Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

20 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

В этой статье

Краткое содержание

Продемонстрированы системные и локализованные модели инфекции данио-рерио для вируса гриппа А человека. Используя модель системной инфекции, рыбки данио могут быть использованы для скрининга противовирусных препаратов. Используя модель локализованной инфекции, рыбки данио рерио могут быть использованы для характеристики реакций иммунных клеток хозяина.

Аннотация

Каждый год вспышки сезонного гриппа оказывают глубокое влияние на общества по всему миру. Несмотря на глобальные усилия, грипп остается неразрешимым бременем для здравоохранения. Основной стратегией борьбы с инфекциями является ежегодная вакцинация. У людей, заразившихся гриппом, противовирусные препараты могут смягчить симптомы. Существует явная и неудовлетворенная потребность в разработке альтернативных стратегий борьбы с гриппом. Было создано несколько животных моделей для моделирования взаимодействия хозяина и гриппа. В данной работе описываются протоколы создания моделей рыбок данио-рерио для системной и локализованной инфекции вирусом гриппа А человека (IAV). Используя модель системной инфекции IAV, можно проводить скрининг малых молекул с потенциальной противовирусной активностью. В качестве доказательства принципа описывается протокол, демонстрирующий эффективность противовирусного препарата Занамивир у инфицированных IAV рыбок данио. В нем показано, как фенотипы заболеваний могут быть количественно оценены для оценки относительной эффективности потенциальных противовирусных препаратов у инфицированных IAV рыбок данио. В последние годы возросло понимание критической роли, которую нейтрофилы играют в реакции человека на гриппозную инфекцию. Рыбка данио оказалась незаменимой моделью для изучения биологии нейтрофилов, оказывая непосредственное влияние на медицину человека. Описан протокол генерации локализованной IAV-инфекции в линии рыбок данио Tg(mpx:mCherry) для изучения биологии нейтрофилов в контексте локализованной вирусной инфекции. Рекрутирование нейтрофилов в локализованные очаги инфекции обеспечивает дополнительный количественно измеримый фенотип для оценки экспериментальных манипуляций, которые могут иметь терапевтическое применение. Оба протокола по данио-рерио точно повторяют аспекты инфекции IAV у человека. Модель рыбок данио обладает многочисленными неотъемлемыми преимуществами, включая высокую плодовитость, оптическую прозрачность, податливость к скринингу лекарств и доступность трансгенных линий, в том числе тех, в которых иммунные клетки, такие как нейтрофилы, помечены флуоресцентными белками. Протоколы, описанные здесь, используют эти преимущества и обладают потенциалом для получения критически важной информации о взаимодействии хозяина и IAV, которая в конечном итоге может быть реализована в клинике.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), вирусы гриппа заражают 5-10% взрослых и 20-30% детей ежегодно и вызывает 3-5 миллионов случаев тяжелой болезни и до 500000 смертей в мире 1. Ежегодные прививки против гриппа остаются наилучшим вариантом для предотвращения болезни. Усилия , как Глобальный план действий ВОЗ увеличились сезонного использования вакцины, потенциала для производства вакцин, а также научных исследований и разработок в более мощные стратегии вакцинации с целью снижения заболеваемости и смертности , связанных с сезонными вспышками гриппа 2. Противовирусные препараты , такие как ингибиторы нейраминидазы (например , как занамивир и озелтамивир) доступны в некоторых странах и доказали свою эффективность в уменьшении симптомов, при введении в течение первых 48 часов от начала 3, 4, 5. Несмотря на глобальные усилия, сдерживание сезонного гриппа НУtbreaks остается трудной задачей в это время, так как вирус гриппа антигенный дрейф часто превышает текущие способности адаптироваться к изменяющимся генома вируса 6. Стратегии вакцины, направленные на новые штаммы вируса должны быть разработаны заранее, и иногда оказывается меньше, чем оптимально эффективной из-за непредвиденных изменений в типах штаммов, которые в конечном итоге преобладают в сезон гриппа. По этим причинам, существует явная необходимость разработки альтернативных терапевтических стратегий для сдерживания инфекции и снижения смертности. По достижении лучшего понимания взаимодействия хост-вируса, это может быть возможным разработать новые лекарства против гриппа и адъювантной терапии 7, 8.

