Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55297

⸱

26 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Описанные здесь протоколы позволяют изучать электрические свойства возбудимых клеток в наиболее неинвазивных физиологических условиях, используя эмбрионы рыбок данио-рерио в системе in vivo вместе с генетически кодируемым индикатором напряжения (GEVI) на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), селективно экспрессируемым в интересующем типе клеток.

Аннотация

Описанные здесь протоколы разработаны для того, чтобы позволить исследователям изучать клеточную коммуникацию без изменения целостности среды, в которой находятся клетки. В частности, они были разработаны для анализа электрической активности возбудимых клеток, таких как спинномозговые нейроны. В таком сценарии крайне важно сохранить целостность спинномозговой клетки, но также важно сохранить анатомию и физиологическую форму задействованных систем. Действительно, понимание того, как работает нервная система и другие сложные системы, должно основываться на системном подходе. По этой причине в качестве модельной системы был выбран живой эмбрион рыбки данио, и изменения напряжения мембраны спинномозговых нейронов были оценены без вмешательства в физиологические условия эмбрионов.

Здесь описывается подход, сочетающий использование эмбрионов данио-рерио с биосенсором на основе FRET. Эмбрионы рыбок данио характеризуются очень упрощенной нервной системой и особенно подходят для визуализации благодаря своей прозрачности, позволяющей использовать флуоресцентные индикаторы напряжения на плазматической мембране во время развития рыбок данио. Синергия между этими двумя компонентами позволяет анализировать электрическую активность клеток в интактных живых организмах, не нарушая физиологического состояния. Наконец, этот неинвазивный подход может сосуществовать с другими анализами (например, с записью спонтанных движений, как показано здесь).

Введение

Анализ системных компонентов in vivo позволяет ученым наиболее достоверно исследовать клеточное поведение. Это особенно справедливо, когда на исследуемую активность в значительной степени влияют взаимодействия клеток и клеток (как контактные, так и бесконтактные), как в нервной системе, где изменения напряжения мембраны приводят к общению между возбудимыми клетками. Понимание информации, закодированной этими электрическими сигналами, является ключом к пониманию того, как нервная система работает как в физиологических, так и в болезненных состояниях.

Для изучения электрических свойств клеток в самых неинвазивных физиологических условиях недавно были разработаны несколько генетически закодированных индикаторов напряжения 1 . В отличие от предыдущих поколений оптических датчиков напряжения (в основном чувствительных к напряжению красителей) 2 , GEVI позволяют проводить анализ in vivo интактной нейронной системы иИх выражение может быть ограничено конкретными типами клеток или группами.

Зародыш рыбок данио - это «субстрат» in vivo, чтобы воспользоваться большим потенциалом, связанным с GEVI. Фактически, благодаря своей оптической ясности и упрощенной, но эволюционно консервативной нервной системе, модель данио дает возможность простой идентификации и манипулирования каждым сотовым компонентом в сети. Действительно, применение GEVI Mermaid 3 на основе FRET привело к идентификации предсимптомных изменений поведения спинного моторного нейрона в модели бокового склероза далеких дам (ALS) 4 .

В следующем протоколе in vivo описано, как контролировать электрические свойства нейронов спинного мозга в интактных эмбрионах рыбок данио, выражающих Русалку в нейроно-специфическом манере. Более того, он демонстрирует, как фармакологически индуцированный чанGes в таких электрических свойствах могут быть связаны с изменением частоты эмбриональных спонтанных обмоток, стереотипной двигательной активности, которая характеризует поведение движения рыбок данио на самых ранних стадиях развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генерация плазмиды pHuC_Mermaid

ПРИМЕЧАНИЕ. Русалка - это биосенсор, созданный путем спаривания домена, чувствительного к напряжению (VSD) Ciona intestinalis (теперь Ciona robusta ) 5 датчиков напряжения, содержащих фосфатазу (Ci-VSP) с партнером FRET-флуорофорами Umi-Kinoko Green (mUKG: донор) и мономерной версией оранжево-флуоресцентного белка Kusabira Orange (mKOk: акцептор). Для этого биодатчика конформационные изменения домена VSD, вызванные деполяризацией мембраны, увеличивают близость донорных и акцепторных флуоресцентных белков, тем самым увеличивая перенос энергии между ними (увеличивая отношение FRET) 3 . VSD обеспечивает эффективную локализацию биосенсора на плазматической мембране. Нейронная экспрессия биосенсора (в спинном мозге, сигнал обнаруживается как в интернейронах, так и в моторных нейронах) достигается путем клонирования Mermaid opEn frame (ORF) под пан-нейронным промотором Zeb 6 .

