Методическая статья

Всеобъемлющая процедура для оценки

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55271

⸱

4 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

Плохое понимание эффективности нанолекарств in vivo препятствует их клиническому воплощению. Здесь описаны процедуры оценки in vivo поведения нанолекарств от рака на системном, тканевом, одноклеточном и субклеточном уровнях у иммунокомпетентных мышей с опухолями. Этот подход может помочь исследователям определить перспективные нанолекарства от рака для клинической трансляции.

Аннотация

Вдохновленные успехом предыдущих нанолекарства рака в клинике, исследователи произвели большое количество новых композиций в последнее десятилетие. Тем не менее, лишь небольшое количество нанолекарства были одобрены для клинического использования, в то время как большинство нанолекарства в условиях клинического развития, привели к разочаровывающим результатам. Одним из основных препятствий для успешного клинического перевода новых нанолекарства рака является отсутствие точного понимания их работы в естественных условиях. Эта статья имеет строгую процедуру , чтобы охарактеризовать поведение в естественных условиях нанолекарства в опухоли мышей при системной, ткани, одноклеточных и субклеточном уровнях посредством интеграции позитронно - эмиссионной томографии, компьютерной томографии (ПЭТ-КТ), методы Радиоактивность количественной оценки , проточной цитометрии, и флуоресцентной микроскопии. Используя этот подход, исследователи могут точно оценить новые рецептуры наноразмерных в соответствующих мышиных моделях Canceр. Эти протоколы могут иметь возможность определить наиболее перспективные нанолекарства рака с высоким потенциалом поступательной или для помощи в оптимизации рака нанолекарства для будущего перевода.

Введение

Наномедицина смещает парадигму развития лечения рака 1. Вдохновленный огромным клиническим воздействием предыдущих нанолекарства рака, таких как liposome- и альбумина на основе nanotherapies 2, 3, многие новые препараты были произведены в последнее десятилетие. Однако недавние исследования клинического успеха перевода этих рака нанолекарства показывают , что лишь немногие из них были одобрены для клинического использования 4, 5. Одним из основных препятствий для клинического перевода новых нанолекарства рака является их ограниченная улучшение терапевтического индекса по сравнению с непосредственным введением свободных терапевтических соединений 6. В качестве такой, точной оценки производительности в естественных условиях нанолекарства на системном, тканевом и клеточном уровнях в доклинических моделях животных имеет важное значение для IDENTIFу тех, с оптимальными терапевтическими индексами для будущего клинического перевода.

Наноматериалы могут быть радиоактивно для количественной характеристики в живых животных с позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ), которая имеет превосходную чувствительность и воспроизводимость среди всех методов клинической визуализации 7. Например, 89 Zr-меченные длинные циркулирующие нанолекарства были охарактеризованы в мышиных моделях рака 8, 9, 10, а также в других моделях болезни 11. Кроме того, кровь полувыведения и биораспределение нанолекарства может быть в значительной мере оценены с использованием естественных условиях измерения экс Радиоактивность в отдельных тканях 8. Поэтому радиоактивной позволяет для количественной оценки нанолекарства на системных и тканевых уровнях.

Важно отметить, что radiolabeleD нанолекарства как правило, не могут быть проанализированы в одноклеточных или субклеточном уровнях в связи с ограниченным пространственным разрешением радиоактивного сигнала. Таким образом, флуоресцентное мечение оказывается комплементарной модальности для оценки наночастиц с помощью оптических методов визуализации , таких как проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии 12. С этой целью, наночастицы , меченные радиоактивными изотопами и флуоресцентные метки могут быть количественно оценены в естественных условиях с помощью ядерной томографии и экс виво путем подсчета радиоактивности, и они также могут быть широко охарактеризованы на клеточном уровне оптических изображений.

Ранее мы разработали модульные процедуры , чтобы включать радиоактивные и флуоресцентные метки в различные наночастицы, в том числе липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) , 11, липосом 9, 10, полимерных наночастиц, фрагментов антител и nanoemulsions 10, 13. Эти меченые наночастицы позволили количественной характеристики в соответствующих моделях животных на разных уровнях, которые руководствуются оптимизацию этих наноматериалов для их конкретных применений. В текущем исследовании, цель состоит в том, чтобы использовать наночастицы-липосомальной наиболее авторитетных наномедицина платформа 14 -как пример для демонстрации комплексных процедур для создания двойной меченных наночастиц и тщательно охарактеризовать его в классическом сингенная меланома B16-F10 модели мыши 15 , Из результатов, мы уверены, что это наночастицами характеристика подход может быть адаптирован для оценки других нанолекарства рака в соответствующих моделях мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедура состоит из двойного радиоактивного и флуоресцентным наночастиц, в естественных условиях ПЭТ-КТ, экс естественных условиях измерений биораспределению и экс естественных иммунным окрашиванием и проточной цитометрии анализа. Все эксперименты на животных были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Memorial Sloan Kettering Cancer Center мимо.

