Настраиваемая камера для измерительной ячейки миграции

Summary

Этот протокол подробно настраиваемый метод измерения миграции клеток в ответ на хемоаттрактанты, которые также могут быть использованы для определения скорости диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы.

Abstract

Миграция клеток является жизненно важной частью иммунных реакций, роста и заживления ран. Миграция клеток представляет собой сложный процесс , который включает в себя взаимодействие между клетками, внеклеточного матрикса, а также растворимых и нерастворимых химических факторов (например, хемоаттрактанты). Стандартные методы измерения миграции клеток, таких как камера анализа Бойденом, работы путем подсчета клеток по обе стороны от делителя. Эти методы просты в использовании; Тем не менее, они предлагают небольшую геометрическую модификацию для различных областей применения. В отличие от этого , микрофлюидальные устройства могут быть использованы для наблюдения миграции клеток с помощью настраиваемых градиентов концентрации растворимых факторов ^{1, 2.} Однако способы получения анализов микрофлюидики на основе может быть трудно узнать.

Здесь мы опишем простой способ для создания клеточных культур камеры для измерения миграции клеток в ответ на химические градиенты концентрации. Наши мобильные милиGration метод камера может создавать различные градиенты линейной концентрационной для изучения миграции клеток для различных применений. Этот метод является относительно простым в использовании и, как правило, осуществляется студентов.

Микроканал камера была создана путем размещения акриловую вставку в виде окончательно микроканальной камеры хорошо в чашку Петри. После этого, поли (диметилсилоксан) (ПДМС), выливалась в верхней части вставки. ПДМС был затвердеть, а затем вставка была удалена. Это позволило для создания скважин в любой желаемой формы и размера. Клетки могут быть впоследствии добавлены в микроканальной камеры, и растворимые вещества могут быть добавлены к одной из скважин путем замачивания агарозы блок в желаемом агента. Агарозы блок добавляется в одну из лунок, и время покадровой изображения могут быть взяты из микроканальной камеры для того, чтобы количественно оценить миграцию клеток. Вариации этого метода могут быть сделаны для данного применения, что делает этот метод HIGHLY настраиваемый.

Introduction

Для того, чтобы происходили жизненно важные процессы, такие как заживление ран, иммунные реакции и эмбриональное развитие, должна происходить миграция клеток. Миграция клеток включает в себя взаимодействие между клетками и соседними клетками, внеклеточным матриксом и растворимыми химическими сигналами (аттрактантами или репеллентами). Например, в процессе заживления ран фибробласты играют важную роль в фиброгенезе и сокращении раны, где клетки возвращаются к месту повреждения для синтеза коллагена, чтобы сформировать внеклеточный матрикс³. Были изучены многочисленные механизмы, лежащие в основе миграции фибробластов в область раны, и они включают в себя различные механические, физические, электрические и хемотаксические факторы⁴. Особенно хорошо фибробласты реагируют на различные градиенты концентрации факторов роста. Эти различные факторы роста работают вместе, оптимизируя регенерацию тканей⁵. Наблюдая за хемотаксической реакцией фибробластов на концентрации факторов роста, можно изучить характер направленной миграции фибробластов и то, как они ориентируются вокруг физических препятствий, чтобы достичь своей цели. Таким образом, цели данного исследования заключались в том, чтобы, во-первых, разработать систему, в которой рост фибробластов можно было бы отслеживать под контролем физических барьеров, а во-вторых, смоделировать рост фибробластов по мере их перемещения по системе.

В настоящее время анализ камеры Бойдена является наиболее широко используемой системой для измерения миграции клеток⁶. Камера Бойдена состоит из двухкамерного многолуночного планшета, где каждая лунка может содержать среду с хемоаттрактантами или без них⁷. Фильтрующая мембрана обеспечивает пористую границу раздела между двумя камерами в каждой скважине; Это создает барьер, через который клетки не могут пройти, если это не происходит в результате активной миграции. Как правило, для камеры Бойдена в нижнюю камеру добавляют хемоаттрактант, и системе позволяют уравновеситься, образуя градиент между верхней и нижней лунками class<='xref'>4. Одна из проблем с камерой Бойдена заключается в том, что крутые градиенты в конечном итоге формируются вдоль одной оси, перпендикулярной поверхности мембраны. Это приводит к тому, что разница в концентрации хемоаттрактанта между верхними и нижними скважинами оказывается ниже, чем ожидалось изначально. Из-за этого ограничения анализ в камере Бойдена затрудняет корреляцию конкретных клеточных реакций с определенными градиентными характеристиками, такими как наклон и разница концентраций. Без этих измерений трудно изучать многоградиентное интегрирование сигналов.

