Методическая статья

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

DOI:

10.3791/55268

⸱

16 марта 2017 г.

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для эффективного создания трофобластических клеток человека из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием костного морфогенного белка 4 и ингибиторов активина/узловых путей. Этот метод подходит для эффективной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека и позволяет получать большое количество клеток для генетических манипуляций.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плацента является первым органом развивать в процессе эмбриогенеза и необходим для выживания развивающегося эмбриона. Плацента состоит из различных клеток трофобласта, которые дифференцируются из внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Таким образом, наше понимание ранней дифференциации событий плаценты человека ограничена из-за этических и правовых ограничений на изоляции и манипуляции человеческой эмбриогенеза. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) представляют собой надежную модель системы для исследования развития человека , а также могут быть дифференцированы в пробирке в трофобласта клеток , которые экспрессируют маркеры различных типов клеток трофобласта. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференциации hPSCs в трофобластических клеток с использованием костного морфогенного белка 4 и ингибиторы / Узловые сигнальных путей активин. Этот протокол генерирует различные трофобласта типы клеток, которые могут быть трансфицированы с киРНКдля исследования с потерей функции фенотип или могут быть заражены патогенами. Кроме того, hPSCs могут быть генетически модифицированы, а затем дифференцировались в трофобласта клеток-предшественников для усиления из-функции анализа. Это в пробирке метод дифференциации для формирования человека трофобласта , начиная с hPSCs преодолевает этические и правовые ограничения работы с ранних человеческих эмбрионов, и эта система может быть использована для различных приложений, включая обнаружение наркотиков и исследования стволовых клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плацента необходим для роста и выживания плода во время беременности и облегчает обмен газов, питательных веществ, отходов производства, а также гормонов между материнской и кровообращение плода. Первый орган формируется во время эмбриогенеза млекопитающих является плацента, которая начинает разработку 6-7 дней после зачатия в организме человека и 3,5-4,5 дней у мышей 1, 2, 3, 4. Трофобластические клетки являются наиболее важными клетками плаценты, и эти клетки представляют собой одну из самых ранних событий дифференцировки родословная зародыша млекопитающих. Они возникают из внешних внеэмбриональной трофэктодерме клеток предимплантационной бластоцисты. Наши знания о ранних стадиях развития плаценты ограничивается этическими и материально-технических ограничений по моделированию раннего развития человеческого потенциала.

Во время эмбрионального имплантации трофобластавторгнуться материнский эпителий и дифференцироваться в специализированные клетки - предшественники 5. Cytotrophoblasts (CTBS) являются Мононуклеированные, недифференцированные клетки-предшественники, которые взрывателем и дифференцируются в syncytiotrophoblasts (SYNs) и extravillous инвазивными трофобласта (EVTs), которые закрепляют плаценту к матке. SYNs являются многоядерные, терминально дифференцированные клетки, которые синтезируют гормоны, необходимые для поддержания беременности. Ранние дифференциации событий , которые генерируют EVTs и SYN , имеют важное значение для формирования плацентарной, так как нарушения в клетках трофобласта приводит к выкидышу, преэклампсии и внутриутробное ограничение роста 1. Которые были разработаны типы линий человеческих клеток трофобласта включают увековечены CTBS и хориокарцинома, которые производят плацентарных гормонов и отображать инвазивные свойства 6. Первичные трофобластические клетки из плацент первого триместра человека могут быть выделены, но клетки быстро дифсовыми и остановить пролиферирующих в пробирке. Важно отметить, что трансформировали и первичные клеточные линии имеют различные профили экспрессии генов, указывая , что онкогенные и увековечил линии трофобласта клеток не могут точно представлять первичные трофобласта 7. Кроме того, эти линии вряд ли будут похожи на плацентарного трофобласта клетки-предшественники стволовых клеток, так как они получены из поздних стадиях первого до третьего триместра.

