Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55273

⸱

5 апреля 2017 г.

 , 
1Department of Medicine, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали модульную систему скрининга с высокой пропускной способностью для обнаружения новых соединений в отношении микобактерий туберкулеза, нацеливание внутриклеточных и в-бульоне растущих бактерий, а также цитотоксичность против клетки - хозяина млекопитающего.

Аннотация

Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза (ТБ), является ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. В связи с возросшим распространением туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) существует реальная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий против инфекций M. tuberculosis. Традиционно соединения оцениваются на основе их антибактериальной активности в условиях роста in vitro в бульоне; тем не менее, результаты часто вводят в заблуждение для внутриклеточных патогенов, таких как M. tuberculosis, поскольку фенотипические условия скрининга в бульоне значительно отличаются от фактических условий заболевания в организме человека. Скрининг ингибиторов, которые работают внутри макрофагов, традиционно был затруднен из-за сложности, изменчивости инфекции и медленной скорости репликации M. tuberculosis. В этом исследовании мы сообщаем о новом подходе к быстрой оценке эффективности соединений на жизнеспособность M. tuberculosis в модели макрофагальной инфекции. Используя комбинацию анализа цитотоксичности и анализа жизнеспособности M. tuberculosis в бульоне, мы смогли создать систему скрининга, которая генерирует всесторонний анализ интересующих соединений. Эта система способна производить количественные данные по низкой цене, доступной для большинства лабораторий, и в то же время обладает широкими возможностями масштабирования для использования в крупных промышленных условиях.

Введение

Микобактерии туберкулеза, возбудитель туберкулеза (ТБ), является ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Drug-чувствительный туберкулез поддается лечение заболевания, которое требует несколько антибиотиков на срок от 6 месяцев. Несмотря на то , поддающееся лечению заболевание, смертность от туберкулеза, по оценкам, 1,5 миллиона в 2015 году 1. За последние 10 лет, увеличивались озабоченность по поводу распространенности лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. С множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (МЛУ-ТБ) определяется как туберкулез, который устойчив к по меньшей мере, к изониазиду (изониазид) и рифампицин (РМП), а большинство штаммов МЛУ-ТБ также устойчивы, чтобы выбрать препараты второго ряда ТБ, ограничивая тем самым возможности лечения , Последствия лекарственной устойчивости создают большую проблему для лечения пациентов с сочетанной инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ); 400000 пациентов по всему миру умерли от ВИЧ-ассоциированного туберкулеза в 2015 году 1. Disappointingly, пищевых продуктов и медикаментов США AdministРацион одобрил только один новый препарат против туберкулеза с МЛУ-ТБ, bedaquiline, в течение последних 40 лет 2. Прогресс в поиске более и более короткие терапии ТБ крайне необходимы для того, чтобы оставаться впереди в борьбе с ТБ и МЛУ-ТБ.

Традиционно, экраны наркотиков ТБ проводят в условиях , в пробирке роста в среде для роста, в результате чего соединения добавляют к растущей культуре , и их эффективность в уничтожении микроорганизмов , которые определяются путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) на твердой среде. Как КОИ отсчеты трудоемкие, занимает много времени, и дорого, различные косвенные методы были разработаны для решения этой проблемы. Такие способы включают в себя жизнеспособность анализа Alamar Blue 3, определение флуоресценции 4 из зеленого флуоресцентного белка (GFP) или люминесценции 5 из люциферазы-экспрессирующих бактерий, а также оценку общего аденозинтрифосфата (AТП) 6, 7.

