Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

12.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55305

⸱

17 июля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Developmental and Stem Cell Biology, CNRS UMR3738, Department of Immunology, Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur UPMC, University Pierre et Marie Curie

В этой статье

Краткое содержание

В то время как инфильтрирующие макрофаги непрерывно набираются во взрослые ткани из циркулирующих предшественников, резидентные макрофаги засевают свою ткань во время развития, где они поддерживаются без дальнейшего введения от предшественников. Недавно были определены прародители для резидентных макрофагов. Здесь мы представляем методы картирования генетической судьбы резидентных предшественников макрофагов.

Аннотация

Макрофаги являются профессиональными фагоцитами из врожденного плеча иммунной системы. В стационарных, сидячих макрофагах встречаются во взрослой ткани, где они выступают в качестве фронтальных часовых инфекций и повреждения тканей. В то время как другие иммунные клетки постоянно обновляются из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), расположенных в костном мозге, показано, что линия макрофагов, известных как резидентные макрофаги, сохраняется в тканях без введения HSPC из костного мозга. Эта линия представлена ​​микроглиями в мозге, клетками Купфера в печени и клетками Лангерганса в эпидермисе среди других. Протеины кишечника и толстой кишки являются единственными взрослыми тканями, лишенными HSPC-независимыми резидентными макрофагами. Недавние исследования выявили, что резидентные макрофаги происходят от гемопоэза экстра-эмбрионального желточного мешка от предшественника (-ов), отличного от эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток (HSC). Среди желчного мешка окончательный гемопоэз, eRythromyeloid progenitors (EMP) вызывают как эритроидные, так и миелоидные клетки, в частности резидентные макрофаги. EMP генерируются только в желчном мешке между E8.5 и E10.5 дней развития, и они мигрируют в фетальную печень уже в процессе циркуляции, где они расширяются и дифференцируются, по крайней мере, до E16.5. Их потомство включает эритроциты, макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки, но только макрофаги, полученные из EMP, сохраняются до взрослого состояния в тканях. Временная природа возникновения ЭМП и временное перекрытие с генерацией HSC затрудняют анализ этих предшественников. Мы установили протокол картирования тамоксифен-индуцибельной судьбы, основанный на экспрессии промотора Csf1r рецептора макрофагов цитокинов, чтобы охарактеризовать клетки EMP и EMP in vivo с помощью проточной цитометрии.

Введение

Есть несколько последовательных, но перекрывающихся волн гемопоэтических предшественников во время развития, чье миелоидное потомство остается во взрослой жизни. Во-первых, унипотентные «примитивные» предшественники появляются в мешке желтка мыши 1 , 2 между E7.5-E8.25 и вызывают эмбриональные макрофаги без какого-либо моноцитарного промежуточного соединения. Являются ли макрофаги, полученные из примитивных предшественников, сохраняющимися во взрослом мозге, поскольку микроглия остается объектом активного исследования. Во-вторых, эритро-миелоидные прекурсоры (ЭМП) возникают в желчном мешке на E8.5, попадают в кровоток и колонизируют эмбрион. EMP выходят из эндогенного желчного мешка эндометрия в белково-зависимом эндотелиаль-гемопоэтических переходах 3 , 4 . Хотя EMP может дифференцироваться в макрофаги в желчном мешке, они также колонизируют фетальную печень из эмбрионального дня (E) 9 5 и дифференцируютВ эритроциты, мегакариоциты, макрофаги, моноциты гранулоцитов и тучных клеток 6 . Макрофаги, происходящие от ЭМП, проявляют пролиферативную способность в тканях развития и взрослых. Независимо от того, что макрофаги, полученные из EMP, обходят моноцитарную стадию дифференциации, все еще противоречивы, поскольку очень мало известно об их пути дифференциации 7 , 8 . Наконец, гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) появляются на E10.5 внутри собственно эмбриона из области аорта-гонад-мезонефроса и мигрируют в фетальную печень. HSC с долговременной репопуляционной способностью обнаруживаются только после E11 (на стадии 42 сомитовой пары) 9 . Там они расширяются и отличаются от E12.5 до тех пор, пока окончательный гематопоэз не начнет переходить в костный мозг, который становится преобладающим местом производства клеток крови в течение постнатальной жизни 10 .

