции костной ткани, и они участвуют в многочисленных нарушениях потери костной массы 15. Таким образом, в пробирке исследования дифференцировки остеокластов из их моноциты / макрофаги-линии дифференцировки предшественников и молекулярных механизмов , контролирующих их функция имеет важное значение для лучшего понимания остеокластов и развития новых костных-регенерирующий терапии. В то время как в настоящее время принято считать , что передача сигналов Notch играет положительную роль в дифференцировке и функции остеокластов, вариации в обоих Notch стимуляции сигнализации и остеокластов культуры и дифференциации предшественника привела к первоначально противоречивые выводы 16, 17, 18, 19. Более тщательное изучение различий в методах и использования генетическихмодели значительно выяснена роль передачи сигналов Notch в остеокластогенеза, но применение стандартизованных стимуляции Notch и культуры методов может предотвратить такие споры в будущих исследованиях сигналов Notch в других типах клеток 20, 21, 22, 23.

Существуют различные методы для культивирования и дифференциации мыши предшественников остеокластов, и, как и с различными методами стимул ции передачи сигнала Notch, лучший способ будет зависеть от экспериментального вопроса. В данном случае наш предпочтительный способ культивирования адгезивных и неадгезированных фракции клеток костного мозга вымывали из мышиных длинных костей будут представлены. Этот метод имеет то преимущество, что он не требует по существу отсутствие специализированного оборудования и продуцирующие клетки, которые применимы к различным методам дифференциации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования с участием позвоночных животных проводилось в соответствии с протоколами, утвержденными в университете Пенсильвании Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Культура Медиа Подготовка

  1. Готовят -МЕМ путем растворения минимально необходимой среды (MEM) порошка и 1,9 г бикарбоната натрия в 900 мл H 2 O и дополнения с 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 мл Тепло- инактивированной фетальной бычьей сыворотки. Стерилизовать с использованием 0,22 мкм полиэфирсульфон (PES) фильтр.
  2. Готовят макрофага среду, дополнив -МЕМ с 35 нг / мл рекомбинантного мыши макрофаг-колониестимулирующий фактор (M-CSF)
  3. Готовят остеокластов среду, дополнив макрофага среду с 100 нг / мл RANKL

2. Пересадка костного мозга Выделение клеток

  1. Заполните один шприц объемом 10 мл с 25⅝ иглой на мышь с 10 мл альфа-MEM.
  2. Эвтаназии мышей через 10 мин облучения CO 2 при скорости потока 1,3 л / мин. Обеспечить смерть животных , следуя CO 2 экспозиции с помощью цервикальной дислокации перед продолжением рассечение.
  3. Используя чистую технику, рассекают и отделят голеней и бедрами. Лечить кожу мыши с 70% -ным этанолом , прежде чем сделать надрез вдоль передней поверхности каждой задней конечности , чтобы выставить берцовой и бедренной костями.
    1. Прорубленный коленного сустава, чтобы освободить дистального конца бедренной кости, и разрезают через бедра как можно ближе к тазу, как это возможно. Удалите бедренную кость и очистить как можно больше мягких тканей, как это возможно. Для того, чтобы удалить большую берцовую кость, прорезать лодыжки и удалить как можно больше мягких тканей, как это возможно.
  4. Удерживая кости с пинцетом и перенесут мозга в 15 мл коническую пробирку с 2,5 мл комнатной температуры α-MEM, комбинируя флеши мозга от одной мыши в одну пробирку.
    Примечание: Успешный вровень мозг изменит окраску тон кость от красного до бежевого.
  5. Разрешить мусора оседают на дно пробирки и переносят надосадочную жидкость в чистую 15 мл коническую трубку Осторожно, чтобы избежать переноса любого мусора.
    Примечание: Некоторые клетки могут также рассчитаться с мусором мозга. Если большее количество ячеек требуется, промывает мозг может быть отфильтрован через клеточный фильтр 70 мкм в чистую 15 мл пробирку.
  6. Центрифуга трубки (с) при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осадить клетки.
  7. Вакуумная аспирация клеточный осадок супернатант и ресуспендируют в 0,5 мл аммоний-хлоридом калия (ACK) лизирующего буфера и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 3 мин, чтобы лизировать красные кровяные клетки.
  8. Добавьте 10 мл PBS непосредственно в качестве АСК-клеточного раствора и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин.
    Примечание: Теперь ранее красный осадок клеток должен быть бежевый.
  9. Вакуумный аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл α-MEM, и пластины в 100 мм тканевой культуры обработанных блюдо с. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С в увлажненнойтканевой культуры инкубатор.
    Примечание: Подсчет клеток не является необходимым для этого шага. В это время, адгезивные клетки из костного мозга будет оседают на поверхность культуры; неадгезивные популяции клеток костного мозга будет оставаться в виде суспензии. MCSF нет в культуральной среде в течение этой начальной инкубации.

