Описанные здесь протоколы позволяют изучать электрические свойства возбудимых клеток в наиболее неинвазивных физиологических условиях, используя эмбрионы рыбок данио-рерио в системе in vivo вместе с генетически кодируемым индикатором напряжения (GEVI) на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), селективно экспрессируемым в интересующем типе клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Описанные здесь протоколы разработаны для того, чтобы позволить исследователям изучать клеточную коммуникацию без изменения целостности среды, в которой находятся клетки. В частности, они были разработаны для анализа электрической активности возбудимых клеток, таких как спинномозговые нейроны. В таком сценарии крайне важно сохранить целостность спинномозговой клетки, но также важно сохранить анатомию и физиологическую форму задействованных систем. Действительно, понимание того, как работает нервная система и другие сложные системы, должно основываться на системном подходе. По этой причине в качестве модельной системы был выбран живой эмбрион рыбки данио, и изменения напряжения мембраны спинномозговых нейронов были оценены без вмешательства в физиологические условия эмбрионов.
Здесь описывается подход, сочетающий использование эмбрионов данио-рерио с биосенсором на основе FRET. Эмбрионы рыбок данио характеризуются очень упрощенной нервной системой и особенно подходят для визуализации благодаря своей прозрачности, позволяющей использовать флуоресцентные индикаторы напряжения на плазматической мембране во время развития рыбок данио. Синергия между этими двумя компонентами позволяет анализировать электрическую активность клеток в интактных живых организмах, не нарушая физиологического состояния. Наконец, этот неинвазивный подход может сосуществовать с другими анализами (например, с записью спонтанных движений, как показано здесь).
Введение
Анализ системных компонентов in vivo позволяет ученым наиболее достоверно исследовать клеточное поведение. Это особенно справедливо, когда на исследуемую активность в значительной степени влияют взаимодействия клеток и клеток (как контактные, так и бесконтактные), как в нервной системе, где изменения напряжения мембраны приводят к общению между возбудимыми клетками. Понимание информации, закодированной этими электрическими сигналами, является ключом к пониманию того, как нервная система работает как в физиологических, так и в болезненных состояниях.
Для изучения электрических свойств клеток в самых неинвазивных физиологических ус....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация плазмиды pHuC_Mermaid
ПРИМЕЧАНИЕ. Русалка - это биосенсор, созданный путем спаривания домена, чувствительного к напряжению (VSD) Ciona intestinalis (теперь Ciona robusta ) 5 датчиков напряжения, содержащих фосфатазу (Ci-VSP) с партнером FRET-флуорофорами Umi-Kinoko Green (mUKG: донор) и мономерной версией оранжево-флуоресцентного белка Kusabira Orange (mKOk: акцептор). Для этого биодатчика конформационные изменения домена VSD, вызванные деполяризацией мембраны, увеличивают близость донорных и акцепторных флуоресцентных белков, тем самым увеличивая перенос энергии между ними (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспрессирующий вектор, несущий кодирующую последовательность биосенсора на основе FRET на основе FRET под контролем пан-нейронального промотора pHuC, который стимулирует синтез белка исключительно в нервной системе, доставляли в одноцелевые оплодотворенные яйца с помощью микроинъекции в Для получения переходных трансгенных эмбрионов ( рис. 1 , Левая панель). После освоения метода микроинъекции процент положительных эмбрионов на Mermaid был близок к 10.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный здесь протокол позволил нам исследовать связь между электрическими свойствами нервных нейронов эмбрионов эмбрионов рыбок данио и спонтанным нависанием, самой ранней стереотипной двигательной активностью, которая появляется около 17 hpf эмбрионального развития и длится до 24 hpf 10 .
Наш подход предоставляет исследователям инструмент для изучения нейронной системы интактных эмбрионов, полностью сохраняя сложность взаимодействия между клетками в развивающ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Симону Родигьеро за ее бесценную поддержку при анализе изображений FRET.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Низкая температура плавления Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ ДНК-полимераза | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC тупой вектор | Agilent Technologies - Подразделение Stratagene Products | ||
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 мм, чашка для визуализации со стеклянным дном | Иbidi | 81151 | |
| щипцы | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Стереомикроскоп | Leica Microsystems | M10 F | |
| Цифровая камера | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 программное обеспечение | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Конфокальный | ||
| (инвертированный) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Eppendorf | Макрос Femtojet | ||
| ImageJ Biosensor_FRET | |||
| ГрафПад Призма 6.0c | ГрафПад Софтвер, Инк |
Ссылки
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