  1. Амплифицировать путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) ORM русалки из плазмиды pCS4 + Mermaid 3 с ДНК-полимеразой Pfu (корректура) с использованием универсального праймера T3 и праймера Mermaid Sma I (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA), чтобы вставить рестрикционный сайт Sma I вверх по течению От ORF Русалки.
    1. Используйте следующую смесь ПЦР: 0,5 мкл ДНК-полимеразы Пфу, 7,5 мкл специфического 10-бутового буфера, 1 мкл 10 мМ dNTP, 2,5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 0,5 мкл (50 нг) препарата плазмиды и 1 мкл Мкл 20 мкМ исходных растворов каждого праймера в общем объеме 50 мкл.
    2. Нагревают смесь ПЦР в течение 15 с при 95 ° С, заправляют ее в течение 15 с при 50 ° С и удлиняют ее в течение 4 мин при 72 ° С в течение всего 35 циклов.
  2. Гель-очистить конкретный тупойПЦР-продукт с использованием коммерческого набора для очистки геля в соответствии с протоколом производителя.
  3. Клонировать фрагмент ДНК в тупой вектор pCMV-SC по протоколу производителя.
  4. Линеаризуют плазмиду, положительную по Mermaid (названную pCMV-SC_Mermaid) с рестрикционным ферментом Sma I для последующего введения промотора HuC.
    1. Настройте реакцию рестрикции следующим образом: 0,5 мкл (10 U) рестрикционного фермента Sma I, 2 мкл набора 10x буфера и 5 мкг плазмидной ДНК в общем объеме 20 мкл. Инкубируйте реакцию при 25 ° С в течение 1 часа.
  5. Гель-очистить расщепленную плазмиду, используя коммерческий набор для очистки геля по протоколу производителя.
  6. ПЦР-амплифицируют HuC-промотор (pHuC), ДНК-полимеразу Pfu и геномную ДНК данио-рыбок в качестве матрицы, используя пару HuC-специфических праймеров (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA и HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) и охватывая область в 13050 пар вверх по течению от ATG.
    1. Настроить смесь ПЦР, используя следующую схему: 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfu, 7,5 мкл специфического 10-кратного буфера, 1 мкл 10 мМ dNTP, 2,5 мкл ДМСО, 200 нг геномной ДНК и 1 мкл 20 мкМ Исходные растворы каждого праймера в общем объеме 50 мкл.
    2. После начальной стадии 2 мин при 95 ° С нагревают ПЦР-смесь в течение 15 с при 95 ° С, заправляют ее в течение 15 с при 50 ° С и удлиняют ее в течение 4 мин при 72 ° С в течение всего 35 циклов ,
  7. Гель-очистите специфический тупой продукт ПЦР с использованием коммерческого набора для очистки геля в соответствии с протоколом производителя.
  8. Лигируют эквимолярное количество очищенного pCMV-SC_Mermaid (стадия 1.5) и ДНК pHuC (этап 1.7) с использованием 1 мкл ДНК-лигазы T4 и 1 мкл специфического 10X-буфера в общем объеме 10 мкл. Инкубируйте реакцию в течение 16 ч при4 ° С.
  9. Превратите аликвоту компетентных клеток с 5 мкл реакции лигирования (шаг 1.8) в соответствии с инструкциями производителя.
  10. Выберите pHuC-положительные клоны (pHuC_Mermaid) промотором, вставленным в правильную ориентацию двойным расщеплением Sal I- Eco RV (сайт рестрикции Sal I был вставлен перед фрагментом промотора на стадии 1.6, тогда как сайт рестрикции Eco RV Расположен ниже по потоку от области полиаденилирования PolyA плазмиды pCMV-SC).
    1. Настройте реакцию рестрикции следующим образом: 0,5 мкл (10 U) как рестрикционных ферментов Sal I, так и Eco RV, 2 мкл набора 10X-буфера и 1 мкг ДНК pHuC_Mermaid в общем объеме 20 мкл. Инкубируйте реакцию при 37 ° С в течение 1 часа. Запустите реакции на агарозный гель.