Типичный ТБ характеризуются туберкулезной инфекцией M. легкого, где бактерии проживают и реплицировать внутри фагосом альвеолярных макрофагов 8. Простой экран фенотипического в бульоне может удовлетворить внеклеточные патогены; Однако, в исторической перспективе, ударил соединение против микобактерий туберкулеза , идентифицированное с помощью этого метода часто не оправдали ожидания во время последующих этапов проверки в моделях инфекции. Мы полагаем, что препарат ТБ лучше всего проводить в внутриклеточной модели инфекции клетки-хозяина. Тем не менее, внутриклеточные модели обладают многими технологическими и биологическими барьерами для скрининга (HTS) развития с высокими пропускной способностью. Большое препятствие является сложность инфекционного процесса, на примере многочисленных этапов и сложного удаления внеклеточных бактерий в промежутке между стиркой. Второе основное препятствие является длительным время повторноquirements, как обнаружение роста, обычно проводимой КОЕ в расчете на культуральных планшетах, это процесс, который занимает более 3 недель, чтобы закончить. Одно решение для замены счетчиков КОИХ было обеспечено автоматизированной флуоресцентной микроскопией в сочетании с люминесцентными бактериями. Однако это решение требует первоначальных инвестиций оборудования, которое вне досягаемости для многих научно-исследовательских лабораторий. Простой, недорогой и болезни соответствующего метода HTS бы значительно улучшить процесс обнаружения наркотиков.

В этом исследовании мы сообщаем о новой, модульной системе HTS, которая направлена на обеспечение быстрого и высоко масштабируемый, экономичный, анализа , пригодный для определения активности соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза. Эта система состоит из трех модулей: (я) внутриклеточных, (II) цитотоксичность, и (III) в бульоне-анализах. В сочетании конечный результат обеспечивает полное описание составных свойств, с дополнительной информацией как с потенциальным механизмом действия. Это СБНreening системы были использовано в нескольких проектах с различными библиотеками соединений , которые способом действия цели, включая анализ наркотики синергии 9, стимуляция аутофагии 10, а также ингибирование микобактерий туберкулеза -secreted фактор вирулентности (неопубликованный). Соединения неизвестного способа действия также были изучены 11. Модифицированная версия этого метода была также принята нашим промышленным партнером в качестве основного метода скрининга для выявления новых соединений против внутриклеточных микобактерий туберкулеза 11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Бактериальный штамм и рост среднего

  1. Сделать декстрозу альбумина и соли исходного раствора (ADS) путем солюбилизации 25 г бычьего сывороточного альбумина, 10,0 г декстрозы и 4,05 г хлорида натрия в 460 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизовать ADS и хранят при температуре 4 ° С.
  2. Сделать 7H9 бульон добавлением 4,7 г 7H9 порошка и 2 мл глицерина в 900 мл очищенной воды. Автоклав 7H9 бульона при 121 ° С в течение 10 мин и дать ему остыть до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Сделать 7H9ADST добавлением 100 мл ADS и 0,5 мл Tween80 в 900 мл бульона 7H9. Хранить при 4 ° С.
  3. Взвешивают 50 мг сульфата канамицина и растворяют в 1 мл деионизованной воды; конечная концентрация составляет 50 мг / мл. Фильтр-стерилизовать и хранить при -20 ° С. Добавьте 0,5 мл канамицина исходного раствора на 1 л 7H9ADST.
    Примечание: Эта среда должна быть свежей, так масштабировать объемы надлежащим образом в соответствии с размером культуры.
  4. Grow микобактерии в 7H9ADST с добавлением канамицина в отстаивании культуры. Встряхнуть культуру ежедневно и разбавить его до того, как OD600 достигает 1,0, чтобы избежать образования комков.
    Примечание: Этот штамм туберкулеза М. используется для разработки этого метода был H37Rv , трансформированные плазмидой pJAK2.A 12. pJAK2.A является интегративной плазмиду на основе вектора pMV361, что позволяет экспрессию на высоком уровне светлячка гена люциферазы из промотора hsp60 и может быть выбран с помощью канамицина.

2. THP-1 Средний и обслуживание

  1. Добавить 50 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мл 200 мМ L-глутамина до 500 мл среды RPMI 1640, чтобы сделать среду RPMI неполной (приблизительно 10% FBS и 2 мМ глутамина).
  2. Поддержание культуры клеток ТНР-1 согласно стандартному протоколу 13. Если коротко, то растут ТНР-1 клеток в RPMI неполной среды, сохраняя при этом плотность клеток 0,2 до 1 млн на мл среды между памудрецы.

3. Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием люциферазы-экспрессирующих М. туберкулеза H37Rv

  1. Измерьте оптическую плотность активно растущей бактериальной суспензии на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Вычислить плотность бактериальной , используя коэффициент пересчета 0,1 OD 600 = 3 × 10 7 бактерий на мл.
  2. Пипетировать из бактерий достаточные для множественности инфекции (MOI) 10: 1 в новую пробирку центрифуги. Гранулы при 3000 мкг в течение 10 мин и отсасывает жидкость. Добавляют 50 мкл сыворотки крови человека до 450 мкл RPMI1640. Шкала громкости в соответствующие значения для эксперимента.
  3. Для того, чтобы opsonize бактерии, ресуспендируют осадок при плотности 1 × 10 8 бактерий на 500 мкл RPMI 1640 , содержащей 10% сыворотки человека. Разрешить смесь инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Определить плотность клеток культуры ТНР-1 путем подсчета с помощью гемоцитометра и перевернутой microscoфизическое воспитание
  4. Гранулы клетки в стерильных центрифужных пробирках при 100 мкг и 37 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в среде RPMI неполным при плотности 1 миллиона клеток на мл. Добавить форболовый-12-миристат-13-ацетата (PMA) в / мл конечной концентрации 40 нг.
    Примечание: Это будет называться дифференциации смеси.
  5. Зерноуборочный опсонизированным M. туберкулез с ТНР-1 дифференциации смеси при MOI 10: 1 и аликвоту окончательную смесь в количестве 100 мкл на лунку в 96-луночных плоскодонных белой тарелке. Регулярно смесь перемешивают, чтобы обеспечить однородность. Дайте дифференцировка и инфекции , чтобы продолжить в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
  6. Промыть лунки дважды 100 мкл RPMI каждого. Добавьте соединения разводили до желаемой концентрации в RPMI неполной и инкубировать в течение 3-х дней.
  7. Аспирируйте среду из лунок. Добавьте 50 мкл реагента люциферазы анализа в каждую лунку. Уплотнение пластин с тransparent клеевые шпатлевки пластины. Разрешить 5 мин инкубации при 22 ° С, а затем получить отсчет в люминометре на 1 с на лунку.

4. Анализ цитотоксичности , используя 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразоли (МТТ) 14

  1. Дифференцирование клетки ТНР-1 в среде RPMI с добавлением неполного 40 нг / мл РМА в прозрачных 96-луночных планшетах. Поддержание плотности клеток 1 млн на мл и аликвоты 100 мкл на лунку. Разрешить дифференцировка продолжать в течение ночи при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
  2. Аспирируйте среду из лунок и промыть их дважды RPMI 1640. Добавьте соединения разводили в среде RPMI неполных в лунки. Выдержите в течение 3-х дней.
  3. Растворить 0,5 г МТТ в 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), чтобы сделать исходный раствор 5 мг / мл. Стерильный фильтр и хранят при -20 ° С, в защищенном от света; то лучше сделать это решение свежим.
  4. 2,5 ч Beforе конец инкубационного периода 3-х дней, добавляют по 25 мкл раствора МТТ в каждую лунку и завершить инкубационный период.
  5. Готовят 50% N, N - диметилформамид (ДМФ) путем смешивания 250 мл ДМФ с 250 мл деионизированной воды.
  6. Подготовка буфера для экстракции МТТ следующим образом: Взвешивают 100 г SDS в бутылке 500 мл и добавляют 300 мл 50% ДМФ. Нанести низкотермичное, чтобы позволить SDS растворяться. Добавляют 10 мл чистой уксусной кислоты и 12,5 мл 1 М HCl. Заполните до отметки 500 мл с 50% ДМФ; окончательный состав буфера для экстракции составляет 50% ДМФ, 20% SDS, 2,5% уксусной кислоты и 2,5% 1 М соляной кислоты.
  7. В конце периода лечения, добавляют 100 мкл буфера для экстракции (подогретой до 45 ° С, чтобы растворить любые кристаллы) в каждую лунку. Разрешить смесь инкубируют в течение ночи при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2. Измерить оптическую плотность при 570 нм.
    Примечание: Анализ цитотоксичности лучше всего проводить параллельно с внутриклеточнойЭкран улар используя ту же партию-и возраст клеток ТНР-1.

5. В-бульоне активность анализ с помощью резазурин Assay 3

  1. Grow микобактерии в 7H9ADST к середины логарифмической фазы (~ 0,5 - 0,8 OD 600). Развести культуру с 7H9ADST до 0,01 OD 600. Развести соединений в 7H9ADST в 2 раза концентрации испытаний и аликвоты по 100 мкл каждого разведенного соединения в каждую лунку.
  2. Передача 100 мкл разбавленного бактериальной суспензии в каждую лунку. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе в течение 5 дней. Растворяют 10 мг резазурин в 100 мл деионизированной воды и стерильный фильтр.
  3. Добавить 30 мкл раствора резазурин и следить за изменением цвета после 48 часов; бактериальный рост обозначается преобразование цвета от синего до розового.
    Примечание: Количественный анализ также может быть выполнена путем измерения либо флуоресценции при длине волны 590 нм с возбуждением при 530 - 560нм или поглощение при 570 нм и 600 нм 15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Высокая пропускная способность внутриклеточного скрининга с использованием микобактерии , выражающую ген люциферазы

Рисунок 2A и Таблица 1 содержит необработанные данные , собранные люминометра, выражены в относительных единицах люминесцентными (RLU), показывающий влияние возрастающей концентрации ТБ рифампицином препарата на микобактерии туберкулеза внутри клеток ТНР-1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы создать простой и экономически эффективный метод HTS с использованием человеческой внутриклеточной модели инфекции для микобактерий туберкулеза. Туберкулез является человек заболевание , характеризующееся инфекции альвеолярных макрофагов микобактерий туберкулеза. Из-за проблем биологической безопасности, исследование с участием биологических моделей как бактерии и клетки-хозяева были использованы в прошлом. Тем не менее, было показано , что использование ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов в отношении данной работы.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ассоциацией легких Британской Колумбии и Mitacs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640Sigma-AldrichR5886
L-глутаминSigma-AldrichG7513
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific12483020
Middlebrook 7H9Becton, Dickinson and Company271210
Tween80Fisher ScientificT164
Альбумин, бычий pH7Affymetrix10857
ДекстрозаFisher ScientificBP350
Хлорид натрияFisher ScientificBP358
канамицина сульфатFisher ScientificBP906
PMASigma-AldrichP8139
MTTSigma-AldrichM2128
N,N- Диметилформамид (ДМФ)Fisher ScientificD131
1 М Гидрохлориновая кислота (HCl)Fisher Scientific351279212
уксусная кислотаFisher Scientific351269
SDSFisher ScientificBP166
РезазуринАльфа АесарB21187
ДМСОСигма-ОлдричD5879
ГлицеринFisher ScientificBP229
THP-1Американская коллекция типовых культурTIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-луночная белая пластина с плоским дномCorning3917
95-луночная прозрачная пластина с плоским дномCorning3595
Запайщик прозрачных пластинСпектрофотометр Thermo Fisher ScientificAB-0580
Thermo Fisher ScientificBiomate 3
Микропланшетный спектрофотометрBiotekEpoch
Applied BiosystemsTropix TR717

Ссылки

  1. WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
  2. USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
  3. Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
  4. Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
  5. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
  6. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  7. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57(2010).
  8. Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
  9. Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
  10. Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
  12. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
  13. ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
  14. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
  15. Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
  16. Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
  17. Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
  18. Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
  19. Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
  20. Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
  21. Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
  22. Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
  23. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
  24. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960(2014).
  25. Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
  26. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777(2010).
  27. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114(2014).
  28. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).
  29. Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

THP1
Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.