Существует потребность в надежной в пробирке системы культуры новообразующимися человека трофобласта с целью изучения ранних событий плацентарной формирования и функции. Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые разделяют свойства с внутренней клеточной массы эмбриона предимплантационной, часто используются для моделирования раннего развития людских ресурсов, в том числе формирование ранней плаценты. Оба человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и ЭСК могут быть дифференцированы в трофобласта в пробирке с использованием Bone Morphogenic белка 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Это превращение плюрипотентных клеток трофобласта клеток с использованием ВМР4 является специфическим для клеток человека и широко используется для изучения развития ранней плаценты человека , поскольку он не требует доступа к ранних эмбрионов человека 9, 16. Недавно было обнаружено, что добавление ингибиторов A83-01 (А) и PD173074 (P), которые блокируют сигнальные пути SMAD2 / 3 и MEK1 / 2, повышает эффективность HPSC дифференциации в трофэктодерме типа клеток-предшественников, в основном SYNs и EVTs, без обширного поколения мезодермы, энтодермы, или клетки эктодермы 9, 17 . Используя эти средние условия, ЭСК дифференцируются в течение 12 дней имеют сходные профили экспрессии генов как трофэктодерме клеток , выделенных из эмбрионов бластоцисты стадии человека и секретируют различные плацентарные специфические гормоны роста, поддерживая справедливость этого в лабораторных условиях модельной системы 9, 11. Здесь мы представляем подробный протокол для дифференцировки в пробирке hPSCs в предшественниках трофобласта человека с помощью BMP4 / A / P культуральной среды. Эти условия продуцируют обильные количества клеток для широкого спектра применений, в том числе РНК-последовательности, разрушение гена с использованием киРНК, патогеном инфекций и генетической модификации, Липофекция-опосредованной трансфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Для дифференциации либо ЭСК или hiPSCs в трофобласта клеток-предшественников, hPSCs, выращенные на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) являются переведены на фидерных свободные условия для двух пассажей до начала дифференцировки с BMP4 / A / P. Этот процесс устраняет MEF загрязнение дифференцированных клеток. Здесь мы приводим протокол для дифференцировке ЭСК, и тот же протокол может быть применен к hiPSCs.

1. Культура и восстановление ЭСК на облученного мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) (подготовка)

  1. Гамма-облучение MEFs
    1. Сделать 500 мл среды для культивирования MEFs: DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1x пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep) и 0,1 мМ несущественных аминокислот (NEAA).
    2. Оттепель один флакон первичных MEFs и использовать MEF среду для культивирования клеток. Разверните первичные MEFs 30 пластин с использованием MEF культуральной среды.
      Примечание: Концентрация кислорода не являются критическими для этого шага, таклибо могут быть использованы физиологические (4%) или температуре окружающей среды (20%) условий в инкубаторе.
    3. Урожай MEFs. Используйте 0,25% трипсина, чтобы удалить MEFs из пластин и переноса клеток в конической трубе. Поместите MEFs в инструмент облучения и подвергать клетки до 3500 оттенков серого.
      Примечание: Количество времени, будет зависеть от активности источника внутри блока облучателя.
    4. Ресуспендируют облученные MEFs с MEF культуральной среде и подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра.
    5. Гранул MEFs с помощью центрифуги и добавьте 50% среды MEF культуры и 50% клетки замораживания среды (80% FBS и 20% средних MEF культуры). Алиготе 1 × 10 6 клеток на флакон.
    6. Поместите облученные MEF флаконов в -80 ° C в течение ночи с морозильной камерой, а затем передавать их в жидкий азот для длительного хранения.
  2. Размораживание замороженных MEFs и ЭСК для культуры
    1. Сделать 500 мл ЭСК среды: DMEM / F-12 с 20% сыворотки замеement, 0,1 мМ NEAA, 2 мМ L-глутамина, 10 нг / мл bFGF, 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола, и 1x пен / стреп.
    2. Оттепель один флакон MEFs за один день до оттаивания ЭСК. Покройте 6-луночный планшет с 0,1% желатина, используя 1 мл для каждой лунки. Выдержите в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре, а затем удалить желатин.
    3. Удалить флакон MEFs от хранения в жидком азоте и погрузить флакон в C водяной бане при 37 °. Смотрите флакон с перерывами до только мелкие кристаллы льда остаются. Быстро перенесите содержимое флакона до 9 мл MEF среды внутри 15 мл коническую трубку.
    4. Гранул клетки центрифугированием при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в MEF среде. Алиготе MEFs равномерно на 6-луночный планшет. Поместите пластинку в 37 ° С низким содержанием кислорода (4%) инкубаторе в течение ночи.
  3. Рутинное культуры ЭСК на MEFs
    1. Удаление флакона чЭСК из жидкого азота и быстро таять флакон с использованием 37 ° C на водяной бане. Аккуратно пипетки ЭСК в 15 мл коническую пробирку, содержащую 9 мл ЭСК среды и спином вниз при 200g в течение 5 мин. Удалите среду и ресуспендирования клеток с 1 мл ЭСК среды.
    2. Аспирируйте MEF среды из пластины, полученного на стадии 1.2.4 и добавляют 1 мл чЭСК среды. Добавить ингибитор Рок Y-27632 (10 мкМ) в среде чЭСК. Передача ЭСК на MEFs.
    3. Поместите клетки в 37 ° С с низким содержанием кислорода (4%) инкубаторе на ночь. Замените среду чЭСК ежедневно. Соскребите дифференцированные клетки с помощью пипетки Пастера, визуализированы под микроскопом при вертикальном 4X.
    4. Прохождение ЭСК через каждые 4-6 дней, в зависимости от состояния сплошности клеток и размера чЭСК колоний. Подготовьте тарелку MEFs за день до пассажей. Когда клетки готовы к прохождению, удалите среду чЭСК и промыть скважину с 1 мл PBS.
    5. (Предварительно нагретый до 37 ° С) Добавить 1 мг / мл коллагеназы, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, и удалить коллагеназы. Wпепел клеток с PBS, добавляют 1 мл ЭСК среды на лунку, и вручную очистить клетки на мелкие комки, используя кончик 5 мл пипетки. Передача приостановленные сгустки клеток в новую MEF покрытием хорошо (с).

