Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

Краткое содержание

Мы описываем здесь новый, надежный и эффективный метод тандемной аффинной очистки (TAP) для экспрессии, выделения и характеристики белковых комплексов из эукариотических клеток. Этот протокол может быть использован для биохимической характеристики дискретных комплексов, а также для идентификации новых интеракторов и посттрансляционных модификаций, которые регулируют их функции.

Аннотация

Очистка активного белок-белковых комплексов и белково-нуклеиновых кислот имеет решающее значение для характеристики ферментативной активности и De Novo идентификации новых подразделений и пост-трансляционных модификаций. Бактериальные системы обеспечивают экспрессию и очистку широкого спектра одиночных полипептидов и белковых комплексов. Тем не менее, эта система не позволяет очистку белковых субъединиц , которые содержат посттрансляционные модификации (например, фосфорилирования и ацетилирования), а также выявление новых регуляторных субъединиц, которые присутствуют только в / выраженных в эукариотической системе. Здесь мы приводим подробное описание романа, надежный и эффективный метод очистки тандем сродством (TAP) с использованием септический и FLAG-меченных белков, что облегчает очистку белковых комплексов с временно или стабильно выражается эпитопными меченых белков из эукариотических клеток. Этот протокол может быть применен для характеристики ProtEin комплекс функциональность, чтобы открыть пост-трансляционные модификации на сложных субъединиц, а также определить новые регуляторные сложные компоненты с помощью масс-спектрометрии. Следует отметить, что этот метод ТАР может быть применен для изучения белковых комплексов, образованных эукариотических или патогенными (вирусные и бактериальные) компонентов, получая таким образом широкий спектр ниже по течению экспериментальные возможности. Мы полагаем, что исследователи, работающие с белковыми комплексами могли бы использовать этот подход в самых разных формах.

Введение

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) имеют решающее значение для точного регулирования биологических процессов ^1, и дальнейшие исследования по этим ИПН может сообщить об их функции ^2. Существует несколько подходов были разработаны для исследования и определения характеристик ИПН, а также для идентификации De Novo новых регуляторных белковых компонентов. В 1989 году Стэнли Филдс и его коллеги сообщили дрожжи двух гибридных (Y2H) анализ ^3. Такой подход позволяет беспристрастно и полной идентификации interactors (охотится) для определенного интересующего белка (приманки) в Saccharomyces CEREVISIAE. В дополнение к своей замечательной утилиты для обнаружения ИЦП, анализ Y2H может быть использован для определения характеристик пар белков в дрожжевых клетках, определяя минимальные взаимодействующие домены, а также идентификации мутаций, которые отменяют такие взаимодействия. Изменяя анализа Y2H, ИЦП также могут быть изучены в клетках млекопитающихкласс = "Xref"> 4. Вариации анализа Y2H (например, дрожжи три гибридные системы) , также могут быть применены для изучения белок-РНК и белок-малые органические взаимодействия лиганда в клетках.

Другим часто используемым инструментом для изучения ИЦП в гомологичной системе является со-иммунопреципитации (со-IP) анализ ^5. Используя антитела к иммунопреципитации белок, представляющий интерес, анализ со-IP позволяет исследователям контролировать ИЦП в клетках для различных условий окружающей среды и экспериментальных ситуаций. Использование эпитоп-меченных белков (например, FLAG, Мус, STREP и HA, среди прочих) в аффинной очистки (AP) методов способствовало выделение белков из сложных белковых смесей в течение нескольких последующих анализов, в том числе вестерн - блоттинга, серебро пятно и ферментный анализ. Тем не менее, ни один из этих подходов не ранее позволяют выделение больших количеств белковых комплексов для дальнейшей характеристики в том числе в пробиркеssays, открытие регуляторных субъединиц с помощью масс-спектрометрии и идентификации посттрансляционных модификаций. Усовершенствованный вариант метода AP называется Тандем AP (TAP), которая представляет собой метод очистки для изучения ИЦП путем создания гибридного белка с двумя эпитопов , который очищают с помощью двух последующих точек доступа ^{6, 7.} В этой статье мы представляем вариант способа ТАР для очистки белковых комплексов, в которых две субъединицы, помеченных различными эпитопами и затем очищают с помощью двух последовательных точек доступа (AP STREP с последующим FLAG IP). Сначала обеспечить минималистичный обзор TAP (рисунок 1) , а затем подробное описание всех экспериментальных шагов (рисунок 2), так что исследователи могут применить их к белковым комплексом интересов.

