Мы описываем чувствительные прерывистые анализы на основе геля для изучения кинетики инициации запаздывающей нити с использованием репликационных белков бактериофага T7.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мы описываем чувствительные прерывистые анализы на основе геля для изучения кинетики инициации запаздывающей нити с использованием репликационных белков бактериофага T7.
Здесь мы предоставляем протоколы для кинетического исследования синтеза ДНК с отстающей цепью in vitro с помощью репликационных белков бактериофага T7. Репликисома Т7 является одной из простейших известных систем репликации, состоящей всего из четырех белков, что является привлекательной особенностью для биохимических экспериментов. Особый акцент сделан на синтезе рибонуклеотидных праймеров по геликазе примазы Т7, которые используются ДНК-полимеразой для инициирования синтеза ДНК. Поскольку механизмы репликации ДНК сохраняются на протяжении всей эволюции, эти протоколы должны быть применимы или полезны в качестве концептуального трамплина для исследователей, использующих другие модельные системы. Описанные здесь протоколы являются высокочувствительными, и опытный исследователь может провести эти эксперименты и получить данные для анализа примерно за один день. Единственное специализированное оборудование, которое требуется, — это инструмент с быстрым потоком, но это оборудование относительно распространено и доступно из различных коммерческих источников. Основными недостатками этих анализов, однако, являются использование радиоактивности и относительно низкая пропускная способность.
Репликация ДНК является сохраняющимся особенностью всех клеточной жизни. В то время как идентичность и количество компонентов репликации варьироваться в широких пределах, общие механизмы являются общими для эволюции 1. Здесь мы опишем гель на основе, разрывные кинетических экспериментов, с использованием радиоактивных субстратов, направленных на понимание кинетики отстающей нити синтеза ДНК в пробирке компонентами Т7 replisome. Механизм репликации бактериофага Т7 является очень простой, состоящий только из четырех белков (ДНК - полимеразы, GP5, а его коэффициент процессивности, E.coli тиоредоксин, бифункциональные праймаза-хе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Примечание: Соблюдайте все институциональные правила, касающиеся безопасного использования и утилизации радиоактивных материалов, в том числе, но не ограничиваясь этим, использование средств индивидуальной защиты, такие как перчатки, защитные очки, лабораторный халат, а также соответствующие акриловые щиты.
Примечание: Стандартный буфер состоит из 40 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 50 мМ глутамата калия, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА (этот буфер предварительно сделанный в концентрации 5х) и 0,3 мМ каждого из дНТФ. Белки репликации Т7 очищены , как описано 8, 9, 10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты , показанные на рисунке 1А , были получены , как описано в шаге 1 протокола, т.е. вручную путем выборки реакции синтеза праймера , катализируемый GP4 в условиях множественного оборота. Здесь целый ряд продуктов , после того, как гель - электрофореза можно наблюдать с помощью CTP , меченного 32 P в a-положении в реакциях синтеза праймера (Рис . 1А) Меченый предшественник, CTP, показывает сам.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Самым важным фактором при проведении этих экспериментов является наличие высокой активности очищенного фермента. В ходе работы с GP4, например, мы обнаружили, что хранение очищенного фермента в буфере (20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащей 50% глицерина при температуре от -20 & deg; С приводит к уменьшению удельная активность препарата в течение нескольких месяцев. Поэтому мы теперь флэш-замораживающие небольшие аликвоты очищенного GP4 в 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Мы благодарим сотрудников лаборатории C.C.R. за комментарии и С. Московица за подготовку рисунка. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения F32GM101761 (A.J.H.) и GM54397 (C.C.R.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Трис предустановленные кристаллы pH 7,5 | SIGMA | T4128 | |
| Трис основание | SIGMA | 93362 | |
| L-глутаминовая кислота моногидрат калийной соли | SIGMA | G1501 | |
| Гексагидрат хлорида магния | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-дитиотреитол | J.T. Baker | F780-02 | |
| Додецилсульфат натрия | MP Biomedicals | 811030 | |
| (этиленединитрило) Тетрауксусная кислота, динатриевая соль, дигидрат | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | радиоактивный, принимать защитные меры[ |
| γ-32P] АТФ | PerkinElmer | BLU502A | радиоактивный, принимать защитные меры |
| 100 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | четыре dNTP входит в состав набора |
| 100 мМ АТФ и CTP | Epicentre | RN02825 | входит в состав набора |
| NTP ssDNA конструктирует | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| Метанол | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| формамид | Thermo Scientific | 17899 | |
| бромофенол синий | SIGMA | B8026 | |
| Сайлен Ксианол | SIGMA | X4126 | |
| акриламид | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′ -метиленбисакриламид | SIGMA | M7279 | токсичный |
| Мочевина | Бостон Биопродукты | P-940 | |
| Борная кислота | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Инструмент для быстрого тушения | Корпорация «Кинтек» | РКФ-3&nбсп; | |
| Кинтек Эксплорер | Kintek Corp. | Н/Д | |
| Калейдаграф | Synergy Software | Н/Д |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.