Человек-хозяин гриппа А взаимодействие вируса (ИФО) является сложным. Несколько моделей животных заражения человека IAV были разработаны для того, чтобы получить представление о взаимодействии хост-вирусом, ВКЛЮЧАЕТING мышей, морских свинок, крыс хлопка, хомяков, хорьков и макак 9. Обеспечивая важные данные, которые улучшили понимание динамики хост-IAV, каждая модель организм обладает существенными недостатками, которые необходимо учитывать при попытке перевести результаты в медицине человека. Например, у мышей, которые являются наиболее широко используемой моделью, не легко разрабатывать ИФО-индуцированные симптомы инфекции при инфицировании гриппа человека изолирует 9. Это потому , что у мышей не хватает естественный тропизм для человеческого гриппа изоляты , так как мыши эпителиальные клетки экспрессируют альфа-2,3 связей сиаловой кислоты , а не в α-2,6 связей сиаловой кислоты , выраженные на эпителиальных клетках человека 10. Гемагглютинина белки , присутствующие в человеческом IAV изолятов выгодно связывать и входить в клетки - хозяева несущих связи альфа-2,6 сиаловой кислоты через рецептор-опосредованного эндоцитоза 9, 11, 12, 13. Как следствие, в настоящее время принято, что при разработке модели мыши для гриппа человека, необходимо соблюдать осторожность, чтобы пары соответствующих штамм мыши с соответствующим штаммом вируса гриппа с целью достижения фенотипы болезни, которая резюмировать аспекты человеческой болезни. В противоположность этому , эпителиальные клетки в верхних дыхательных путей хорьков обладают альфа-2,6 связей сиаловой кислоты , которые напоминают клетки человека 14. Зараженные хорьков разделяют многие из патологических и клинических особенностей , наблюдаемых в болезни человека, в том числе патогенности и заразности вирусов гриппа человека и птиц 14, 15. Они также высоко поддаются эффективности вакцин испытаний. Тем не менее, модель хорек для человеческого гриппа имеет ряд недостатков, главным образом связанные с их размера и стоимости хозяйства, которые делают приобретение статистически знакосяка данных сложной задачей. Кроме того, хорьки воспроизведенных различия в фармакокинетики, биодоступности и токсичности, которые делают тестирование эффективности трудно. Например, хорьки проявляют токсичность по отношению к М2 ионного канала ингибитора амантадин 16. Таким образом, очевидно, что при выборе модели на животных для изучения вопросов о инфекций Iav человека, важно учитывать его преимущества, присущие и ограничения, а также аспект хост-вирус взаимодействия, который находится под следствием.

Данио, Danio rerio, является животная модель , которая предоставляет уникальные возможности для исследования микробной инфекции, иммунного ответа хозяина, и потенциальные лекарственные терапии 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <вир класс = "Xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Присутствие α-2,6-связанных сиаловых кислот на поверхности клеток в данио предложил его восприимчивость к IAV, что подтвердилось в исследованиях инфекционных и изображаемого в естественных условиях с использованием флуоресцентного штамм репортер IAV 19. В ИФО-инфицированных данио, повышенная экспрессия противовирусных ifnphi1 и MxA транскриптов показал , что врожденный иммунный ответ был стимулируется, и отображаемая ИФО-инфицированной данио, в том числе отека и деструкции ткани патология, была аналогична той , которая наблюдается при инфекциях гриппа человека , Кроме того, IAV противовирусный ингибитор нейраминидазы занамивир ограниченная смертность и снижение вирусной репликации в данио 19.

В этом докладе, протокол для инициирования системыIC IAV инфекции у эмбрионов данио описано. Использование занамивир клинически значимых дозах в качестве доказательства из-принципа, полезность этой модели данио IAV инфекции для скрининга соединений на противовирусную активность проявляется. Кроме того, протокол , для генерации локализованного эпителиальные инфекции Iav в данио плавательном пузыре, орган , который считается анатомически и функционально аналогичны легких млекопитающих 21, 29, 30, 31, описан. Используя эту локализованную модель инфекции Iav, нейтрофилы набор к месту инфекции можно отследить, что позволяет расследование роли нейтрофилов в биологии IAV инфекции и воспаления. Эти данио модели дополняют существующие модели животных инфекций Iav человека и особенно полезны для тестирования небольших молекул и реакций иммунной клетки из-за возможности расширения сtatistical мощность, емкость для умеренной до высокой пропускной способности анализов, а также способности отслеживать поведение иммунных клеток и функции со световой микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все работы должны быть выполнены с использованием уровня биологической безопасности 2 (или BSL2) стандартов, описанных Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и в соответствии с директивами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC). Пожалуйста, посоветуйтесь с соответствующими должностными лицами в целях обеспечения безопасности и соблюдения.