3. Обогащение предшественников остеокластов

  1. После ночной инкубации промывок мозга, передачи супернатанта культуры, содержащей неадгезированных клеток в 50 мл коническую трубку.
    Примечание: блюда культуры с адгезивными клетками, которые включают мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга костей, могут быть отброшены или подпитывали свежей -МЕМ, если это необходимо для других экспериментов.
    Примечание: Остеокластов можно дифференцировать непосредственно из этих не прилипшие клетки костного мозга, высевая их в тканевых культур , обработанных блюд при плотности 4 × 10 5 клеток / см 2 в остеокластов среде и освежающий среды через день в течение 5 дней.
  2. Добавьте -МЕМ к неприлипающими клеточного раствора до конечного объема 18 мл и добавляют M-CSF до конечной концентрации 35 нг / мл.
  3. Добавьте 3 мл суспензии клеток каждого до 6 60 мм чашках суспензионной культуры.
  4. Инкубируйте пластины в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур увлажненной. В течение этого времени, М-КСФ стимулирует дифференцировку макрофагов, которые могут прилипать даже без тканевой культуры обработанных поверхностей.
  5. После инкубации в течение ночи, повторно подающие предшественников остеокластов с 3 мл свежей среды макрофагами. Это приведет к удалению, не прилипшие клетки, которые не дифференцируются в макрофаги.
  6. Продолжают предшественников остеокластов культивирования при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 2 -х дней или до культуры достигают примерно 70% сплошности.

4. остеокластов Дифференциация

  1. Промыть предшественников остеокластов с 5 мл PBS и обработать клетки с 1 мл морской происхождения протеолитической / коллагенолитического фермента при комнатной температуре до CELLs может быть смещена путем осторожного постукивания пластины.
    Примечание: предшественники остеокластов могут быть сняты только тогда, когда они культивируют в суспензионных блюд; Предшественники придавать слишком плотно к культуре ткани обработанной поверхности для подъема. Трипсин может активировать предшественников остеокластов и его следует избегать.
  2. Добавляют 4 мл α-MEM в каждую чашку и передачи клеток в 50 мл коническую трубку. Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленных клетки до плотности 5 × 10 4 клеток / мл и добавляют M-CSF до конечной концентрации 35 нг / мл и RANKL до конечной концентрации 100 нг / мл.
  3. Семенной клеток при плотности 2,6 х 10 4 клеток / см 2 в тканевой культуры обработанных пластин и инкубировать при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур увлажненной в течение 2 -х дней. Дифференцировка обычно проводят в 24-луночных планшетах, где 5 х 10 4 клеток высевали в каждую лунку.
  4. Через 2 дня после начала дифференцировки, повторно кормовых клеток путем замены среды с 1 мл свежей osteocпоследняя среда.
    Примечание: остеокластов дифференциация как правило, будет завершена в течение 3-х дней. Полученные в результате остеокластов может быть ловушкой окрашивали для легкой количественной оценки и морфологического анализа.

5. Непрерывная стимуляция Signaling Notch с поверхностным покрытием Jagged1

  1. Приостановка козьего антитела против человеческого Fc-области IgG антитела в PBS при концентрации 10 мкг / мл (1: 1000 разбавление 10 мг / мл стоковый). Добавить антитела решение поверхности культуры при плотности 1,3 мкг / см 2 , и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. В случае 24-луночные планшеты, добавляют 250 мкл (2,5 мкг) в каждую лунку.
  2. Вакуумные аспирата скважин и залить 1 мл PBS. Повторите этот шаг 2 раза.
  3. Приостановка рекомбинантный Jagged1-Fc слитого белка в PBS в концентрации 10 мкг / мл. Добавить раствор Jagged1-FC на покрытых антителами поверхности культурального при плотности 1,3 мкг / см 2 , и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Поверхности культуры покрыты ONL антителY могут быть использованы в качестве контроля.
  4. Вакуумные аспирата скважин и залить 1 мл PBS. Повторите этот шаг 2 раза. Хранить PBS в лунки до тех пор, незадолго до посева клеток, чтобы предотвратить их от высыхания.
  5. Семенной 2,6 х 10 4 предшественников остеокластов / см 2 на поверхности с покрытием. передача сигналов Notch, будет непрерывно стимулировали в течение по крайней мере, 3-х дней.