1. Получение двойного меченых липосом

Примечание: Сингенные B16 опухоли меланомы может быть вызван инъекцией 300000 B16-F10 клеток в заднюю бока мышей C57BL / 6 под анестезией с вдыханием 2% -isoflurane содержащего кислород. Используйте стерильные реактивы и инструменты в стерильной рабочей области во время операции. После операции, осторожно наблюдать за животными, пока их выхода из наркоза. Положите животных обратно в их клетках только тогда, когда они вновь обрести полное сознание и подвижность. Дом их в стерильных помещениях для животных с ксенотрансплантированной опухолей. Опухоли с размером300 мм 3 идеально подходят для определения характеристик наночастиц в связи с их выраженной повышенной проницаемости и удержания эффектов (ЭПР), которые могут увеличить накопление наночастиц. Подробные протоколы представлены ниже.

  1. В круглодонную колбу, растворяют в смеси 20 мг липида в 2 мл хлороформа , содержащих 1,2-dipalmitoyl- зп глицеро-3-phophocholine (ДПФХ), холестерин, 1,2-disearoyl- зп глицеро 3-фосфоэтаноламин-поли (этиленгликоль) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-дефероксамин (DSPE-ДФО) 8, и 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-дисульфокислоты ( DiIC12 [5] -DS) при мольном соотношении 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% и 0,1%, соответственно.
    Примечание: Этот липидный состав очень похож на липосомного препарата доксорубицина , используемой в настоящее время в клинике 2. Полученные липосомы из нашей процедуры будет точно имитировать производительность в естественных условиях клинической nanomedicине.
  2. С помощью роторного испарителя для удаления органического растворителя и образованием тонкой липидной пленки при комнатной температуре. Добавьте 20 мл PBS и гомогенат, в течение 30 мин, чтобы генерировать наночастицы липосомальных с помощью 3,8-мм наконечник и ультразвуковую обработку и амплитуду 30 Вт, при условии достаточной охлаждением на льду.
  3. Центрифуга липосом раствор при 4000 х г в течение 10 мин для удаления комков и мыть наночастицы с PBS, с использованием центробежной фильтрации (молекулярная масса отсечки (MWCO:. 100 кДа) для удаления свободных липидов и остаточный органический растворитель концентрате липосом, что будет остаются в верхней камере, и передавать их в новую пробирку. липосомы могут храниться в холодильнике в PBS в течение 1 недели перед последующими шагами.
  4. Для контроля качества, характеризуют липосом методом динамического рассеяния света (DLS). В частности, смешайте 50 мкл липосом с 950 мкл PBS, а затем перевести смесь в проклейки кювете. Поместите кювету в анализатор и измерить частицуразмеры и распределение их по размерам. Размеры частиц и их распределение по размерам (индекс полидисперсности (ИПД)), как ожидается, будет 90 - 120 нм и 0,1 - 0,2 соответственно.
  5. Для радиомечения, смешать очищенные липосом, что эквивалентно 2 мг липидов, в PBS при рН от 6,9 до 7,1 с 1 мКи 89 Zr-оксалата при температуре 37 ° С в течение 2 ч в трубке 1,5 мл, (общий объем: ~ 100 мкл). Удалите свободный, непрореагировавший 89 Zr под действием центробежной фильтрации (MWCO = 100 кДа), аналогично шагу 1.3. Промыть ретентата стерильной PBS и разбавить его до нужного объема. Радиохимический выход должен составлять 80 - 95%.
    ВНИМАНИЕ! Работа с радиоактивными веществами строго регулируется. Учебные заведения должны быть сертифицированы и обеспечивают необходимые условия, обучение персонала, а также строгий контроль за использованием радиоактивных веществ. Исследователи должны получить надлежащую подготовку и носить средства индивидуальной защиты и дозиметрии кольца / значки при обращении с радиоактивностью.
  6. Определение радиохимической чистоты из радиоактивно меченных липосом с помощью вытеснительной радио-ВЭЖХ, которая , как правило , должна быть более 98% 10. Радиохимические степень чистоты ниже, чем 95%, свидетельствуют о недостаточной промывки на стадии 1.5.
  7. После того, как радиомечения, определяют размер наночастиц методом динамического рассеяния света. Размер и ППД , как ожидается, будет в том же диапазоне, что и измерения на этапе 1.4 10.
    Примечание: Если радиоактивные образцы не допускаются в проточной цитометрии или флуоресцентного микроскопа, нерадиоактивного физ Zr-оксалат может быть использован для обозначения липосом на стадии 1.5. Эти нерадиоактивных липосом имеют одинаковые характеристики с их радиоактивными аналогами. Изображен этой процедуры предусмотрено на фиг.2.