1. рерио Уход и техническое обслуживание

  1. Spawn данио и собрать необходимое количество эмбрионов для экспериментов. При необходимости, массового размножения танков, как те , которые описаны Adatto и др. 32, могут быть использованы для сбора большого количества онтогенетически-ступенчатую эмбрионов.
  2. Разрешить эмбрионов разработать до желаемой стадии развития (48 ч после оплодотворения для системной инфекции IAV [Раздел 3] или 5 дней после оплодотворения для локализованной, плавать инфекции мочевого пузыря [раздел 4]) в глубоких чашках Петри при низкой плотности (< 100 эмбрионов / чашку) при 28 ° С в стерильной яичной воде, содержащей 60 мкг / мл морской соли (например, проточный океан) в дистиллированной воде.
    1. Удалить мертвых эмбрионов с пластиковыми пипец переноса и изменения яичного воды ежедневно для обеспечения оптимального здоровья и развития.

2. Подготовка материалов и реагентов

  1. Подготовьте 4 мг / мл маточного раствора из Tricaine-S (доведения рН до 7,0-7,4) в дистиллированной воде и автоклав. Хранить при температуре 4 ° С.
  2. Вытащите из боросиликатного стекла капилляров с нитями с использованием микропипетки съемник (например , микропипетки Puller со следующими параметрами: значение давления = 100, тепло = 550, тянуть = [нет значения], скорость = 130, время = 110).
    Примечание: Перед обрезки иглы, длина от того, где игла начинает сужаться до кончика иглы будет составлять приблизительно 12-15 мм. Это может варьироваться, однако, на основании предпочтений и применения. Более длинный, более постепенным конусности может быть более предпочтительным, из-за повышенной способности проколоть эмбрион и уменьшенного Р.И.С.К. иглы погнуться или сломаться.
  3. Растопить 2 г агарозы в яйце воды 100 мл с использованием микроволновой печи. Сделайте плиты, на которых выстраиваются и впрыснуть эмбрионов, выливая расплавленную агарозу в глубокие чашки Петри и позволяет ему затвердеть.
  4. Сделать 10 мг / мл запас Занамивир в нуклеазы без воды. Аликвоты и замораживают при -20 ° С.
  5. Растопите 0,5 г агарозы в яичном воды 50 мл с использованием микроволновой печи, чтобы сделать эмбриона монтажа агарозы. Поддержание в водяной бане при 50 ° С до момента использования во время формирования изображения.

3. Системный IAV инфекции (48 ч после оплодотворения)

ВНИМАНИЕ: Все исследования персонал должен проконсультироваться со своими руководителями и врачами относительно вакцинации до начала работы с IAV.