2. Переход от ЭСК MEFs фидера безупречных условий на пластинах внеклеточный матрикс покрытием

  1. Подготовка MEF - кондиционированной среды (см)
    1. Пластина облученные MEFs в Т75 колбу на 90-100% сплошности; важно, чтобы MEFs плотно высевали. Обратите внимание на клетки с помощью микроскопа, чтобы определить, были ли они прикреплены к основанию колбы (МЭФ присоединять примерно через 6 ч после посева или на следующий день).
      Примечание: Unattached клетки плавают в среде при наблюдении с помощью микроскопа. На следующий день, удалить MEF среды и добавляют 25 мл чЭСК среду, лишенную B-FGF.
    2. Собирают кондиционированной среды после 24 ч инкубации. Заменить свежей средой ежедневно в течение максимум 12 дней.
    3. Фильтр собранный см с помощью 0,22 мкм фильтра. Перед использованием добавить свежий B-FGF в КМ.
      Примечание: СМ могут быть заморожены при -80 ° С и хранили в течение до 1 года. В качестве альтернативы, хранить СМ при температуре 4 ° С в течение 2-х недель.
  2. Переход в ЭСК из культуры на MEFs фидерных свободных внеклеточных пластин матрицы покрытием.
    1. Получение внеклеточного матрикса для покрытия тканевых культуральных планшетах
      1. Оттепель аликвоту внеклеточного матрикса на льду (около 3-4 ч). Использование ледяной штекеры, один холодный, 50 мл коническую пробирку и DMEM / F12, передачу 2 мг внеклеточного матрикса в 24 мл охлажденного на льду DMEM / F-12 (разбавление зависит от концентрации внеклеточного матрицы от поставщика ).
      2. Немедленно передать 50-мл коническую трубку на лед и хранить его при температуре 4 ° С. Для покрытия тканевых культуральных планшетах, добавить соответствующее количество разбавленного внеклеточного матрикса в скважине (например, 1 мл на лунку в 6-луночный планшет), Вихревой, чтобы покрыть планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа.
    2. Прохождение ЭСК из MEFs (как на этапе 1.3) с использованием СМ, содержащего B-FGF (10 нг / мл).
      1. Отберите для удаления внеклеточного матрикса из новой плиты и добавьте CM, содержащую B-FGF. Передача Царапины клеточные комки из MEF пластины с помощью пипетки и аликвоту его в внеклеточной матрицы пластины с покрытием. Выдержите в 37 ° C инкубаторе низким содержанием кислорода в течение ночи.
      2. Заменить КМ с B-FGF среды в день; количество среды будет зависеть от размера колбы культуры. Используйте 2 мл среды для одного 6-хорошо хорошо. Соскребите дифференцированные клетки с помощью пипетки Пастера.
      3. Прохождение ЭСК каждые 6-7 дней, когда колонии светлые, если смотреть под микроскопом.
        Примечание: чЭСК колонии, выращенные на пластинах внеклеточного матрикса покрытием расти больше, чем MEF-культивируемых клеток.
      4. Когда фидерные свободные клетки готовы к прохождению, удалите среду, Мытье объявлениемDing 1 мл PBS с помощью пипетки, аспирация, чтобы удалить PBS, добавляют 0,5 мг / мл диспаза (предварительно нагретый до 37 ° С) с помощью пипетки, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
      5. Промывают клетки с PBS путем добавления 2 мл PBS на лунку и аспирационного после этого. Добавьте 1 мл CM на лунку и вручную очистить клетки на мелкие комки, используя кончик 5 мл пипетки.
      6. Пластина приостановленных скопления клеток в новые внеклеточных матричных пластин с покрытием; клетки должны придерживаться после 24 часов.