Чтобы устранить некоторые ограничения традиционного камерного анализа Бойдена, микрофлюидные анализы были разработаны для формирования настраиваемых градиентов концентрации¹. Стандартные методы создания микрофлюидных систем требуют чистых помещений для литографической техники. Эти методы могут быть трудными для освоения, особенно в стандартной обстановке класса. Таким образом, мы разработали камерную систему для измерения миграции клеток, которая может быть изготовлена без использования чистого помещения. Используя нашу систему, лунки для анализа могут быть отрегулированы до предпочтительного размера, а также может быть получен линейный градиент концентрации с индивидуальным наклоном. Это позволяет точно измерить хемотаксис от случайного движения. Конструкция представляет собой недорогую и простую в использовании систему для моделирования роста клеток в ответ на различные химические стимулы.

Protocol

1. Производство микроканальной камеры для создания градиента концентрации

1. Резка акриловый лист формы
   1. Получить кусок акрила требуемой ширины. Обычно используют 1/16-дюймовый толщиной акриловые листы. Более толстые листы трудно вырезать так и очень тонкие листы не обладают необходимой механической прочностью, в результате чего к их разрушению или деформации во время процесса.
   2. Создание CAD-файл с желаемыми формой акриловой части, чтобы произвести полости внутри полидиметилсилоксан (PDMS). Регулировка ширины канала и длины, чтобы достичь желаемого градиента, имеющую отношение к отдельным экспериментальных протоколов.
      1. Здесь, используйте акриловый лист следующих размеров: два квадрата (0,254 см х 0,254 см) , соединенных широким каналом 0,127 см (длиной 0,254 см) (рисунок 1).
   3. Импорт файла САПР в лазерной резки устройства и поместите акриловый лист в лазерный резак согласно МануПротокол дитель в.
      Примечание: В качестве альтернативы, 3D-печать кусок от автоматизированного проектирования. Преимущество этого способа состоит в том, что альтернативные материалы могут быть использованы для пресс-формы; Тем не менее, разрешение и воспроизводимость может быть уменьшена с 3D-печати по сравнению с лазерной резки.

Рисунок 1: Computer-Aided Design (CAD) Представление микроканальной палаты. Это изображение показывает чертеж САПР акрилового вкладыша, необходимого для создания Микроканал камеры. 1 A) Вид сверху САПР чертеж, 1В) Вид сбоку САПР чертеж с размерами в дюймах, 1C) Вид сверху САПР чертеж с размерами в дюймах Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Заливка полидиметилсилоксана (PDMS)
1. В взвешивании лодки, смешать 10 частей по массе коммерческой эластомерной основе (например , Sylgard 184) с 1 частью по массе коммерческой эластомерных отвердитель (например Sylgard 194). Как правило, смесь 10 г эластомерной основе до 1 г эластомерного отвердителем.
2. Движение, чтобы объединить основы и отвердителя с помощью микропипетки в течение 5 мин.
3. Установите вакуумный колокол и поместите взвешивать лодку с PDMS в вакууме в течение 30 мин, чтобы удалить скопившийся воздух.
4. Выключите пылесос и удалите взвешивать лодку. Налить PDMS поверх акрилового выреза в маленькой чашке Петри. Убедитесь, что PDMS полностью покрывает вставку.
5. Дайте ПДМС, чтобы вылечить в течение ночи (по меньшей мере 18 ч) при комнатной температуре.
2. Удаление вставки из PDMS
   1. После отверждения PDMS, удалите вставку осторожно срезания PDMS вокруг акриловой части с помощью скальпеля.