  1. Вручную dechorionate эмбрионов на день эксперимента с использованием # 5 щипцов. Позаботьтесь, чтобы удалить и эвтаназии эмбрионов, которые были ранены в процессе в концентрации 200 мкг / мл раствора Tricaine.
  2. Подготовка Oе IAV для микроинъекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы, которые были показаны для заражения эмбрионов данио являются гриппа A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), гриппа A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), а также флуоресцентные репортер штамм вируса гриппа NS1-GFP 33. Подробная информация о APR8 и X-31, и других штаммов, можно найти в базе данных по гриппу Research
    1. Размножаются штамма NS1-GFP из IAV в куриные эмбрионы , как описано выше 34, 35. Сбор, аликвоты и титровать аллантоисной жидкости, содержащей Iav, и хранят при -80 ° С. Pre-титровали APR8 и X-31 вирусы могут быть приобретены на коммерческой основе.
      1. Непосредственно перед инфекцией, быстро таять аликвоту Iav в перчатке, а затем быстро поставить на лед, чтобы уменьшить потерю титра.
    2. Вирусный разведение
      1. При использовании APR8 или X-31 вирусы, разбавленные до 3,3 × 10 6 яиц инфекционная доза 50% (EID50) / мл в стерильной, ледяной PBS supplemтованный с 0,25% фенола красного (для облегчения визуализации) в колпаке с ламинарным потоком. Одновременно установить контроль, содержащий стерильный PBS с 0,25% фенола красного.
      2. При использовании НС1-GFP штамма 33, разбавляют до ~ 1,5 х 10 2 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на НЛ в стерильной, охлажденным льдом PBS , содержащий 0,25% фенола красного (для облегчения визуализации) в колпаке с ламинарным потоком. Одновременно установить элемент управления, содержащий аллантоисной жидкости из незараженных куриных яиц разбавленных как вируса в стерильной PBS с 0,25% фенола красного.
      3. Поддерживать Iav на льду, пока готов к использованию.
    3. раствор вируса пипеткой в ​​микроинъекции иглы с использованием microloader советы непосредственно перед использованием. Вставьте микроинъекции иглу в соответствующий держатель устройства для инъекций (например , MPPI-3 системы впрыска под давлением).
    4. При просмотре под стереомикроскопа, аккуратно обрезают кончик иглы микроинъекции с острыми, стерилизуют # 5 щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это рекоменDed, что кончик микроинъекции быть обрезано постепенно.
    5. Выжмите педаль системы впрыска под давлением и вводят в каплю микроскопа иммерсионного масла на калибровочный микрометра слайд. Измерьте диаметр капли. Рассчитать объем капли с помощью уравнения, V = 4 / 3πr 3, где V есть объем в NL и R является радиусом в мкм.
      Примечание: Если диаметр капель слишком мал, дополнительное стекло может быть обрезан или настройки давления и сроки могут быть скорректированы. Если диаметр капель слишком велик, параметры давления и времени может быть скорректирована.
    6. Настройка параметров давления и синхронизации инжектора под давлением и / или reclip кончик иглы, пока желаемый объем инъекции не достигается (обычно 1-3 NL). Параметры давления от 20 до 30 фунтов на квадратный дюйм и длительность импульса настройки между 40 и 80 мс типичны. Отрегулируйте обратное давление, так что счетчики капиллярное давление, но не протекает Iav (чистый нулевой давления).
  3. Совместите зародыши для инъекций
    1. Обезболить dechorionated эмбрионов в 200 мкг / мл Tricaine.
    2. После того, как движение прекращается, передача 10-20 эмбрионов в агарозном пластины 2% (полученного в разделе 2.3) с пластиковой пипеткой. Используйте пластиковую пипетку, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    3. Аккуратно выровняйте эмбрионов для микроинъекции с огнем полированные и запечатаны боросиликатного стеклянного капилляра. Использование стереомикроскоп, аккуратно сориентировать эмбрионов , так что канал Кювье или задней кардинальной вены находится в соответствии с микроинъекции иглы (рис 1А).
  4. IAV Микроинъекция
    1. Аккуратно вставьте микроинъекции иглу в канал Кювье или задней кардинальной вены. Выжмите педаль , чтобы придать нужный объем IAV в кровеносную систему эмбриона (рис 1А). Эмбрионы могут быть введены более чем один раз, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: болюсное должен быть заметен в обращение и дистрибьютораделены по всему телу. Если вводимый объем собирает на месте инъекции, удалить эмбрион из эксперимента и эвтаназии.
    2. Инъекции повторяют на различных эмбрионов с контрольного раствора специфической для штамма вируса, выбранного. Для APR8 и X-31, используйте элемент управления, описанный в разделе 3.2.2.1; для NS1-GFP, используйте элемент управления, описанный в разделе 3.2.2.2.
  5. Перенос эмбрионов в меченых чашки Петри, содержащие стерильную воду яйца и место в инкубаторах при температуре 33 ° C.
    Примечание: Зараженные эмбрионы должны быть выращены при температуре 33 ° С, чтобы поддерживать усиленную репликацию вируса. Кроме того, инкубация при 33 ° С более близко имитирует температуру верхних дыхательных путей человека, который находится в тесном контакте с более низкими температурами во внешней среде и где происходят IAV инфекции. Эмбрионы могут акклиматизироваться в широком диапазоне температур 34.

4. Локализованный, плавательным пузырем IAV Инфекция в Tg (MPX: mCherry) Трансгенные данио рерио (5 дней после оплодотворения)

  1. Приготовление IAV для микроинъекции
    1. Развести NS1-GFP штамма и контрольного раствора для инъекций, как описано в разделе 3.2.
    2. Приготовьте иглы, как описано в разделе 2.2.
    3. Совместите Tg (пикс: mCherry) 35 личинок , содержащие завышенные плавательные пузыри , как описано в разделе 3.3 со следующим исключением. Align личинки таким образом , что игла может прокалывать плавательного пузыря , и вирус может быть вложенной в задней части плавательного пузыря, как описано выше 36 (фиг.2А).
  2. IAV Микроинъекция
    1. Аккуратно вставьте микроинъекции иглу в плавательном пузыре и придать желаемый объем (например , 5 NL) в направлении задней части структуры (рис 2А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: болюсное следует собирать в сторону задней и воздушный пузырь плавательный пузырь должен бе смещается вперед. выражение GFP должно начать наблюдаться у 3 ч после инъекции.
    2. Повторные инъекции с контрольного раствора специфической для штамма вируса, выбранного, как описано в разделе 3.4.2.
  3. Передача личинок в чашки Петри, содержащие стерильную воду яйца и место в инкубаторах при температуре 33 ° C.

5. Противовирусные наркологическая

Примечание: Протокол ниже описывает обработку занамивир ранее показанную в Габора и др. 19. Этот протокол может быть изменен, чтобы экранировать другие противовирусные препараты, и имеет потенциал, чтобы быть модифицирован для скрининга нескольких соединений в 96-луночный планшет, формат высокой пропускной способности.

  1. В 3 ч после заражения, заменить яйцо воду NS1-GFP- и контрольно-инфицированных рыб стерильной яичной воде, содержащей 0, 16.7 или 33.3 нг / мл занамивир.
    Примечание: Эти концентрации были выбраны для того, чтобы попытаться воспроизвести физиологические уровни, достигнутые FOllowing введение Занамивир у людей (100, 200 или 600 мг, внутривенно, два раза в день или 10 мг ингаляционных, два раза в день). Концентрации в сыворотке крови у больных человека колебалась от 9,83 до 45,3 нг / мл 36.
  2. В течение 5 дней, изменение яйце воды каждые 12 ч и заменить стерильной яичной водой, содержащей соответствующее количество Занамивир.
  3. Отслеживание хода инфекции.
    1. Обезболить данио в 200 мкг / мл Tricaine. Монитор экспрессии GFP с помощью стерео флуоресцентной микроскопии визуально наблюдать различия в характере инфекции между ИФО-инфицированных и контрольных рыб и среди рыб, погруженного в различных концентрациях препаратов.
    2. Отслеживание заболеваемости и смертности в течение 5 дней.
      1. Запись наблюдения о динамике инфекций, связанных с патологией заболевания, в том числе признаки вялости и признаков отека, различия в пигментации, окуляр и черепно-лицевых деформаций и лордоз. Болезнь патологиикак правило, становится очевидным, в контрольной зараженной рыбы на 24-48 ч после инъекции, в зависимости от количества вируса впрыскиваемого. Собирать изображения 24 ч после инъекции.
      2. Каждые 24 ч в течение 5 дней после заражения, записать число погибших, болезненного и здоровых личинок. Смерть определяется отсутствие различимой сердцебиение. Plot данные по своему усмотрению. Например, участок и данные в виде столбчатой ​​графа с процентами здоровых, болезненном или мертвой рыбы нанесены на оси у и группы обработки по оси х. 19
        Примечание: Смертность может быть забит оценками выживаемости Каплана-Мейера. В зависимости от применения, может быть целесообразным разработать альтернативные подходы к скоринг рыбьего заболеваемости, в том числе матрицы балльной которые могут количественно определить степень заболеваемости, основанные на вышеуказанных патологических особенностей, наблюдаемых.
      3. Проконсультируйтесь с статистиком, чтобы применить соответствующие статистические анализы.

6, Миграция Нейтрофильная

Примечание: Протокол ниже описан способ отслеживания миграции нейтрофилов в плавательном пузыре после локализованы, эпителиальной инфекции IAV. Описанные здесь методы могут быть модифицированы, чтобы проверить воздействие генетических и химических манипуляций. Используя эту технику, можно будет охарактеризовать механизмы, лежащие в основе поведения нейтрофильной во время инфекции IAV.

