Методическая статья

Методы самостоятельной интеграции Megamolecular биополимеров на сушильный воздух-LC интерфейс

DOI:

10.3791/55274

⸱

7 апреля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ сушки-индуцированной самостоятельной интеграции megamolecular биополимеров на кристаллической поверхности раздела воздух-жидкость здесь предусмотрено. Эта методика будет полезна не только для понимания макроскопических потенциалов биополимеров, но и в качестве метода оценки для мягких материалов в биомедицинских и экологических областях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые организмы, которые используют воду всегда склонны к сушке в окружающей среде. Их деятельность движет биополимеров на основе микро- и макро-структур, как видно в случае движущейся воды в сосудистых пучков и увлажнение воды в слои кожи. В этом исследовании мы разработали метод оценки влияния растворов жидкости на водной основе кристаллического (LC), состоящих из биополимеров на сушке. Как LC биополимеры имеют megamolecular вес, мы решили изучить полисахариды, белки цитоскелета и ДНК. Наблюдение биополимерных растворов в процессе сушки в поляризованном свете обнаруживает milliscale уверенность в интеграции, начиная с неустойчивой поверхности раздела воздух-LC. Динамика водных растворов биополимеров LC может контролироваться путем выпаривания воды из одной боковой открытой ячейки. Путем анализа изображений , снятых с помощью кросс-поляризованного света, можно признать пространственно-временные изменения в параметре ориентационного порядка. Этаметод может быть полезен для характеристики не только искусственных материалов в различных областях, но и естественная жизнь тканей. Мы считаем, что это обеспечит метод оценки для мягких материалов в биомедицинских и экологических областях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сосредоточив внимание на жестких, стержнеобразных структур биополимеров, динамические мягкие материалы были использованы для различных применений, в том числе полисахарида биопленки матриц 1, «активные» гелей , состоящих из белков цитоскелета 2, и «ДНК - оригами» желаемых форм 3. Для уточнения структурных свойств, многие стратегии были изучены, например, просвечивающей электронной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Однако, поскольку эти методы в основном осуществляется в высушенном или статическом состоянии, то трудно объяснить динамические модели поведения в макроскопических масштабах, как это видно в реальных живых системах. Недавно мы успешно наблюдали динамическое поведение биополимеров на водной поверхности раздела воздух-LC через поляризованный свет 4. Во время визуализации ориентированной структуры во время сушки биополимераРешение, временные изменения показали уверенность в интеграции биополимеров на неустойчивой границе раздела воздух-LC.

Здесь мы опишем протокол для сушки LC биополимерных растворов на границе раздела воздух-LC с использованием поляризованных инструментов. В отличие от других анализов ЖК - фазы , которые не считают сушки 5, 6, были исследованы здесь динамика LC в процессе сушки путем оценки параметра ориентационного порядка в боковой проекции жидкой фазы в одну сторону, открытую клетку , Сочетание клеточного испарения и использование поляризованных разрешенный к макроскопическому мониторингу с контролируемым направлением испарения. Кроме того, можно было проверить записи сушки, сосредоточив внимание на кристаллических структуры адсорбированных микродоменов, которые пострадали от молекулярной массы, концентрации и т.д. Для того, чтобы продемонстрировать эффективность метода, сушка процессы основных биополимеров с жесткими формами стержней, такие как полисахариды, микротрубочки (МЦ), и ДНК, были исследованы. Мы выбрали эти биополимеры, потому что они являются типичными примерами иерархических макромолекул с megamolecular весов, и их межмолекулярные взаимодействия позволяют им сформировать LC состояние.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. инструменты

  1. Поляризация устройство
    1. Для построения поляризационного устройства, обеспечивает источник света с галогенной лампой, световод, поляризаторы, стадия образца, оптический рельс, стержень стоит, и камеры цифровых однообъективных зеркальной (рисунок 1C и материалы Списка для поляризации части устройства).