Чтобы продемонстрировать применимость метода TAP, мы выбрали хорошо охарактеризованный циклин-CDK комплекс (называемый PTEFB - киназа), который состоит из регуляторной субъединицы циклина Т1 (CycT1) и киназы (CDK9), и участвует в регуляции транскрипции РНК - полимеразы II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb фосфорилирует С-концевой домен Pol II и связанных с ним негативных факторов удлинения, которые снимает транскрипционный приостановку на промотор и тем самым способствует транскрипции удлинение ^{11, 12, 13.} С помощью этого известного взаимодействия в виду, STREP-меченый CycT1 и FLAG-меченый CDK9 были более выражены в клетках HEK293T. Ответный эксперимент TAP проводили с STREP-меченый CDK9 и FLAG-меченый CycT1 для дальнейшей проверки, что взаимодействие белка не зависит от используемых эпитопов. Клетки собирали и лизировали через 48 часов после трансфекции. Растворимый лизат очищали TAP (STREP AP с последующим FLAGIP). Входные и очищенные белки анализировали с помощью Вестерн - блоттинга и серебра пятно (рисунок 3).

Протокол

1. Покрытие клеток

1. За один день до трансфекции, плиты 3,5 х 10 ⁶ HEK293T клеток в 10 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (об / об) пенициллин / стрептомицин (10000 ед / мл запас) на 100 мм блюдо. Пластина 3 - 5 100 мм блюда на эксперимент / состоянии, чтобы обеспечить достаточное восстановление белка.
   Примечание: Число пластин должен быть определен для каждого эксперимента / состояния, который будет опираться на уровни экспрессии и растворимости белкового комплекса, представляющего интерес. В качестве альтернативы, если очистка в более крупном масштабе необходимо, клеточные линии могут быть адаптированы к росту в суспензии в колбах ² центрифужных, но этот метод не будет работать на временной трансфекции.

2. трансфекции клеток или склонение стабильной клеточной линии

1. На следующий день, проверьте клетки под микроскопом. Клетки должны составлять 70 - 80% сплошности перед тем процеEding.
2. Трансфекции клеток с общей смесью 7 мкг плазмидной ДНК и 21 мкл трансфекции реагента на 100 мм чашку. Трансфекции клеток с вектором , экспрессирующие GFP (таблица 1) в качестве контрол эффективности трансфекции.
   Примечание: При использовании HEK293-T-REX или аналогичный стабильной клеточной линии , которая индуцирует экспрессию двух или более сложных субъединиц в ответ на доксициклина ^{14, 15,} индуктор должны быть добавлены к клеткам и инкубируют в течение 48 часов. Точно так же, стабильной клеточной линии, которая индуцирует экспрессию GFP при добавлении индуктора также потребуется для целей проверки. Перейдите к шагу 2.7.
3. Приготовьте смесь для трансфекции на мм блюдо 100. В 1,5 мл трубки микроцентрифужных, смешать 500 мкл DMEM без добавок с 7 мкг общей плазмидной ДНК (что соответствует двум или более плазмид). В отдельном микроцентрифужных трубки, смешать 500 мкл DMEM без добавок Wiго 21 мкл реагента трансфекции. Повторите эти действия для каждой реакции трансфекции.
4. Пипетировать раствора реагента трансфекции в раствор плазмидной ДНК (не смешивать решения в обратном порядке). Смешайте с помощью пипетки по крайней мере, в 4 раза.
5. Инкубируйте эту смесь при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин, но не более чем на 15 мин.
6. Наклон пластины, чтобы создать медиа-резервуар и тщательно пипетки трансфекционной смеси по каплям на внутреннюю сторону пластины, не нарушая клетки. Вернуть блюдо в исходное плоское положение и водоворот осторожно, чтобы распределить смесь.
7. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе для культивирования клеток с 5% CO ₂ (это условие в дальнейшем упоминается как "тканевой культуры инкубатор"). Заменить носитель 5 ч после трансфекции (по желанию).