  1. Монтаж данио рерио для обработки изображений
    1. Обезболить личинок, которые будут отображены в концентрации 200 мкг / мл Tricaine.
    2. Передача индивидуального Tg (MPX: mCherry) личинку , который был заражен NS1-GFP в лунку 24 - луночного, стеклянную нижнюю пластину в небольшой капли яичного воды (~ 50-100 мкл). Повторите с другой ИФО-инфицированного и контрольных рыб.
    3. Медленно добавляют 1% агарозном эмбрион монтажных средств массовой информации для каждого (раздел 2.5) а, следя за тем, чтобы не вводить большие пузыри.
      1. Осторожно отрегулировать положение личинке таким образом, что он установлен на его стороне.Гуди и Генри 37 описывают , как сделать зонды , которые функционируют хорошо в этом приложении с помощью насекомых булавками, которые установлены в боросиликатного стекла капилляров с нитями и superglued на месте.
    4. После агарозном затвердевает, аккуратно заполнить отдельные лунки с яичным водой, содержащей 200 мкг / мл Tricaine.
    5. С помощью конфокальной микроскопии, захват Аз стека серии Светлое и флуоресцентных изображений с использованием объектива 20X сосредоточены на плавательном пузыре.
      1. Установить верхний и нижний пределы так, что они захватывают все визуально наблюдаемую зеленой и красной флуоресценции.
      2. Захват изображения на 2,0 микросекунды / пиксель с шагами, которые ≤ 4 мкм. Увеличение времени на пиксель и уменьшая расстояние между шагами (например , 0,5 - 1,0 мкм) повышает разрешение и качество изображения.
      3. Генерация двухмерного изображения путем слияния слоев.
      4. Сравните количество MPX-mCherry-положительных нейтрофилов настоящее время яп плавательного пузыри ИФО-инфицированного и управления впрыском данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При этом данные , показывающие , как системная инфекция IAV в данио может быть использован для проверки эффективности лекарственного средства (рисунок 1А) предусмотрены. Эмбрионы через 48 часов после оплодотворения инъецируют APR8 (Рисунки 1C, 1F), Х-31 (фигуры 1D, 1G) или NS1-GFP (фигуры 1H-1i) , через проток Кювье , чтобы инициировать вирусной инфекции. Еще одна когорта эмбрионов на 48 ч после оплодотворения вводили , ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы максимизировать выгоды, получаемые от использования мелких животных для моделирования человеческих хозяин-патоген взаимодействия, важно сформулировать вопросы исследования и тестирования гипотез, прописными буквами на преимущества, присущие модельной системы. В качестве модели для заражения человека IAV, то данио имеет ряд сильных сторон, в том числе высокой плодовитостью, оптической прозрачности, аменабельности скрининга лекарственных средств, а также наличие трансгенных линий, которые маркируют иммунны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотят поблагодарить Марка Нилана за уход и обслуживание данио-рерио, а также Меган Брейтбах и Дебору Бушар за распространение NS1-GFP и определение титров IAV. Это исследование было поддержано грантом NIGMS, NIH P20GM103534 и Сельскохозяйственной и лесной экспериментальной станцией штата Мэн (номер публикации 3493).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 мм x 25 мм стерильные одноразовые чашки Петри VWR89107-632
Пипетки для переноса Fisherbrand13-711-7M
Трикаин-С (MS-222)Западный химический
капилляр боросиликатного стекла с нитью Саттер Инструмент BF120-69-10
Пылающий/коричневый пуллер для микропипеток Sutter InstrumentP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 щипцы Электронная микроскопия Науки72700-D Наконечники
микрозагрузчикаEppendorf930001007
Масло для микроскопа Иммерсионное маслоOlympusIMMOIL-F30CC
Предметное столико для калибровки микроскопа Инжектор давления AmScopeMR095
MPPI-3 Прикладная научная контрольно-измерительная аппаратура
СтереомикроскопOlympusSZ61
Аппаратура обратного давленияПрикладная научная аппаратураBPU
Комплект держателя микропипеткиПрикладная научная аппаратураMPIP
Ножной переключательПрикладная научная аппаратураFSW
МикроманипуляторПрикладная научная аппаратураMM33
Магнитная базаПрикладная научная аппаратураМагнитная основа Фенол
красный;Сигма-Олдрич P-4758
Низкотемпературный инкубаторVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
Источник холодного светаZeiss CL6000 LED
Многолуночная пластина со стеклянным дном, 24 лункиMattekP24G-0-13-F Конфокальный
микроскопOlympusIX-81 с лазерной сканирующей конфокальной системой
Fluoview программное обеспечениеOlympus
Prism v6GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus Чарльз Ривер 490710
Грипп A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Чарльз Ривер 
Грипп NS1-GFPУпоминается в Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Упоминается в Lam et al. 2013
FV-1000490715

Ссылки

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

zebrafishzebrafish Tg mpx mCherry
Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.