SpА также общие иммунофенотипические маркеры до сих пор мешали нашей способности различать специфический вклад этих волн эмбриональных гемопоэтических предшественников. В то время как как EMP, так и HSC генерируются в зависимом от Runx1 образом и экспрессируют транскрипционный фактор Myb и рецептор фактора роста Csf1r (Colon-Stimulating Factor 1 Receptor, также известный как Macrofage Colony Stimulating Factor Receptor), среди прочих, EMP можно отличить от HSC по их отсутствию лимфоидного потенциала, как in vitro, так и in vivo , отсутствие долговременного потенциала репопуляции и отсутствие поверхностной экспрессии маркера линии Sca-1 11 . Генетические модели картирования судьбы необходимы для характеристики онтогенеза макрофагов, поскольку они позволяют нацеливать эмбриональных предшественников на специфические для клеток и специфичные по времени. Здесь мы представляем протокол сопоставления судьбы, используемый в нашей лаборатории, для различения двух линийС макрофагами, обнаруженными в большинстве взрослых тканей: HSC-производные инфильтрирующие макрофаги и HSC-независимые резидентные макрофаги.

Живые макрофаги тканей были прослежены до Myb-независимых клеток-предшественников, экспрессирующих цитокиновый рецептор Csf1r 12 и присутствующих в эмбрионе на E8.5-E10.5 с использованием трех дополнительных стратегий картирования судьбы 6 . Для изучения гептапоэза желточного мешка без маркировки эмбриональных HSCs мы используем трансгенный штамм Csf1r MeriCreMer , экспрессирующий индуцируемый тамоксифеном слитый белок «улучшенной» рекомбиназы Cre и двух рецепторов эстрогена мыши (Mer-iCre-Mer) под контролем Промотор Csf1r. Следовательно, рекомбиназа Cre будет активна в Csf1r-экспрессирующих клетках в течение ограниченного временного окна. При использовании с репортерным штаммом, содержащим флуоресцентный белок ниже кассеты lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), это приведет к постоянномуГенетической маркировки клеток, присутствующих во время индукции, но также и их потомства. Введение в E8.5 активной формы тамоксифена, 4-гидрокситамоксифена (OH-TAM), метки EMP и макрофагов, без маркировки желточных мешочков, унипотентных «примитивных» предшественников или эмбриональных HSC. Таким образом, мы характеризовали иммунофенотип ЭМП и их потомство во время эмбрионального развития, а также оценивали вклад макрофагов, полученных из желточного мешка, в взрослые бассейны макрофагов. Требуется дальнейшая работа, чтобы охарактеризовать, можно ли маркировать макрофаги примитивных предшественников, используя этот подход, и могут ли они вносить вклад в пулы взрослых макрофагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры животных проводились в соответствии с утвержденным комитетом по уходу и использованию животных в Институте Пастера (CETEA).

1. В Utero Pulse Labeling в Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryos

  1. Подготовьте исходный раствор 4-гидрокситамоксифена (ОН-ТАМ, 50 мг / мл).
    1. Под дымностью откройте 25 мг флакона OH-TAM и добавьте 250 мкл этанола (100%).
    2. Перенесите раствор ОН-ТАМ в 2 мл микроцентрифужную пробирку с усеченным наконечником и вихрем с максимальной скоростью в течение 10 мин.
    3. Сонайтите 30 минут в ванне с ультразвуком.
    4. Добавьте 250 мкл касторового масла ПЭГ-35 под дымоход, чтобы получить исходный раствор 50 мг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Касторовое масло PEG-35 является растворителем с амфифильными свойствами, который связывает гидрофобные молекулы и растворяет их в водных растворителях.
    5. Вихрь в течение примерно 5 мин.С максимальной скоростью и ультразвуком 30 минут в ванне с ультразвуком.
    6. Аликвота 90 мкл (4,5 мг) на микроцентрифужную пробирку (1 аликвота на инъекцию).
    7. Хранить при температуре 4 ° C в течение 1 недели или при -20 ° C в течение длительного времени, как описано ранее 13 .
  2. Подготовьте исходный раствор прогестерона (10 мг / мл)
    1. Добавьте 250 мкл 100% этанола в 25 мг прогестерона для получения суспензии 10 мг / 100 мкл под дымкой. Вихрь мягко.
    2. Добавить 2250 мкл автоклавного подсолнечного масла, чтобы сделать раствор прогестерона 10 мг / мл под капотом.
    3. Вихрь в течение приблизительно 5 мин при максимальной скорости, аликвоте и хранении при 4 ° C. Обратите внимание, что решение сохраняется при сохранении.
  3. Администрация Тамоксифена
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриональное развитие оценивалось с учетом дня образования влагалищной пробки в виде эмбрионального дня (E) 0,5. Рекомбинация индуцируется однократной инъекцией на E8.5В беременных женщин Csf1r MeriCreMer 12 . Дополнение OH-TAM 37,5 мкг / г прогестерона для снижения частоты абортов после введения тамоксифена. Инъекция в 13:00 (для вагинального штепселя, наблюдаемого утром).
    1. Утром инъекции раздайте аликвоту раствора OH-TAM в течение 10 минут (или до полного ресуспендирования).
    2. Добавляют 360 мкл NaCl 0,9% под дымкой, чтобы получить раствор 10 мг / мл OH-TAM и полностью вихрь. Сонайтете до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и полностью ресуспендированным (по меньшей мере 30 минут).
    3. Предварительно нагрейте прогестерон до комнатной температуры.
    4. Смешайте 450 мкл ОН-ТАМ и 225 мкл прогестерона в микроцентрифужной пробирке. Vortex.
    5. Соносите по меньшей мере 10 минут и загружайте в 1 мл шприц с иглой 25G.
    6. В животноводческом средстве взвесьте беременную женщину (женщины Csf1r MeriCreMer находятся в инбредном генетическом фоне FVB и имеют типичный вес betwe25 и 33 г).
    7. Выполните внутрибрюшинную инъекцию, медленно впрыскивая вычисленный объем в мышь. После снятия иглы осторожно нажмите на проколотую рану и массируйте живот, чтобы распределить ОН-ТАМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекционная доза OH-TAM составляет 75 мг / кг, а доза прогестерона - 37,5 мг / кг. В таблице 1 приведен объем введения в беременных женщин.
Вес мыши (г) Общий объем для инъекций из смеси (мкл)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

Таблица 1: Объем инъекции 4-OH-тамоксифена (OH-TAM). Объем, необходимый для однократной инъекции при E8,5, 75 мкг / г (масса тела) ОН-ТАМ, дополненной 37,5 мкг на г прогестерона.

2. Рассечение желточного сахара (YS) и фетальной печени (FL)

ПРИМЕЧАНИЕ. Строгие стерильные методы не нужны при манипулировании эмбрионами, если только они не будут использоваться для долгосрочной культуры. Тем не менее рабочая зона должна быть чистой и покрыта фольгой под абсорбирующей бумагой.