2. Покрытие ячеек в микроканальной палате

1. Стерилизация камеру для металлизации ячеек.
   Примечание: В то время как ПДМС можно стерилизовать с использованием окиси этилена или других методов, быстрое лечение УФ быстро, недорогой, и достаточно для исследования клеточных культур. Продолжительность короткого УФ лечение не ухудшают структуру или механическую целостность куска PDMS.
   1. В стандартном шкафу для культивирования клеток, полностью закрывают камеру с 70% -ным этанолом.
   2. Поместите чашку Петри в колпаке с ламинарным потоком с крышками прочь.
   3. Закройте крышку и включите УФ-свете. Expose к УФ-светом в течение 1-2 ч.
   4. Откройте капот ламинарного потока и подождите 15 минут, чтобы восстановить поток.
   5. Удалите 70% этанола.
   6. Промыть камеры дважды стерильной фосфатным буферным раствором (PBS). Используйте 1 мл PBS для каждого мытья. Удалить PBS и позволяют камеры высохнуть в течение ночи с крышками прочь.
      Примечание: В качестве альтернативы, вместоиспользования капот ламинарного потока, используйте камеру коробку УФ для стерилизации, если таковая имеется. Сделайте УФ коробку путем размещения источника света УФ в задней части картонной коробки выровненной с алюминиевой фольгой. Алюминиевая фольга отражает свет, чтобы обеспечить равномерное освещение образца.
2. Покрытие ячеек в палате
   1. Граф клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
      1. Добавляют 100 мкл суспензии клеток в 400 мкл 0,4% трипанового синего и осторожно перемешать. Применить 100 мкл этого раствора к гемоцитометра, аккуратно заполняя обе камеры под покровным стеклом.
      2. С помощью микроскопа с объективом 10X, чтобы сосредоточиться на сетке на гемоцитометра. С помощью рук Tally счетчик для подсчета живых неокрашенных клеток в пределах одного набора 16 квадратов на гемоцитометра.
      3. Граф клеток во всех 4-х комплектов 16 квадратов. Возьмите среднее количество клеток из 4 наборов 16 квадратов и умножить на 5x10 ^4. Это окончательное число является Numbeг клеток / мл в суспензии клеток.
   2. Добавьте 2500 клеток в одну лунку в каждой камере. Это приводит к почти сливающийся плотности клеток ~ 30000 / см ^2.
   3. Разрешить клетки сидеть в камере в течение 60 мин перед добавлением носителей (Дульбекко Modified Eagle Среднесрочная, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина).

3. Декстран Пропитавшиеся агарозы Блоки

1. Создание агарозном блока
   1. Залить 3% агарозном в 3D печатной формы (2 мм х 2 мм х 2 мм).
   2. Разрешить агарозы, чтобы затвердеть в вакуумной камере в течение 30 мин, чтобы удалить пузырьки.
   3. Удалить блок агарозы из пресс-формы.
      Примечание: В качестве альтернативы, заливают 3% агарозном в небольшую чашку Петри, при толщине 2 мм. Вырезать х 2 мм х 2 мм блок 2 мм с помощью скальпеля или другого режущего инструмента. Это не так точно, как система пресс-формы, но она может быть немного легче сделать.
2. Полностью submergе агарозном блок в растворе нужной концентрации хемотактической фактора. Для того, чтобы оценить образование градиента концентрации, промойте камеру сначала с флуоресцентного декстрана. Концентрация и молекулярная масса декстрана должна совпадать с растворимым фактора или лекарственного средства, представляющего интерес.
3. Замочите в агарозном блок в течение ночи.

4. Покадровый декстрана Diffusion для оценки градиента концентрации Растворимый фактор

1. Поместите декстран замачивают в агарозном блок в маленькой квадратной яме микроканальной камеры.
2. Поместите Микроканал камеру в системе формирования изображения клеток или использовать другой флуоресцентный микроскоп с возможностью покадровой. Начинают времени покадровой в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Представленные результаты взяты с GFP фильтром, 50% света, 4/10 рН и 4-кратным увеличением.