2. Микроинъекция эмбрионов

  1. Перенести удобренные, напримерGs, полученных из штамма дикого типа (AB) или Sod1-G93R для взрослых рыбок данио 4 в 10-миллиметровую чашку Петри с использованием пластиковой пипетки.
  2. Промойте эмбрионы в холодной (4 ° C) рыбной воде и сразу же микроинъектируйте их в желток с 200 пг плазмиды pHuC_Mermaid с использованием микроинъектора (полное и подробное описание процедуры микроинъекции см. В ссылках 7 и 8).
  3. Используя пластиковую пипетку, перенесите эмбрионы в чашку Петри и инкубируйте их в рыбной воде при 28 ° C до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии развития (20-24 ч после оплодотворения, hpf) для следующих анализов.

3. Спонтанный анализ намотки хвоста

ПРИМЕЧАНИЕ. Оцените спонтанное поведение намотки хвоста у эмбрионов 20-24 hpf с или без лекарственного рилузола.

  1. Перенесите эмбрион в 90-миллиметровую круглую чашку Петри, наполненную рыбной водой, содержащую 0,2% ДМСО (машина рилузола), и вручную дехронизируйте ее с помощью twO щипцы ювелира с острыми кончиками. Инкубируйте эмбрион в течение 5 мин.
  2. Обнаружение хвостового намотки при RT в течение 1 мин видеозаписи с использованием цифровой камеры, установленной на стереомикроскопе. Приобретите временные ряды с временным разрешением 30 кадров / с.
  3. Рассчитайте частоту спонтанных хвостовых обмоток, подсчитав количество изгибов (как контралатеральных, так и ипсилатеральных) за единицу времени.
  4. Чтобы оценить влияние препарата рилузол, осторожно используйте пластиковую пипетку Пастера для переноса эмбриона на новую миску Петри 90 мм, наполненную рыбной водой, содержащей 5 мкМ рилузола.
    1. Инкубируйте эмбрион в течение 5 минут перед записью 1-минутного видео и проведением поведенческого анализа, как указано выше.

4. Настройка изображения для визуализации визуализации Mermaid Biosensor в живых эмбрионах: одновременное обнаружение сигналов донора и акцептора

