Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК<em&gt; In Vitro</em&gt; С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Краткое содержание

Мы описываем чувствительные прерывистые анализы на основе геля для изучения кинетики инициации запаздывающей нити с использованием репликационных белков бактериофага T7.

Аннотация

Здесь мы предоставляем протоколы для кинетического исследования синтеза ДНК с отстающей цепью in vitro с помощью репликационных белков бактериофага T7. Репликисома Т7 является одной из простейших известных систем репликации, состоящей всего из четырех белков, что является привлекательной особенностью для биохимических экспериментов. Особый акцент сделан на синтезе рибонуклеотидных праймеров по геликазе примазы Т7, которые используются ДНК-полимеразой для инициирования синтеза ДНК. Поскольку механизмы репликации ДНК сохраняются на протяжении всей эволюции, эти протоколы должны быть применимы или полезны в качестве концептуального трамплина для исследователей, использующих другие модельные системы. Описанные здесь протоколы являются высокочувствительными, и опытный исследователь может провести эти эксперименты и получить данные для анализа примерно за один день. Единственное специализированное оборудование, которое требуется, — это инструмент с быстрым потоком, но это оборудование относительно распространено и доступно из различных коммерческих источников. Основными недостатками этих анализов, однако, являются использование радиоактивности и относительно низкая пропускная способность.

Введение

Репликация ДНК является сохраняющимся особенностью всех клеточной жизни. В то время как идентичность и количество компонентов репликации варьироваться в широких пределах, общие механизмы являются общими для эволюции ^1. Здесь мы опишем гель на основе, разрывные кинетических экспериментов, с использованием радиоактивных субстратов, направленных на понимание кинетики отстающей нити синтеза ДНК в пробирке компонентами Т7 replisome. Механизм репликации бактериофага Т7 является очень простой, состоящий только из четырех белков (ДНК - полимеразы, GP5, а его коэффициент процессивности, E.coli тиоредоксин, бифункциональные праймаза-хе....

Протокол

Примечание: Соблюдайте все институциональные правила, касающиеся безопасного использования и утилизации радиоактивных материалов, в том числе, но не ограничиваясь этим, использование средств индивидуальной защиты, такие как перчатки, защитные очки, лабораторный халат, а также соответствующие акриловые щиты.

Примечание: Стандартный буфер состоит из 40 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 50 мМ глутамата калия, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА (этот буфер предварительно сделанный в концентрации 5х) и 0,3 мМ каждого из дНТФ. Белки репликации Т7 очищены , как описано ^{8, 9, 10.}

Результаты

Результаты , показанные на рисунке 1А , были получены , как описано в шаге 1 протокола, т.е. вручную путем выборки реакции синтеза праймера , катализируемый GP4 в условиях множественного оборота. Здесь целый ряд продуктов , после того, как гель - электрофореза можно наблюдать с помощью CTP , меченного ³² P в a-положении в реакциях синтеза праймера (Рис . 1А) Меченый предшественник, CTP, показывает сам.......

Обсуждение

Самым важным фактором при проведении этих экспериментов является наличие высокой активности очищенного фермента. В ходе работы с GP4, например, мы обнаружили, что хранение очищенного фермента в буфере (20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащей 50% глицерина при температуре от -20 & deg; С приводит к уменьшению удельная активность препарата в течение нескольких месяцев. Поэтому мы теперь флэш-замораживающие небольшие аликвоты очищенного GP4 в 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трис предустановленные кристаллы pH 7,5	SIGMA	T4128
Трис основание	SIGMA	93362
L-глутаминовая кислота моногидрат калийной соли	SIGMA	G1501
Гексагидрат хлорида магния	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-дитиотреитол	J.T. Baker	F780-02
Додецилсульфат натрия	MP Biomedicals	811030
(этиленединитрило) Тетрауксусная кислота, динатриевая соль, дигидрат	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	радиоактивный, принимать защитные меры[
γ-32P] АТФ	PerkinElmer	BLU502A	радиоактивный, принимать защитные меры
100 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	четыре dNTP входит в состав набора
100 мМ АТФ и CTP	Epicentre	RN02825	входит в состав набора
NTP ssDNA конструктирует	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
Метанол	Macron Fine Chemicals	3017-08
формамид	Thermo Scientific	17899
бромофенол синий	SIGMA	B8026
Сайлен Ксианол	SIGMA	X4126
акриламид	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′ -метиленбисакриламид	SIGMA	M7279	токсичный
Мочевина	Бостон Биопродукты	P-940
Борная кислота	Mallinckrodt Chemicals	2549
Инструмент для быстрого тушения	Корпорация «Кинтек»	РКФ-3&nбсп;
Кинтек Эксплорер	Kintek Corp.	Н/Д
Калейдаграф	Synergy Software	Н/Д