3. Проверка Трансфекция или индукционные Эффективность

1. В 24 ч после трансфекции, визуализировать клетки под гриппаorescent микроскоп для проверки эффективности трансфекции (или индукции стабильной клеточной линии управления HEK293T-REX, выражающей GFP). Инкубируют в течение еще 24 ч.

4. STREP Affinity Очистка (STREP AP)

1. Сбор клеток
   1. По прошествии 48 ч после трансфекции, удалить носитель и добавляют 8 мл холодной 1x фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Пипетировать вверх и вниз, чтобы отделить клетки от пластины.
   2. Сбор и передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки и спина клетки вниз со скоростью 800 мкг в течение 4 мин при 4 ° С.
   3. Удалить супернатант PBS. Повторить вращение вниз (800 мкг в течение 1 мин при температуре 4 ° С), чтобы исключить любой остаточной PBS. Хранить осадок клеток при -80 ° С для дальнейшего использования или следовать процедуре ниже, чтобы продолжить очистку белка.
2. Лизиса клеток
   1. Ресуспендируют гранул клеток с использованием 5 × объем клеточного осадка (~ 250 мкл на чашку) пассивного лизирующего буфера(PLB: 20 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl _2, 1 мМ ДТТ, ингибитор протеазы коктейль таблетка, 5% об / об глицерина и 1,0% NP-40) и передачи клеточной суспензии к 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
   2. Кратко вихрь подвеска и качаться в течение 30 мин при 4 ° С.
   3. Спин вниз клеточной суспензии при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
   4. Передача растворимых лизатов в новый 1,5 мл трубки микроцентрифужных и отбрасывать клеточных гранул. Сохранить 10% от конечного объема растворимого лизата как "STREP AP Input». Хранить при температуре 4 ° С.
3. Уравновешивания Стрептококковое бусы
   Примечание: Используйте Стрептококковое шарики для первого шага AP! Комплексы снесены с Стрептококковое шарики восстановить значительно больше белка, чем те, снесены с FLAG бусин.
   1. Вынимают (N × 40 мкл) + п мкл 50% суспензии STREP шарик (п = число выборок) и спином вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: Используйте широкий мouthed советы пипетки бисера.
   2. Удалить супернатант и добавить 500 мкл PLB к шарикам. Качаться смесь шариками в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
      1. Повторить в общей сложности 3 стирок. Ресуспендируют бисером в PLB до конечного объема п × 40 мкл.
   3. Добавьте 40 мкл 50% суспензии STREP борта для каждого образца клеточного лизата и качаться в течение 2 ч при 4 ° С.
4. STREP А.П.
   1. Спин вниз раствор при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С.
   2. Удалить супернатант и хранить как "STREP AP проточный (FT)" при температуре 4 ° С.
   3. Добавьте 500 мкл стрептококкового AP промывочного буфера I (20 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 250 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl _2, 1 мМ DTT, 5% глицерина и 0,2% NP-40) к шарикам. Качаться смесь шариками в течение 5 мин при 4 ° С и центрифуге при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант.
      1. Повторить в общей сложности 4 стирок.
         Примечание: Перед четвертой промывки Переносят раствор шарики на новый 1,5 мл микроцентрифужных трубки, чтобы уменьшить фон белка. Этот шаг имеет важное значение.
   4. Добавить 500 мкл промывочного буфера II (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) и уравновешивают бусинки переворачиванием пробирки. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С и отбросить супернатант.
   5. Элюции интересующего белка с 50 мкл буфера для элюции STREP (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2,5 мМ и Desthiobiotin). Вихрь при 800 оборотах в минуту в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
   6. Спин вниз бусинки при 1500 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатант. Эта часть соответствует образцу "STREP А.П. элюции".
   7. Сохранить фракцию бусин при 4 ° С в течение второго элюции, которое могло бы дать до половины количества белка, полученного с первого элюирования. Аликвоты 10% от стрептококковые AP элюции окрашиванием серебром и / или вестерн-блоттинга^16.
5. Уравновешивания флаге бусы
   1. Выньте (NX 16 мкл) + п мкл раствора FLAG гранул (п = число выборок) и спином вниз при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С.
      Примечание: Используйте с широким горлышком советы для пипеток бисером.
   2. Удалить супернатант и добавьте 500 мкл буфера для промывки ФЛАГ (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,1% NP-40) к шарикам. Спин вниз при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Повторить в общей сложности 3 стирок.
   3. Ресуспендируют бисером в ФЛАГ промывочным буфером до конечного объема 16 мкл NX.
   4. Добавьте 16 мкл флаге шарик суспензии в оставшейся STREP AP элюирования и качаться в течение ночи при температуре 4 ° С.

5. FLAG IP

1. Спин вниз суспензии FLAG шарики при 1500 мкг в течение 2 мин при 4 ° С. Сохраните супернатант и хранить как "FLAG IP проточный" (FT) при 4 ° С.
2. Добавить 50081; л флагового буфера для промывки к раствору. Качаться в течение 5 мин при 4 ° С и центрифуге при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Повторить в общей сложности 4 промывок и удалить супернатант после каждого мытья.
   Примечание: Перед четвертой промывки передать Белковый раствор бусинок к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки для уменьшения фона. Этот шаг имеет важное значение.
3. Удалить супернатант из конечного отжима и добавьте 30 мкл буфера для промывки FLAG, содержащего 200 нг / мкл флаговых пептида в гранулы. Вихрь при 800 оборотах в минуту в течение 2 часов при температуре 4 ° С.
4. Спин вниз суспензии при 1500 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Урожай супернатант и хранят при температуре 4 ° C, как "FLAG IP элюции."
   Примечание: Образцы элюции может быть подтверждена с помощью окрашивания серебром и / или вестерн - блоттинга с использованием стандартных протоколов ^16, и готовы к дальнейшему белковый анализ. При настройке вестерн-блот, запустить все следующие образцы: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiна, (4) FLAG IP-FT, и (5) FLAG IP элюирования. Объемы нагруженные должны быть определены для каждого эксперимента. Все собранные образцы и гранулы могут храниться при температуре 4 ° С для кратковременного хранения и при -80 ° С в течение длительного хранения. Образцы TAP могут быть проанализированы с помощью масс - спектрометрии , чтобы проверить подлинность их компонентов, чтобы идентифицировать новые посттрансляционные модификации (PTMs), и / или открыть любой новый взаимодействие белка с очищенным комплексом ^{2, 17.} С этой целью после запуска Кумасси геля или окрашивания серебром, полосы могут быть вырезаны из геля с помощью чистой скальпель. Несколько превосходных обзоров , в которых обсуждаются методы масс - спектрометрии были ранее опубликованы ^{18, 19.}

Результаты

В этой статье мы покажем применимость метода TAP к хорошо охарактеризованного CycT1-CDK9 комплекса (также известный как P-TEFb-киназы).

Плазмидами , кодирующими циклин T1-Strep (CycT1: S) и CDK9-FLAG (CDK9: F) или CDK9-Strep (CDK9: S) и циклин T1-FLAG (CycT1: F) (таблица 1), были трансфицированы в клетках HEK293T , Отрицательные контроли включали трансфекций с пустым вектором и CDK9: F или CycT1: F плазмид

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, для экспрессии и выделения белковых комплексов из эукариотических клеток не ограничивается биохимической характеризации таких молекулярных ансамблей, но также могут быть использованы для идентификации новых interactors и посттрансляционных модификаций, которые могут регулировать свою функцию. Использование аффинных меток не ограничивается тем, что упоминается в данном протоколе; но наш опыт показывает, что использование Strep в качестве первого шага AP значительно повышает выход конечного бело...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
пенициллин/стрептомицин	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
коктейль ингибиторов протеазы	Roche
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
Буфер для элюирования STREP-tag	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 мм & раз; 20 мм стиль чашка клеточная культура обработанная непирогенный полистирол 20/рукав	Corning
Протеин Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Цифровой вихревой смеситель	Fisher Scientific	02-215-370
Стойка для пенопласта с 48 отверстиями для микротрубок	Fisher Scientific	02-215-386
Шейкер Labquake на гриле	Термо	415110