3. Дифференциация ЭСК Использование BMP4 / A / P

  1. Приготовьте дифференциации среды. Использование CM (отсутствие B-FGF) и добавьте (свежий) ВМР4 (50 нг / мл), A83-01 (1 мкМ), и PD173074 (0,1 мкМ). Добавьте эти ингибиторы КМ перед использованием.
  2. Используйте фидерных свободных ЭСК, растущие на внеклеточных матричных пластин с покрытием за 1 проход, культивируемые в инкубатор при 4% кислорода. После первого прохода на внеклеточных матричных пластин с покрытием,пусть клетки прикрепляться в течение 24 часов. На следующий день, инициировать дифференциацию. Удалите CM (содержащий B-FGF) и заменить его на СМ, ​​содержащей BMP4 / A / P (2 мл на лунку в 6-луночный планшет). Продолжить культивирования клеток с использованием 4% уровня кислорода.
  3. Заменить КМ, содержащий BMP4 / A / P (2 мл / лунку для 6-ти луночного планшета) каждые 2 дня. Аспирируйте, чтобы удалить старую среду и добавить новый CM с помощью пипетки. На второй день после добавления ВМР4 и удаления B-FGF (считается дифференцировка 2-й день), морфология клеток изменяется, появляется больше при наблюдении с помощью микроскопа.
    Примечание: недифференцированные клетки, которые обладают яркой закругленные края, не будет присутствовать.
  4. Сбор клеток в требуемых временных точках. Дифференцированные клетки прекращают деление примерно через 2 недели. Трансфекции клеток в течение этого периода времени (смотрите следующий раздел).

4. Трансфекция клеток трофобласта с миРНК или плазмидной ДНК

  1. Подготовьте трофобластические клетки для трансфекции
    1. Культура ЭСК для двух пассажей на внеклеточный матрикс после переноса их из MEFs (см шаг 2.2). Используйте среду чЭСК, содержащую B-FGF.
    2. Разделить ЭСК на новый внеклеточный матрикс пластины за один день до дифференциации. Высокая клеточная конфлуэнтности имеет важное значение, так разделить ячеек 1: 1 на новую пластину / лунку, которая будет обеспечивать по меньшей мере 50% слитности на следующий день. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
      Примечание: ЭСК не нужно быть подсчитаны в течение этого шага.
    3. На следующий день, замените носитель с дифференциацией среды (СМ, содержащей BMP4 / A / P и B не хватает-FGF, используя 2 мл / лунку в течение 6-луночный планшет). Удалите старую среду путем аспирации и передать новую среду (2 мл) с помощью пипетки. Поместите клетки в инкубаторе с низким содержанием кислорода (4% кислорода) в течение ночи.
  2. Трансфекция с использованием siРНК , для разрушения гена или с помощью ДНК плазмиды ,
    1. не Дифференцировать клетки до желаемого Time-точка (между 1-й и 14). За день до трансфекции, Trypsinize клеток с использованием 0,05% трипсина в течение 5 мин. Пластинчатый их к желаемому сплошности (в зависимости от протокола реагента для трансфекции) на пластину желатин покрытием (добавить 0,1% желатина в культуральную чашку ткани в течение 20 мин и аспирата для удаления). Добавить СМ, содержащий BMP4 / A / P (недостающую B-FGF) и инкубировать в течение ночи.
    2. На следующий день, добавить свежую среду дифференцировки в клетки. Трансфекцию миРНК с использованием реагента для трансфекции миРНК. Для получения плазмидной ДНК, используют соответствующий реагент Липофектамин.
    3. Следовать протоколу продукта, как это описано для каждого реагента для трансфекции. Передача миРНК-Липофектамин комплексов в каждую лунку / пластины клеток, осторожно перемешать, и культуры клеток в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
      Примечание: Некоторые реагенты трансфекции подавляются антибиотиками, которые требуют CM отсутствуют пен / стреп.
    4. На следующий день, заменить свежей среде для дифференцировки.
    5. Сбора клеток по желаниюг временные точки (например, 24 ч, 48 ч и 72 ч) , чтобы проверить эффективность разрушения гена с использованием количественной ОТ-ПЦР. Для сбора клеток, используют 0,05% трипсина, добавив 1 мл на лунку и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Добавьте 5 мл MEF среды на лунку, чтобы нейтрализовать трипсина. Спин вниз клетки при 200 мкг в течение 5 мин и используют осадок клеток для выделения РНК.