  1. Подготовьте ледяной фосфатный буферный солевой раствор (PBS) и пищеварительную смесь (PBS, содержащую 1 мг / мл коллагеназы D, 100 ед. / Мл дезоксирибонуклеазы I (ДНКаза I) и 3% фетальной бычьей сыворотки).
  2. Жертвоприношение беременных женщин( Например, эмбриональная стадия E10.5).
  3. Зажмите кожу чуть более половых органов и сделайте небольшой разрез на средней линии ножницами. Потяните кожу к голове, чтобы полностью обнажить стенку корпуса без меха. Вырежьте мышцы живота, чтобы разоблачить внутренние органы и подтолкните кишечник, чтобы выставить два рога матки.
  4. С тупым щипцом среднего размера, возьмите жироуловитель, прикрепленный к яичнику, и осторожно потяните матку. Вырезать на шейном уровне рогов матки и поднимать рожки из брюшной полости. Удалите жироуловитель, чтобы полностью освободить рожки матки и вырезать рога с яичника с каждой стороны.
  5. Поместите рога в ледяную PBS в 10-миллиметровую чашку Петри. Быстро захватите мышечные слои матки на одной конечности (шейный конец) и сдвиньте мелкие ножницы между мышечным слоем и децидуальной тканью, чтобы освободить эмбрионы с окружающей децидуальной тканью.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мышцы имеют тенденцию к быстрому сокращениюR извлечение, поэтому этот шаг должен быть как можно быстрее.
  6. Используйте одну пару тонких щипцов, чтобы отрезать мембрану Рейхерта и плаценту.
  7. Аккуратно удалите мешок с желтком и поместите его в 24-луночный планшет для культуры тканей с 0,5 мл пищеварительной смеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе можно собрать эмбриональную кровь.
    1. Сразу же после отделения пупочных и желточных сосудов перенесите эмбрион в 12-луночный планшет для тканевой культуры, содержащий 10 мМ ледяной этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Обезглавьте эмбрион с помощью острых тонких ножниц, пытаясь ограничить как можно больше размягчение тканей. Инкубируйте на льду в течение 10-15 мин и собирайте ЭДТА, содержащую кровь.
  8. Удалите амнион, окружающий эмбрион.
  9. Для этапов
  10. Сократите голову эмбриона у насЩипцы или тонкие ножницы. Перенесите голову в 24-луночный планшет с 0,5 мл пищеварительной смесью.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Нейроэктодерму и мозг на более поздних стадиях дополнительно расчленены для анализа проточной цитометрии; Тщательно удалите окружающее сосудистое сплетение.
  11. Вырежьте эмбрион выше задней конечности и удалите передние конечности.
  12. Чтобы изолировать печень, откройте грудную клетку, используя пару тонких щипцов. Зажмите вперед к сердцу и осторожно потяните, используя второй пинцет, чтобы освободить органы от тела.
    1. Тщательно отделите фетальную печень от сердца и кишечника. Перенесите фетальную печень в 24-луночный планшет с 0,5 мл диетического раствора. Тщательно контролируйте передачу под рассекающим микроскопом.
  13. Соберите область хвоста (или любую другую часть эмбриона) для генотипирования с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Другие ткани и органы могут быть собраны у эмбрионов E10.5 для аналогичного анализа с использованием проточной цитометрии. Кровь, головаN, область аорта-гонад-мезонефроса (AGM), сердце и нейроэктодерма могут быть собраны в E10.5. На более поздних стадиях можно также собирать легкие, почки, селезенку и поджелудочную железу. Подробное описание вскрытия AGM на разных этапах развития было описано ранее 14 .

3. Обработка эмбриональных тканей для проточной цитометрии

  1. Инкубируйте органы (помещенные в пищеварительную смесь) в течение 30 мин при 37 ° C.
  2. Перенесите ткань и ферментативный раствор на сетчатый фильтр размером 100 мкм, помещенный в 6-луночный планшет для культивирования ткани, заполненный 6 мл буфера FACS (0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 2 мМ EDTA в 1x PBS). Механически диссоциировать, осторожно затирая черным резиновым поршнем 2 мл шприца, чтобы получить суспензию с одной клеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. С этого момента все шаги должны выполняться при температуре 4 ° C.
  3. Соберите суспензию клеток с помощью пипетки Пастера и перенесите в пробирку объемом 15 мл.
  4. СпиN в течение 7 мин при 320 × g при 4 ° С. Отбросьте супернатант путем аспирации.
  5. Ресуспендируют гранулу в 60 мкл Fc-блокирующего буфера (CD16 / CD32-блокирующее антитело, разведенное 1/50 в буфере FACS).
    1. Перенесите 50 мкл одноклеточной суспензии на лунку в 96-луночном планшете с круглым дном. Инкубируйте в течение как минимум 15 минут на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Окрашивание также может быть выполнено в 5-миллилитровых трубах FACS из полистирола при обработке небольшого количества образцов.
    2. Перенесите оставшиеся 10 мкл в 5-миллилитровую трубку FASS из полистирола, чтобы получить пул образцов из каждой ткани. Этот пул будет служить в качестве элементов управления ( то есть, незакрашенные образцы и флуоресцентные минус единицы (FMO) для каждого флуорохрома). Передайте 50 мкл пула для каждого флуоресцентного минус одного (FMO) контроля (по одному на флюорохром) на 96-луночный планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый контроль FMO содержит все антитела, связанные с флуорохромом, с панели антител, за исключением одногоКоторый измеряется. FMO используются для определения границ ворот и для контроля спектрального перекрытия в многоцветных панелях. Чтобы правильно учитывать изменения фона и аутофлуоресценции между различными тканями, важно подготовить эти контрольные образцы из пула образцов каждой ткани. Соответствующим контролем экспрессии YFP будут образцы из Cre-отрицательных эмбрионов, которые подтверждены генотипированием ПЦР.