5. Покадровый роста клеток

1. Пластина клеток в микроканальной камеры на одном концекамера. При этом использовать 3Т3 фибробласты. Добавьте 2500 клеток в одну лунку в микроканальным камере. Граф клеток, как описано в разделе 2.2.1.
   1. Разрешить клетки сидеть в камере в течение 60 мин перед добавлением носителей (Дульбекко Modified Eagle Среднесрочная, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина). Хранить Микроканал камеру с высевания клеток при 37 ° С в 5% CO _2. Миграция клеток через канал можно рассматривать с помощью микроскопа.
   2. Добавить маркер или использовать микроскопический дефект в камере в качестве маркера для того, чтобы служить в качестве отправной точки для количественного определения расстояние, на котором клетка фронт движется.
2. Создание градиента путем размещения агарозный гель (8 мм ³ блок) , содержащий концентрированный фактор роста, химио-аттрактант, лекарственный препарат, или другой фактор тестируется (здесь, 40% FBS , используется в качестве примера) , на одном конце микроканала камера.
3. Возьмите покадровой изображения движущегося фронта клетки. Здесь, результаты показывают изображения клетки сюдант, которые были взяты через каждые 12 ч, используя систему формирования изображения.
4. Используйте снимки передней ячейки для количественного определения скорости роста клеток. Рассчитайте темпы роста на первом использовании функции polyfit MATLAB (roipoly), чтобы создать многоугольной маску, определяемую передней ячейки, стенки канала и опорного маркера. Размеры этой маски дают миграционную расстояние фронта, из которого вычисляется средняя скорость ячейки фронт. Другие исследования использовали аналогичный метод ^8.
   Примечание: Сравнение края фронта роста клеток на каждом кадре до концентрации растворимого фактора на том же расстоянии. Растворимый градиент концентрации фактора рассчитывается с использованием 1D диффузионной модели аппроксимации.
5. Возьмите флуоресцентные изображения клеток с использованием фаллоидином и DAPI окрашивания.
   1. Fix клетки до окрашивания фаллоидином.
      1. Теплый 4% параформальдегида при температуре 37 ° С.
      2. Добавьте достаточно 4% параформальдегида, чтобы покрыть клетки. Держите клетки впараформальдегидом в течение 10 мин.
      3. Промыть два раза с PBS в течение 15 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
   2. Удалить PBS от клеток и добавляют достаточное количество раствора permeabilizing (0,1% Тритон Х-100 в PBS), чтобы покрыть клетки. Оставьте раствор в течение 10 мин.
   3. Промыть два раза с PBS в течение 5 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
   4. Удалить PBS от клеток и добавления блокирующего раствора (1% бычьего сывороточного альбумина в PBS) в течение 20 мин.
   5. Удалить блокирующий раствор и моют 2 раза PBS в течение 5 мин каждый раз. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки.
   6. С этой точки зрения, защищают клетки от воздействия света с алюминиевой фольгой, когда он не используется. Удалить PBS из клеток и добавить фаллоидином 488 разбавленных в соотношении 1:50 в PBS в течение 1 ч.
   7. Мыть 2 раза в PBS в течение 5 мин для каждой стирки. Используйте достаточное количество PBS, чтобы покрыть клетки. Затем удалите PBS из клеток.
   8. Добавить DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) разводили 1: 1000 в PBS с клетками в течение 15 мин.
   9. Удалить DAPI имыть клетки дважды с PBS в течение 5 мин при каждой стирке.
   10. Удалить последнюю стирку и добавить достаточно, чтобы покрыть PBS клетки. Клетки теперь могут быть отображены с помощью флуоресцентного микроскопа.

Results

На рисунке 2 показано движение передней ячейки , по каналу в ответ на градиент эмбриональной телячьей сыворотки , помещенным на противоположном конце канала , откуда клетки высевают. Клетка фронт показан на 48 ч (рис 2А), 72 ч (рис 2В), 96 ч (рис 2с) и 120 ч (рис 2D) пост обшивкой. Движение фронта клеток отслеживали с этими покадровой изображений, и миграция расстояние и скорость роста были вычислены с п...

Discussion

Наша Микроканал камера может использоваться для множества целей, в том числе определение скорости миграции клеток в ответ на факторы роста и хемоаттрактанты и измерения скорости диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы. Можно использовать наши микроканальной камеры для роста клеток и поместите хемоаттрактантной в одном конце камеры. Клетки растут в ответ на хемоаттрактанту, и миграции клеток может быть определена количественно путем принятия покадровой изображения, которые могут быть проанализированы с цел...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров	Sigma-Aldrich	761036	поли(диметилсилоксан) Набор из 2 частей, включая основу из силиконового эластомера и отвердитель силиконового эластомера
Акриловые листы	US Plastic	44200
Одноразовые чашки Петри	Фалькон	25373-041
Флуоресцеин изотиоцианат– декстран	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Агароза, тип I, с низким EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Компоненты клеточных сред
Фетальная бычья сыворотка	Fisher Scientific	16000036	Компоненты клеточных сред
Пенициллин-стрептомицин	Fisher Scientific	15140148	Компоненты клеточных сред
Фосфатно-солевой буфер (PBS)		Fisher Scientific
EVOS XL	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Прибор, используемый для съемки покадровых изображений
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Номер модели VLS2.30	Лазерный резак для резки пластика