5. Возбудитель Инфекция трофобластические клеток: Сендай Вирусная инфекция

  1. Подготовка ЭСК для дифференциации
    1. Культура ЭСК для двух пассажей на внеклеточный матрикс после передачи из MEFs (см шаг 2.2). Используйте среду чЭСК, содержащую B-FGF.
    2. Разделить ЭСК на новый внеклеточный матрикс пластины за один день до дифференциации. Высокая клеточная конфлуэнтности имеет важное значение, так разделить ячейки 1: 1 на новую пластину / лунку, которая обеспечит по меньшей мере 50% слитности на следующий день. Инкубируйте клетки в течение ночи в с низким содержанием кислорода инкубатора (4% кислорода). <бр /> Примечание: ЭСК не нужно быть подсчитаны в течение этого шага.
    3. На следующий день, замените носитель с дифференциацией среды (СМ, содержащей BMP4 / A / P и B отсутствуют-FGF) и культуры в течение ночи в инкубаторе низким содержанием кислорода (4% кислорода).
  2. Сендай вирусная инфекция трофобластических клеток
    1. За один день до желаемого дня дифференцировки, Trypsinize дифференцирующие клетки (в отдельных клеток) с использованием 0,05% трипсина в течение 5 мин и передавать их на тарелку желатин покрытием. Добавить дифференциации среды и инкубировать в течение ночи в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
    2. На следующий день, добавить среду для заражения (это будет варьироваться в зависимости от вируса). отсутствие Pen / Strep, содержащий BMP4 / A / P, используя 0,5 мл на одну лунку 6-луночного планшета Используйте СМ. Добавить вирус Сендай для MOI = 1. Выдержите в течение 8 часов в инкубаторе с низким содержанием кислорода.
    3. Если дополнительные временные точки необходимы, удалить вирус, содержащий среду после 4 ч и заменить его BMP4 / A / P CM. Собирают клеткидля выделения РНК с использованием клеточного скребка.
    4. Определить эффективность вирусной инфекции, выполняя QRT-PCR для генов , участвующих в вирусной реакции 18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор In Vitro Дифференциация hPSCs

Это в пробирке протокол дифференцировки начинается с недифференцированных ЭСК , выращенных на MEFs, которые перешли на фидерных свободные условия для прохода по одному (Рис . 1А) В то время как мы описали дифференцировку ЭСК в этом протоколе, мы использовали этот протокол успешно дифференцировать hiPSCs в трофобластических клетки. Переход к вн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представили основные шаги для дифференциации ЭСК в трофобласта клеток-предшественников. Этот протокол недавно был оптимизирован для быстро дифференцировать ЭСК с добавлением активин / сигнализации Узловое ингибиторов, увеличивая дифференциацию клеток трофобласта и избежать образования мезодермы клетки-предшественники, которые обычно наблюдаются при одной только BMP4 лечения. Система BMP4 модель позволяет для изучения самых ранних стадиях спецификации трофобласт клонов человека и расширения. Кроме того, эта система мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фондом формулы исследований здоровья Пенсильвании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Замена сывороткиInvitrogen10828-028В данном протоколе это называется «заменой сыворотки».
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-глютаминInvitrogen10828-028
Пенициллин/стрептомицинInvitrogen15140-155
2-меркаптоэтанолSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Коллагеназа типа IVInvitrogen17104-019
Ингибитор горных пород Y27632Calbiochem688000
Облученные CF1 MEFGlobalStem6001GMEF могут быть получены из эмбриона на 13,5-й день и облучены.
0,22 & микро; m шприцевой фильтрMilliporeSLGS033SS
инкубатор с низким содержанием кислорода Heracell 150iHeracell/VWR89187-192Достаточно любого инкубатора для культуры тканей, способного регулировать концентрацию кислорода.
БМП4НИР D Systems314-BP-01M
A 83-01R& D Systems2939/10
PD173074НИР D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol используется для выделения общей РНК.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231В данном протоколе это называется «внеклеточным матриксом».

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082(2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

4Activin NodalsiRNA

Похожие статьи