4. Покрытие поверхностного антигена

  1. Подготовьте смесь антител в буфере FACS (таблица 2). Подготовьте 50 мкл смеси антител на образец.
    1. Используйте следующие антитела, связанные с флуорохромом: анти-CD45.2 (клон 104); Анти-CD11b (клон M1 / ​​70); Анти-F4 / 80 (клон BM8); Анти-AA4.1 (клон AA4.1); Anti-Kit (клон 2B8); И анти-Ter119 (клон Ter119).
    2. Подготовьте шесть антител для контроля FMO в буфере FACS. Подготовьте 50 мкл смеси антител на контрольный образец.
      НЕТTE: Разведение антител в смеси антител в два раза более концентрированное, чем конечная концентрация, указанная в таблице материалов. Для панели с шестью антителами, связанными с флуорохромом, готовится 6 контролей FMO. В таблице 2 представлен состав смеси антител и FMO для одной трубки.
Объем (мкл) антитела (конечный объем 50 мкл)
антитело клон Смешивание антител FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 Набор FMO FMO Ter119
анти-CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
анти-CD11b М1 / 70 0,5 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5
анти-F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
анти-AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
анти-Kit 2B8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,5
анти-Ter119 Ter119 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0
Буфер FACS 45,5 46,5 46 46,5 46,5 46 46

Таблица 2: Объем антител, используемых для окрашивания, и флуоресцентный минус один (FMO). Объем (мкл) антитела, необходимый для конечного объема 50 мкл.

  1. Добавьте 50 мкл смеси антител к образцам в 96-многолуночной планшете (конечный объем при окрашивании составляет 100 мкл). Осторожно пипетируйте вверх и вниз дважды и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
  2. Вращайте 96-многолуночную пластинку в течение 7 мин при 320 × g при 4 ° С и отбрасывайте супернатант. Ресуспендируют в 200 мкл буфера FACS.
  3. Повторите процедуру стирки (шаг 4.3) дважды с помощью 150 мкл буфера FACS.
  4. Отфильтруйте образцы и контрольные образцы (FMO и необработанные образцы пула) в 5 мл полистироловых труб через фильтр размером 70 мкм. Хранить на льду до момента приобретения.

5. Идентификация EMP и макрофагов YS с помощью проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол был оптимизирован с использованием 4-х лазерного проточного цитометра eqС лазером на 405 нм, фиолетовым лазером 488 нм, 562 нм желтым лазером и красным лазером 638 нм.

  1. Подготовьте компенсационные шарики для каждого связанного антитела в соответствии с инструкциями производителя. Используйте неокрашенные образцы и компенсационные шарики для оптимизации интенсивности лазера.
  2. Чтобы определить границы ворот, используйте FMO (флуоресценция минус один) для каждого антитела.
  3. Чтобы исключить мертвые клетки, добавьте 1 мкл DAPI (1 мг / мл) в пробирку (содержащую 200 мкл суспензии окрашенных клеток) за 1 мин до получения. Используйте сильный сигнал DAPI и параметр прямого рассеяния (FSC), чтобы выполнить исключение мертвых клеток и мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте программное обеспечение из проточного цитометра для рисования ворот во время захвата. Матрица компенсации и анализ могут быть выполнены после получения образца с использованием другого коммерчески доступного программного обеспечения.
  4. Используйте прямой и боковой разброс (FSC vs SSC), чтобы выполнять живые ячейки и дублетную дискриминацию из общих событий.
  5. Создайте флуоресцентные точечные графики на оси логарифмической шкалы и вытяните дочерние ворота, чтобы, во-первых, исключить эритроциты (Ter119 + ), а затем идентифицировать клетки-предшественники (Kit + ) и гемопоэтические клетки (CD45 + Kit neg ) (см. Рис. 1 ).
  6. Создайте гистограммы флуоресценции для количественной оценки эффективности маркировки YFP среди различных идентифицированных популяций YS ( рис. 2 ), печени плода ( рис. 3 ) и мозга ( рис. 4 ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Картирование генетической судьбы достигалось введением на E8.5 ОН-ТАМ в самок Csf1r-Mer-iCre-Mer, связанных с самцами, несущими репортер Rosa26-LSL-eYFP. В присутствии OH-TAM удаление стоп-кассеты приводит к постоянной экспрессии YFP в клетках, экспрессирующих Csf1r . Мы собрали две гемопоэтические ткани: желточный мешок и фетальную печень и негемопоэтическую ткань, нейроэктодерму, из эмбрионов на E10.5. Одноцепочечные суспензии были получены путем ферментативной и механической ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные волны гемопоэтических клеток-предшественников частично перекрываются в течение короткого периода времени, что делает анализ вклада каждой волны гематопоэза развития в иммунные клетки технически очень сложным.