2. Приготовление раствора биополимера

  1. Полисахариды решения
    1. Растворите sacran 7 (0,5 г) в чистой воде (100 мл) при перемешивании при ~ 80 ° С в течение более 12 часов. Во время растворения, накройте контейнер с пластиковой пленкой, чтобы предотвратить испарение. Готовят водный раствор ксантановой смолы таким же образом.
    2. Охлаждают растворы при ~ 25 ° С, чтобы получить 0,5 мас% водных растворов.
    3. Центрифуга sacran раствора для удаления примесей (48400 Xg, 4 ° С, 1 ч, 3 тимэс).
  2. решение MT
    1. Готовят 0,5 вес% раствора тубулина (1 мл) в буфере Бриттона-Робинсона (80 мМ пиперазина , N, N '-бис (2-этансульфоновой кислоты) (ТРУБЫ); 1 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтил эфир) - N, N, N 'N' -tetraacetic кислота (ЭДТА); и 5 мМ MgCl 2, рН 6,8) на льду 8.
    2. Используйте 0,5 вес% раствора тубулина (50 мкл) и гуанозин-5' - [(α, β) -methyleno] трифосфат (GpCpp) (5 мкл) с получением GpCpp-раствора, содержащего тубулина (50 мкл). Инкубирую при 37 ° С в течение 3 ч, чтобы получить стабильное ядро ​​МТА.
      Примечание: Роль GpCpp заключается в поддержке формирования МТА и полностью подавить деполимеризации MT до тубулина.
    3. Смешайте 0,5 вес% раствора тубулина (950 мкл) и GpCpp-раствора, содержащего тубулина (50 мкл) при ~ 25 ° С в течение 1 дня для получения стабильного 0,5 вес% раствора МТ.
  3. раствор ДНК
    1. Готовят 0,5 вес% раствора ДНК (1 мл) в буферном растворе Трис-ЭДТА (10 мМ Трис, рН 8,0, с 1 мМ ЭДТА).
  4. Хранить 0,5 мас% растворов биополимера образца при 25 ° С в течение эксперимента сушки.

3. Сушка Эксперименты и наблюдения под кросс-поляризованном свете

  1. Решения в одной боковой открытой клетке (Фигура 1А)
    1. Вырезать лист кремния (см список материалов) в соответствующую форму с толщиной 1 мм (внутренний аспект 5-15 мм, 1 мм, а ~ 20 мм; Фигура 1А).
      1. Собрать один бок открытой клетки, состоящую из кремния распорки с внутренней размерностью 5-15 мм, 1 мм, а ~ 20 мм и два немодифицированных стеклянных слайдов (76 мм × 1 мм × 26 мм). Закрепите обе стороны ячейки с двойными зажимами заранее, чтобы раствор образца от утечки.
    2. Медленно добавляют каждый из 0,5% -ного раствора биополимера (100-300 мкл) с использованием ~ 1 мм пипетку пор по размерамт.е наконечник к каждой ячейке при ~ 25 ° C. Удалить пузырьки воздуха из клеток с использованием иглы шприца.
    3. Поместите клетки в печи с воздушной циркул при 60 ° С при атмосферном давлении в течение испарения; направление испарения противоположно направлению силы тяжести.
  2. Наблюдения под кросс-поляризованного света (рис 1B-1C)
    1. Обеспечить прямой видимый свет с помощью 100 Вт галогенной лампы с источником света плоской поверхности на обширной территории (80 мм х 80 мм). Регулировка поляризаторов до 45 ° и 135 ° , используя держатели (рис 1C).
    2. Закрепить позиции источника света, поляризаторы, стадию образца и камеры , используя оптический рельс и стержень стойку (рис 1C). Поместите образец стадию между двумя поляризаторами (расстояние между поляризаторами должно быть ~ 5 см). Установите камеру ~ 20 см от стадии образца, чтобы фокусировка.
    3. В заданные моменты времени, поместите образцы с шага 3.1.3 между Polarizers на сцене, параллельной плоскости XZ-и покрывают устройство с черным занавесом; реальное устройство показано на фиг.1C.
    4. Сфотографировать образцы через линейные поляризаторы скрещены с помощью цифровой однообъективного зеркалку со стандартным зум-объективом (см список материалов). Контроль параметров камеры, такие как фокусное расстояние, с помощью компьютерного программного обеспечения (см списка материалов).
  3. Пространственно-временной анализ интенсивности прошедшего света (рис 1C)
    1. Для того, чтобы оценить изменение параметра ориентационного порядка в процессе сушки, собирают фотографии каждый час в течение 24 часов.
    2. Измерение интенсивности прошедшего света вдоль оси в Z-направлении в виде серого значения , используя программу обработки изображений (например, ImageJ).
    3. Участок графика серого значения в зависимости от расстояния от верхней открытой стороны.
  4. Микроскопические наблюдения под перекрестно поляризованы светодиоднымт (рис 1D)
    1. Для проверки методов, сделать микроскопические наблюдения с поляризационного микроскопа , оснащенного ПЗС - камерой 9. Хранить замедляющей пластины первого порядка в пути прохождения света. Контролировать условия для фотографий с помощью программного обеспечения для ПК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование устройства , как показано на рисунке 1, сама-интеграция от микродомена к макродоменной на сушке радиоинтерфейс-LC оценивали (фигура 2А). В качестве первой демонстрации эксперимента сушки, два вида megamolecular полисахаридов, sacran (M W = 1,9 × 10 7 г моль -1) и ксантановая камедь (4,7 × 10 6 г моль -1), сравнивали. На фиг.2В показаны фотографии решений в клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это было иногда трудно фотокамере сфокусироваться на образце из-за интенсивности прошедшего света слишком низко. В таких случаях, помещая расширенную прозрачную пластиковую пленку на сцене помогли организовать фокус. Ограничение наблюдаемого разрешения зависит от объектива камеры, ~ 10 мкм, в этом случае. Наблюдаемое ограничение по толщине образца, Δy, зависит от максимальной интенсивности света лампы, ~ 10 мм в этом случае.