2. В Vivo ПЭТ-КТ и биораспределении двойственных меченных липосом

  1. Вводят около 100 мкл двойственных меченных липосом шIth около 300 мКи радиоактивности в сдерживали мышей с меланомой (C57BL / 6, женщина, 10 - 16 недель) через их хвостовые вены, при температуре около 10 мКи 89 Zr / кг массы тела.
  2. Для того, чтобы определить период полураспада, забор крови из хвостовой вены от наркотизированных животных под 2% изофлуран-содержащим кислород, используя 28-G шприцы для инсулина. Собирают кровь (10 - 20 мкл) в предварительно взвешенную труб через 2 мин, 15 мин, 1 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч и 48 ч после инъекции. Взвесить кровь по разности, определяют содержание радиоактивности с помощью гамма-счетчика, и рассчитать концентрацию радиоактивности в процентах от введенной дозы на грамм (% ID / г).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру, описанную в помещении, оборудованном системой анестезии, клетки восстановления, систем отопления и биологически опасных капотом. Убедитесь в том, что животные полностью восстановиться и получить нормальную подвижность после процедуры перед передачей их из клеток для восстановления на проведение клетки. Дом на опухолью животных в помещениях, предназначенных для животных, которым вводилирадиоактивные материалы.
  3. 24 или 48 ч после инъекции липосом, изображения мышей в малых животных MicroPET-томографа 10. Поместите наркозом животное в горизонтальном положении на животе и держать его под наркозом. Администрирование 2% изофлуран-кислород через носовой конус. Применение глазной мази, чтобы ее глаза перед сканированием, чтобы предотвратить их от высыхания.
  4. Выполнение ПЭТ статической записи сканирования всего тела по меньшей мере 50 миллионов совпадающих событий, с приблизительной продолжительностью 15 мин. Установите окно синхронизации энергии и совпадений при 350-700 кэВ и 6 нс, соответственно. Затем выполнить 5-минутный компьютерная томография (КТ). Установите рентгеновской трубки с напряжением 80 кВ и токе 500 мкА; КТ сканирование использует 120 вращательные шаги в общей сложности на 220 градусов с примерно 145 мс на кадр 10.
  5. После сканирования ПЭТ-КТ, немедленно принести в жертву мышей от асфиксией диоксидом углерода и подтверждают гибель от pinchiнг лап животных. После подтверждения выполнения цервикальной дислокации.
  6. Удалить кровь в тканях мыши сначала разрезав правое предсердие и затем введением 20 мл PBS в левый желудочек, а затем собирают соответствующие ткани , такие как опухоли, печени, селезенки, легких, почек, мышц, и другие 16.
  7. Взвесить ткани, измеряют их содержание радиоактивности гамма - подсчета 8, 9, и рассчитать накопление ткани радиоактивности в виде процента от введенной дозы на грамм (% ID / г).

3. Ex Vivo Проточная цитометрия и Иммунологическое

Примечание: Вводят около 100 мкл флуоресцентных липосом в мышей с меланомой через хвостовую вену в дозе 0,5 мг красителя на килограмм массы тела. Если радиоактивные образцы не допускаются в проточной цитометрии и флуоресцентного микроскопа, должны быть использованы нерадиоактивные липосом.