Системы, индуцируемые тамоксифеном Cre, предлагают возможность маркировать определенные клетки во временном индуцибельном режиме и проводить анализ линии у эмбрионов или взрослых без необходимости в культуре ex vivo или in vitro или трансплантации. В...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят профессора Фредерика Гейссмана и профессора Кристиана Шульца за проницательные дискуссии; Д-р Ханна Гарнер за критическое чтение рукописи, д-ра Ксавьера Монтагутелли и д-ра Жана Жюберта и сотрудников животного объекта Institut Pasteur для поддержки с мышами; И Паскаль Дарденн и Вытаут Борейкайте, научный сотрудник Amgen, за их техническую помощь. Исследования в лаборатории EGP финансируются Институтом Пастера, CNRS, Cercle FSER (FRM) и стартовым пакетом от Institut Pasteur и консорциума REVIVE. LI поддерживается стипендией PhD от консорциума REVIVE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#5 Прямые щипцыFine Science Tools11251-20
MC19 / B Pascheff-Wolff Пружинные ножницы Fine Science Tools15371-92
8,5 см прямые ножницыFine Science Tools14090-09
Anti-Mouse Kit-PE (клон 2B8)BD Pharmingen5533551/200 разведение в FAC Buffer
Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (клон 104)Sony11491201/100 разведение в FAC Buffer
Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, клон AA4.1)eBioscience17-5892Разведение 1/100 в FACs Буфер
Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (клон Ter119)Biolegend5605121/200 разведение в FACs Buffer
Anti-Mouse F4/80-BV421 (клон BM8)BD Pharmingen123137/100 разведение в FACs Buffer
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (клон M1/70)BD Pharmingen5528501/200 разведение в буфере
FACsАнтимышиный CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc, клон 2.4G2)BD Biosciences553142
PBS 1xFischer Scientific12559069
фетальная сыворотка крупного рогатого скотаFischer Scientific11570506
коллагеназой D Roche11088882001
Дезоксирибонуклеаза ISigmaD4527-20KU
6-луночный планшет для культуры тканейDutscher Dominique353046
12-луночный планшет для культуры тканейDutscher Dominique353224
24-луночный планшет для культуры тканейFischer Scientific11874235
96 лунок U-образная нижняя культура тканей тарелкаDutscher Dominique353227
  Шприц Пластипак 2 мл Dutscher Dominique300185
Нейлоновая сетка 100 &микро; Сетчатые фильтры для ячеекDutscher Dominique352360
Нейлоновая сетка 70 & микро; m клеточные фильтрыDutscher Dominique352350
15 мл Falcon tubesDutscher Dominique352096
Stericup GP Millipore фильтрационный набор, 0,2 μ mDutscher Dominique51246
Бычья сыворотка альбуминSigmaA7906-500G
(Z)-4-ГИДРОКСИТАМОКСИФЕН 25мгSigmaH7904-25MGОсобую осторожность следует проявлять при приготовлении и работе с тамоксифеном и его производными. Всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты
ProgesteroneSigmaP3972Всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты
PEG-35 касторовое масло (Kolliphor/Cremophor EL)SigmaC5135
Подсолнечное маслоSigmaS5007-250ML
ЭтанолSigma24103-1L-R-DВсегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и используйте под вытяжкой
EDTASigmaE9884-500G
DAPI, 1 мл (1 мг/мл в воде)Научный10116287Fischer
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 проточный цитометрBeckman CoulterB75408
CytoFLEX Daily QC ФлюоросферыBeckman Coulter B53230
Набор шариков для захвата антител VersaComp (2x5 мл)Beckman Coulter B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/JЛаборатория Джексона19098
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JЛаборатория Джексона6148
1

Ссылки

  1. Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
  2. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  3. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  4. Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
  5. Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
  6. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  7. Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
  8. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
  9. Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
  10. Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
  11. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  12. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  13. Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
  14. Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
  15. Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
  16. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  17. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
  18. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  19. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  20. Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Csf1rKit CD45F480 CD11b
Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.