  1. Установите эмбрионы 20 - 24 hpf в 1% агарозу с низкой температурой плавления в воде рыбы на37 ° C внутри 35-миллиметровой стеклянной тарелки. Ориентируйте эмбрионы по бокам. Подождите, пока агароза застынет при комнатной температуре.
  2. Перенесите изображение на тарелку перевернутого конфокала, установленного на инвертированном микроскопе. Определите двигательные нейроны, выражающие биосенсор с 20-кратным увеличением (0,7 числовая апертура, NA) путем возбуждения mUKG с длиной волны 488 нм аргонового лазера и регистрации его излучения между 495 и 525 нм.
  3. Для измерения FRET возбудите mUKG, донора пары FRET, с длиной волны 488 нм. Одновременно обнаруживают с резонансным сканером, работающим на частоте 8000 Гц в двунаправленном режиме, флуоресценцию, излучаемую донором (между 495 и 525 нм) и флуоресценцию, излучаемую акцептором mKOk (между 550 и 650 нм, каналом FRET). Если возможно, используйте лазер с длиной волны 473 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эффективность возбуждения донора будет несколько снижена (85% вместо 93% с 488 нм), но перекрестное возбуждение акцептора будет(От 17% с 488 нм до 9% с лазерной линией 473 нм).
  4. Чтобы уменьшить фототоксичность и отбеливание флуорофором, минимизируйте освещенность образца, уменьшив мощность лазерной линии (на окне пути луча программного обеспечения для сбора данных).
  5. Оптимизируйте возбуждение для соответствия параметрам усиления и смещения, которые заданы в начале эксперимента и сохраняются постоянными на протяжении всего сеанса. Чтобы установить смещение, измените цвет изображения на значения интенсивности (используя таблицу поиска Q), а при сканировании с выключенным лазером поверните ручку смещения (умное смещение) так, чтобы фоновые пиксели слегка увеличились Выше нуля. С помощью той же справочной таблицы, включив лазер во время сканирования, поверните ручку усиления (интеллектуальное усиление), чтобы максимизировать отношение сигнал / шум, избегая насыщенных пикселей.
  6. Используя открытые отверстия (2 воздушные единицы), приобретайте 16-битные изображения, чтобы обеспечить достаточный динамический диапазон для количественногоАнализов. Избегайте усреднения, чтобы увеличить скорость сбора и минимизировать фотообесцвечивание.
  7. В окне получения программного обеспечения в раскрывающемся меню выберите размер поля изображения размером 512 x 64 пикселя (размер пикселя: 605 нм).
  8. В окне режима сбора данных выберите xyt (время простоя на одной плоскости xy) в раскрывающемся меню и запишите изменения в напряжении нейронного нерва эмбриона, приобретя одну плоскость xy, установив параметры сбора для записи одного изображения каждые 30 Мс в течение 1 мин.
  9. Чтобы оценить влияние введения рилузола на деполяризацию мембран в одном и том же нейроне, приобретите новый набор данных через 5 мин после добавления рыбной воды, содержащей 5 мкМ рилузола.
  10. Для анализа FRET используйте макрос ImageJ Biosensor_FRET (выражающий одноцепочечные биосенсоры FRET.
  11. Оцените соотношение FRASE базальной мембраны каждого нейрона при t 1 как ((среднее значение FRET - фон FRET) / (средний уровень донора - фон донора)), где FRET и DonИли средняя интенсивность - средняя интенсивность флуоресценции, вычисленная в той же интересующей области (ROI), проведенной вокруг ячейки для каждого полученного канала, а FRET и фон донора - средняя интенсивность флуоресценции, рассчитанная в ROI поля зрения без флуоресцентного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное пошаговое описание использования плагина можно найти на веб-сайте www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Используйте графическое программное обеспечение для сравнения частоты, амплитуды и продолжительности деполяризации между различными экспериментальными парадигмами. Сравните две группы, используя непарный t- критерий Стьюдента, и считайте средние значения статистически различными при P <0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспрессирующий вектор, несущий кодирующую последовательность биосенсора на основе FRET на основе FRET под контролем пан-нейронального промотора pHuC, который стимулирует синтез белка исключительно в нервной системе, доставляли в одноцелевые оплодотворенные яйца с помощью микроинъекции в Для получения переходных трансгенных эмбрионов ( рис. 1 , Левая панель). После освоения метода микроинъекции процент положительных эмбрионов на Mermaid был близок к 10...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь протокол позволил нам исследовать связь между электрическими свойствами нервных нейронов эмбрионов эмбрионов рыбок данио и спонтанным нависанием, самой ранней стереотипной двигательной активностью, которая появляется около 17 hpf эмбрионального развития и длится до 24 hpf 10 .

Наш подход предоставляет исследователям инструмент для изучения нейронной системы интактных эмбрионов, полностью сохраняя сложность взаимодействия между клетками в развивающ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Симону Родигьеро за ее бесценную поддержку при анализе изображений FRET.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Низкая температура плавления Agarose Sigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ ДНК-полимераза Agilent Technologies - Stratagene Products Division600389
T3 Universal primer Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9280
Universal SmaI primer Eurofins
StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC тупой вектор Agilent Technologies - Подразделение Stratagene Products 
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 DNA ligasePromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 мм, чашка для визуализации со стеклянным дном Иbidi81151
щипцыSigma-AldrichF6521
СтереомикроскопLeica MicrosystemsM10 F
Цифровая камераLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 программное обеспечение Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Конфокальный
(инвертированный)Leica MicrosystemsTCS SP5
 Eppendorf Макрос Femtojet
ImageJ Biosensor_FRET 
ГрафПад Призма 6.0c ГрафПад Софтвер, Инк
240228 микроскоп Apple Микроинъектор

Ссылки

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRET
Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.