  1. Жертвоприношение мышей 24 часа после инъекции, как в шаге 2.5, и собирать опухоли, которые должны храниться в холодном PBS.
  2. Для проточной цитометрии, выполните следующие действия 17:
    1. Приготовьте ферментный коктейль, состоящий из смеси очищенного коллагеназы I и II (4 ед / мл), гиалуронидазы (60 ед / мл) и ДНКазы I (60 ед / мл) в проточной цитометрии буфере (PBS с 0,5% BSA и 1 мМ ЭДТА).
    2. Смешать 100 мг опухолевой ткани с помощью 200 мкл ферментного буфера коктейль в пробирку 1,5 мл и кости ткани на мелкие кусочки тонких ножниц. Добавить еще 1,3 мл ферментный коктейль в трубку и передать его содержимое на 6-луночный планшет.
    3. Взболтать 6-луночного планшета на горизонтальном шейкере помещают внутрь печи C 37 ° в течение 60 мин при 60 оборотах в минуту.
    4. Промыть гомогената ткани с проточной цитометрии буфером 3 раза, чтобы получить суспензию единичных клеток.
    5. Пятно клетки с коктейлем из антител, специфичных к биомаркеров, включая CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, и CD31 (1: 200 разбавление для всех антител, информация клон представлена ​​в таблице материалов). Определение соответствующих типов клеток и определить их среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) от DiIC12 (5) -ds в каждой популяции клеток с соответствующим проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.
  3. Для иммуноокрашиванием, выполните следующие действия:
    1. Поместите опухоль в кассету, заполненную оптимальной резки среднего (ОКТ) и заморозить его на сухом льду.
    2. Сделайте 6 мкм замороженных срезов из опухолевой ткани и поместите их на гистологию стеклах; участки должны охватывать самые большие поперечные сечения опухоли, которые обеспечивают наиболее представительную информацию о ткани.
    3. Пятно биомаркеров (например, CD31 для эндотелиальных клеток) , представляющие интерес с соответствующими антителами (например, анти-CD31, клон MEC13.3). Закрепить секции с параформальдегидом; блокировать их с соответствующими сывороточный видового происхождения вторичных антител; incubели с первичными антителами в течение 12 ч при температуре 4 ° С, а затем с вторичными антителами в течение 2 ч; и, наконец, промывают PBS и покрывают покровных стеклах. Изображение окрашенные слайды с Leica вертикально конфокальной SP5 микроскоп 13, 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показан обзор процедуры. На рисунке 2 представлена принципиальная процедура синтеза двойственных-меченых липосом , описанных в шаге 1 , 10. На рисунке 3 изображен представитель ПЭТ-КТ изображение (рисунок 3а), радиоактивностью Количественное определение из ПЭТ (рис 3b), в крови период полураспада (3в) и биораспределени (рисунок 3d) ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола:

Высокое качество с двумя метками липосом является ключом к получению стабильных результатов в течение длительного периода времени. Свободные флуоресцентные красители или 89 ионов Zr может генерировать совершенно различные модели таргетинга и должны быть полностью удалены во время стадии очистки. Кроме того, если иммунная система существенно влияет на экспериментальную производительность наномедицинскими рака, использование иммунокомпетентных мышин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не могут разглашать информацию.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить докторов Хелен Сэлмон и Мириам Мерад из Медицинской школы Икана в Маунт-Синай за предоставленные клетки B16-F10-YFP и за их экспертные советы по мышиным моделям меланомы. Авторы также благодарят Центр визуализации животных, Центр радиохимии и молекулярной визуализации зондов и Центр молекулярной цитологии Мемориального онкологического центра им. Слоуна-Кеттеринга (MSK) за их поддержку. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) и P30 CA008748 (грант центра MSK). Авторы также благодарят Центр молекулярной визуализации и нанотехнологий (CMINT) в центре MSK за финансовую поддержку (T.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DPPC Авантилипиды850355
холестеринаSigma-AldrichC8667
DSPE-PEG2000Авантилипиды880120P
DSPE-DFOДомашняя110634Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DSAAT Bioquest22051
Центробежный фильтрVivaproductsVS2061
Ротационный испарительBuchiR-100
Радио-ВЭЖХShimadzu HPLC с 2 насосами LC-10ATN/A
89Zr-оксалатMSKCCСинтезирован в собственном производствециклотрон TR19/9 с переменным лучом (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CTSiemensInveon Micro-PET/CT
Gamma counterPerkinElmer2470-0150
Проточная цитометрияBD BiosciencesFortessaЛюбых многопараметрических анализаторов проточной цитометрии будет достаточно
C57BL/6 мышейJackson Laboratories
B16-YFP клетки меланомыHome MadeN/ASalmon et al., Immunity, 2016
Ly6C (клон HK1.4) --APC-Cy7128025Biolegend
MHCII (M5/114/152) --APC107613Biolegend
CD45 (30-F11) --BV510103137Biolegend
CD64 (X54-5/7.1) --PE-Cy7139313Biolegend
CD11b (M1/70) --BV605101237Biolegend
CD3 (17A2) --BV711100241Biolegend
CD31 (13.3) --PE561073Biolegend
CD11c (M418) --PerCP-Cy5.5117327BD Biosciences
CD31 (13.3) без флуорофора550274BD Biosciences

Ссылки

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
  3. Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
  4. Juliano, R. Nanomedicine: is the wave cresting? Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).
  5. Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
  6. Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
  7. Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
  8. Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
  9. Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
  10. Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. , (2016).
  11. Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. , (2015).
  12. Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
  13. Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
  14. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
  15. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
  16. Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
  17. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065(2014).
  18. Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. , (2015).
  19. Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123(2015).
  20. Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
  21. Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).
  22. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).
  23. Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

89ex vivo

Похожие статьи