Преимуществом устройства , показанного на фигуре 1В

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом-в-помощь для молодых ученых (16K17956) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии, Киото технонауки центр, и MITANI Фонд исследований и развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
sacranGreen Science Materials Inc., ЯпонияИз Aphanothece sacrum.
Mw = 1,9 × 107 г моль-1
xantangum Taiyo Kagaku Co., JapanNeosoft XCFrom Xanthomonas campestris.
Mw = 4,7 × 106 г моль-1
tubulinCytoskeleton, Inc., СШАT240Из мозга свиньи.
GpCppJena Bioscience, ГерманияNU405L
пиперазин-N,N′ -бис(2-этанессульфоновая кислота)Sigma-Aldrichi, Co. LLC.P6757-500GТРУБЫ
этиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислотаDojindo Molecular Technologies, Inc.342-01314EGTA
MgCl2-6H2OWako Pure Chemical Industries, Ltd.135-15055
KOHWako Pure Chemical Industries, Ltd.162-21813гранула
ДНКSigma-Aldrich, Co. LLC.D1626Из семенников лосося.
Mw = 1,3 × 106 Da (~2,000 bp)
Буферный раствор Tris-EDTASigma-Aldrich, Co. LLC.T9285-100ML10 мМ Tris, pH 8.0, со
слайдовым стекломMatsunami Glass Ind., Ltd.,Япония S1111
силиконовый резиновый листAsone Co.6-611-32Толщина:
центрифуга1 мм Beckman-Coulter, Inc., СШАAvanti J-25оснащена роторным источником света JA-20
Sumita Optical Glass, Inc., ЯпонияLS-LHA
световодSumita Optical Glass, Inc., ЯпонияGF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80 мм и 80 мм
галогенная лампаUshio Inc., ЯпонияJCR 15V150WBN
держательSigmakoki, Co., Ltd.Испытательный столик KMH-80
Sigmakoki, Co., Ltd.Держатель образца TARW-25503L
Sigmakoki, Co., Ltd.Удилище SHA-25RO
Sigmakoki, Co., Ltd.Держатель столбов ROU-12-40
Sigmakoki, Co., Ltd.Держатель столбов RS-6-40
Sigmakoki, Co., Ltd.Держатель столбов RS-12-60
Sigmakoki, Co., Ltd.Держатель столбов RS-12-80
Sigmakoki, Co., Ltd.Перевозчик RS-12-130
Sigmakoki, Co., Ltd.CAA-25LS
Sigmakoki, Co., Ltd.CMH-2
Sigmakoki, Co., Ltd.OBA-500SH
lenstubeTomytech, BORGlenstube BK80φ, L25 mm 
lenstubeTomytech, BORGlenstube BK80φ, L50 mm 
многодиапазонныйTomytech, BORG80φ  
V-образная пластинаTomytech, BORGV-образная пластина 60S
держатель пластиныViexen, Co., Ltd.держатель пластины SX
EOS Kiss X7i Canon Inc., Япония8594B001со стандартным зум-объективом,  EFP 18-55 мм
фотографическое программное обеспечениеCanon Inc., ЯпонияEOS Utility
PCПоверхностный
BX51
тормозящая пластина первого порядкаOlympusU-TP530λ = 530 нм
ПЗС-камераOlympusDP80
фотографическое программное обеспечениеOlympuscellSens Стандартная
программа обработки изображений на основе JavaНациональный институт здравоохраненияImageJ
1 мМ EDTA Держатель фотоаппарата Средний оптический рельс поляризационный микроскоп Microsoft Olympus

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи