Регулярная характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для обеспечения поддержания их плюрипотентного состояния является важным шагом, прежде чем эти клетки будут использоваться для других применений. В данной работе мы описываем метод мелкомасштабного размножения иПСК человека, специально разработанный для обеспечения их простой и рутинной характеристики с помощью иммуноцитохимии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мелкосерийное Распространение человека ИПСК в бессывороточной условиях для рутинного Иммуноцитохимическая Характеристика
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Существует большой интерес к использованию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) для моделирования заболеваний и клеточной терапии из-за их специфичности для пациента и характерной стволовости. Тем не менее, плюрипотентность ИПСК (iPSCs), которая имеет существенное значение для их функциональности, должна быть подтверждена до того, как эти элементы можно будет использовать в таких приложениях. В то время как для установления их плюрипотентности необходима строгая характеристика ИПСК с помощью различных клеточных и функциональных анализов, рутинная оценка поддержания плюрипотентности может быть достигнута более просто и эффективно с помощью иммуноцитохимических методов. В данной работе мы представляем систематический протокол культивирования ИПСК в уменьшенном масштабе, чтобы облегчить верификацию их плюрипотентного состояния с помощью иммуноцитохимии. В частности, эта методология включает в себя эффективный и экономичный способ выращивания иПСК в бессывороточных условиях и нанесения их на предметные стекла небольших камер или стеклянные покровные стекла, идеально подходящие для иммуноцитохимии.
Введение
Перепрограммирование взрослого человека соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) обеспечивает способ получить потенциально неограниченный запас клеток конкретного пациента для изучения болезнью 1, 2. Резюмируя фенотипа заболевания в пробирке бы сделать его правдоподобным , чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы , связанные с болезнью, а также улучшить обнаружение наркотиков и персонализированной медицины 3. Кроме того, человеческие иПСК (hiPSCs) обеспечивают возможность получения специфических типов клеток , которые могут быть и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
hiPSCs были получены из фибробластов человека , выделенных из дермы 4 мм перфоратор кожи биопсий и перепрограммировать в доме с помощью вируса Сендай-опосредованной перепрограммирования 11. Университет штата Аризона совета по рассмотрению Institutional одобрил все процедуры при условии набора и сбора биопсии.
1. Приготовление внеклеточного матрикса Coated поверхность для иПСК культуры
- За один день до впадения hiPSC культур, растущих на iMEFs, готовят внеклеточный матрикс (Матригель) пластины с покрытием.
- Медленное таяние аликвоту внеклеточного матрикса (много зависит, следуйте инструкц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол обеспечивает ступенчатое описание того, как иПСК человек может быть переведен из фидерного слоя фидерных свободных условиях, а затем распространяются в ограниченном порядке, специально включить рентабельный иммуноцитохимии для подтверждения технического обслуживания плюрипотентности. На рисунке 1 показано схематическое представление этого протокола. Рисунок 2А показывает hiPSC колонии , растущие на iMEFs в 6-луночные планшеты. Эти колонии д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Систематическое протокол, представленный здесь предлагает Timesaving и экономически эффективный метод, в виде уменьшенную техники культуры, специально разработан для поддержки эффективного анализа плюрипотентности с помощью иммуногистохимии.
Основные преимущества описанной методики заключаются в следующем. Традиционно более 3 -х до 4 проходов, необходимых для перехода ИПСК из фидерных слоев фидерных свободных условий культивирования с целью устранения остаточных iMEFs оставшиеся после исполь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Источники финансирования: Университет Аризоны, Фонд Джима Химелика и Аризонский центр биологии сложных заболеваний.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-глутамин | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-меркаптоэтанол | Life Technologies | 21985023 | |
| Рекомбинантный человеческий FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 Ингибитор ROCK R | & D | 1254 | |
| Коллагеназа типа IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-квалифицированная матрица Corning | 354277 | ||
| mTeSR1 Технологии базальных средних | стволовых клеток | 05850 | |
| mTeSR1 5x Добавка | Технологии стволовых клеток | 05850 | |
| Мягкий буфер для диссоциации клеток | Технологии стволовых клеток | 07174 | |
| 0,1 М ПО<суб>4 Буфер | собственного производства | н/д | |
| Параформальдегид, прилл | Электронная микроскопия Науки | 19202 | |
| 1x Фосфатный буферный физиологический раствор | н/д | н/д | |
| Нормальная козья сыворотка | Life Technologies | 16210072 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Кролик mAb, Sox2 (D6D9) Кролик mAb, SSEA4 (MC813) Мышиный mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Мышиный mAb | Клеточная сигнализация Клеточная сигнализация Клеточная сигнализация Клеточная сигнализация | 2840 3579 4755 4746 | В качестве альтернативы, комбинацию из 6 первичных антител плюрипотентности можно приобрести вместе в виде набора в Каталоге #9656 |
| Козья анти-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Козья анти-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Козья анти-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Доступен в размерах 6, 12, 24, 48, 96 лунок |
| Камерные слайды | Fisher Scientific | 12 565 21 | Доступно в стекле или перманоксе Пластик размером 1, 2, 4, 8, 16 лунок |
| Покровное стекло для роста | Fisher Scientific | 12 545 82 | Доступны размеры 12, 15, 18, 22 и 25 мм |
Ссылки
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