6. Временная стимуляция Signaling Notch с бисером Jagged1 покрытием

  1. Смешайте следующее в соответствующего размера трубки: 0,5 мкг / см 2 Jagged1-Fc, 21 мкл / см 2 белка G агарозном бусин, и PBS , до конечного объема 1,5 мл. Для того, чтобы подготовить достаточное количество шариков Jagged1 1 лунку 24-луночного планшета, смешайте 1 мкг Jagged1-Fc, 40 мкл белка G агарозном бисером и PBS до 1,5 мл.
  2. Выдержите трубки с вращением на 4 ° C в течение 2 часов.
  3. Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 1 мин для осаждения шариков. Ресуспендируют бусины в 1,5 мл PBS. Повторите эту промывкуеще 2 раза.
  4. Ресуспендируют Jagged1 бусины в 130 мкл см 2 культуральной среды / и применить к культивируемым клеткам.
  5. Инкубируйте клетки с бусинами при 37 ° С и 5% СО 2 в течение требуемого периода. Удалите шарики с несколькими промывками PBS или культуральной среды.
  6. Проверка Notch сигнализации активации с помощью измерения целевых Notch гена транскриптов 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цель этого метода заключается в культуре и стимулировать передачу сигналов Notch в предшественников остеокластов. При правильном культивировании, предшественники остеокластов обладают в основном удлиненную веретенообразную морфологию с гладкой цитоплазмы (рис 1А). Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать иммунологической активации предшественников остеокластов. После активации прекурсоров распространяться и сплющенные с пенистой цитоплазмой (рис 1B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола

Культура и в пробирке дифференциации предшественников остеокластов обеспечивает полезную платформу для исследования молекулярных механизмов остеокластогенеза и идентификации терапевтических мишеней для регенерации костной ткани и сохранения костной массы. При культивировании мыши предшественников остеокластов, наиболее важным элементом является поддержание предшественников в наивном состоянии. Как микрофагоподобных клетки, предшественники остеокласто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Центром заболеваний опорно-двигательного аппарата Университета Пенсильвании (5 P30 AR050950-09), грантом от Фонда AO (S-16-12A), Центром трансляционных исследований опорно-двигательного аппарата Медицинского центра Филадельфии VA и фондом развития исследований отделения интрамуральной ортопедической хирургии. JWA поддерживается стипендией Университета Пенсильвании для постдокторантов в области исследований и преподавания (PENN-PORT), финансируемой премией Национального института общих медицинских наук за институциональные исследования и развитие карьеры (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рекомбинантная мышь M-CSFBiolegend576402Доступно у нескольких поставщиков, тестовая активность перед экспериментами
Рекомбинантная мышь RANKLShenandoah Biotechnology200-04Доступна у нескольких поставщиков, тестовая активность перед экспериментами
Рекомбинантная человеческая Jagged1-FcR& D Systems1277-JG-050Доступно у нескольких поставщиков, тестовая активность перед экспериментами
Протеин G Агарозные шарикиInvivoGengel-agg-2
Козий античеловеческий IgG FcJackson ImmunoResearch109-001-008
Минимальная эссенциальная среда порошокSigma-AldrichM0894
Реагент для диссоциации клеток аккутазыThermoFisherA1110501Используется для поднятия предшественников остеокластов
Набор кислой фосфатазы, лейкоцитов (TRAP)Sigma-Aldrich387A-1KTИспользуется для окрашивания дифференцированных остеокластов

Ссылки

  1. Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
  2. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
  3. Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
  4. Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
  5. Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
  6. Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
  7. Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
  8. Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
  9. Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
  10. Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
  11. Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
  12. Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
  13. LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
  14. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
  15. Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
  16. Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
  17. Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
  18. Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
  19. Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
  20. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45(2012).
  21. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  22. Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
  23. Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Непрерывная стимуляциявременная стимуляцияJagged1-FCагарозные бисериныдифференцировка клетоктранскрипционные маркерыостеокласты мышиклеточная культура
Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.