Методическая статья

Использование первичных культур нейросферы для изучения первичных ресничек

DOI:

10.3791/55315

⸱

14 апреля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная ресничка принципиально важным в нервной пролиферации клеток-предшественников, дифференцировки нейронов и взрослых функции нейронов. Здесь мы опишем метод для изучения цилиогенеза и торговлей сигнальных белков ресничек в нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцированных нейронов с использованием первичных культур нейросфера.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная ресничка принципиально важна для пролиферации нейральных стволовых/прогениторных клеток и для дифференцировки нейронов во время эмбриональной, постнатальной и взрослой жизни. Кроме того, большинство дифференцированных нейронов обладают первичными ресничками, в которых размещаются сигнальные рецепторы, такие как рецепторы, связанные с G-белком, и сигнальные молекулы, такие как аденилатциклазы. Первичная ресничка определяет активность нескольких путей развития, включая звуковой путь ежа во время эмбрионального развития нейронов, а также функционирует в продвижении компартментализированной субклеточной сигнализации во время функции взрослых нейронов. Неудивительно, что дефекты первичного биогенеза и функции ресничек были связаны с аномалиями развития мозга, центральным ожирением, а также дефицитом обучения и памяти. Таким образом, крайне важно изучать первичный биогенез ресничек и транспортировку ресничек в контексте нейронных стволовых/прогениторных клеток и дифференцированных нейронов. Тем не менее, методы культивирования первичных нейронов требуют значительного опыта и не поддаются циклам замораживания-оттаивания. В этом протоколе мы обсуждаем методы культивирования смешанных популяций нейральных стволовых/прогениторных клеток с использованием первичных нейросфер. Методы культивирования, основанные на нейросфере, обеспечивают комбинированные преимущества изучения первичных нейральных стволовых/прогениторных клеток: податливость к множественным пассажам и циклам замораживания-оттаивания, потенциал дифференцировки в нейроны/глии и трансфицируемость. Важно отметить, что мы определили, что нейральные стволовые/прогениторные клетки, полученные из нейросферы, и дифференцированные нейроны реснитчатые в культуре локализуются в этих компартментах и локализуют сигнальные молекулы, имеющие отношение к функции ресничек. Используя эти культуры, мы далее описываем методы изучения цилиогенеза и ресничного транспорта в нейральных стволовых/прогениторных клетках и дифференцированных нейронах. Эти методы, основанные на нейросфере, позволяют нам изучать регулируемые ресничками клеточные пути, включая рецептор, связанный с G-белком, и передачу сигналов звукового ежа, в контексте нейронных стволовых/прогениторных клеток и дифференцированных нейронов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная ресничка является микротрубочек на основе динамического субклеточная отсек , который функционирует в качестве сенсорной антенны в координации клеточных сигнальных путей, в том числе Звуковой еж (Тсс) пути во время эмбрионального развития нейронов 1, 2, и на секции субклеточном сигнализации во взрослой нейрональной функции 3, 4 , Сигнальные компоненты этих путей, такие как рецептор Shh исправленного 5; Путь активатора Smoothened (SMO) 6; и Gpr161 7, сирота G-белком рецептор (GPCR) , которые негативно регулирует путь Shh, чтобы локализовать ресничек в динамической моде. Несколько GPCRs сообщалось, локализуется в реснички в нейронах в головном мозге 7, 8, 9, 10 SUP>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Дефекты ресничек и реснички генерируемых сигнальных путей влияют множественные ткани и все вместе известны как цилиопатии 17, 18, 19. Спектр болезни цилиопатии часто включает в себя психомоторный дефекты, такие как черепно - лицевые аномалии 20, 21, 22. Кроме того, первичные реснички в гипоталамических нейронах регулируют центральные пути сытости, и дефекты приводят к центральному ожирению 23, отражая ожирения у синдромальных цилиопатий , такие как синдром Барды Biedel 24. Кроме того, нейропептид рецепторы сигнализации в ресничках регулируют Centrаль сытость дорожки 11, 14. Цилиарная локализация аденилатциклазы III (ACIII) и GPCR , такие как рецептор соматостатина 3 в нейронах гиппокампа приводит к новым дефектам распознавания объекта и нарушению памяти 25, 26 и параллельна отсутствие целостности цилиарных 27. Аспекты развития ресничек генерируемых сигналов тесно связаны с гомеостазом ткани; в частности, реснички играют важную роль в прогрессировании Тсс-подтипа медуллобластомы , вытекающих из клеток - предшественников гранул в мозжечке 28, 29. Таким образом, первичные реснички играют важную роль в процессе эмбрионального, послеродовом и взрослых нейронов развития и функции.

Нейрональные стволовые клетки (NSC,) находятся в субвентрикулярной зоне (SVZ) бокового желудочек, то субгранулярная зона зубчатой ​​извилины гиппокампа, ажелудочковая зона третьего желудочка в гипоталамусе у млекопитающих 30, 31, 32. NSCs мультипотентны, обладают способностью к самообновлению, и имеют важное значение для развития мозга и регенеративной медицины 30. Большинство NSCs в СВЗЕ находится в состоянии покоя и обладает уединенной первичной ресничкой , что во многих случаях проходит к боковому желудочку 33. Первичные сигналы реснички через локализацию различных рецепторов, индуцирующую вниз по течению клеточных реакций, в частности , по отношению к Shh, TGF - beta, и пути киназы рецептора тирозина 2, 34, 35, 36. Так как первичные реснички проходят в боковой желудочек, она выдвинута гипотеза , что первичные реснички обнаружить цитокины в спинномозговой жидкости (CSF) , чтобы активировать NSCs 37 . Недавние исследования показали, что сигнальный путь Тсс и первичные реснички являются критическими для активации стволовых клеток в ремонте и регенерации нескольких тканей, в том числе обонятельного эпителия, легких, почек и 38, 39, 40, 41. Однако механизмы, с помощью которых CSF взаимодействует с NSC, и является ли первичными ресничками участвуют не известны. Прикрепленные NSCs в культуре реснитчатые; локализовать компоненты путей метаболизма SHH, такие как Smo и Gpr161 в ресничках; и Тсс отзывчивым 42. Таким образом, NSC, может служить в качестве важной модельной системы для изучения пути Shh, мерцательной торговли и нейронных путей дифференцировки. Кроме того, нейроны, дифференцированные из NSC, также могут быть использованы для анализов торговли людьми цилиарного.

Нейросферы состоят из кластеров свободно плавающих клеток, возникающих из пролиферации neuraл стволовых / клетки - предшественники , которые растут в присутствии специфических факторов роста и неадгезивных поверхностей 43, 44. Нейросферы служат важными в пробирке моделей культуры для изучения нейронных стволовых клеток / клеток - предшественников в нормальном развитии и болезнях 31, 45, 46, 47. Здесь мы описываем анализ нейросфера основе для культивирования нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцировки в нейроны / глии. В частности , мы подчеркиваем торговлю сигнализации компоненты ресничек нервных стволовых / клеток - предшественников и дифференцированных нейронов (рисунок 1). В отличие от культивирования первичных нейронов, первичных нейросферы относительно легко культуры, поддаются множественных пассажей и заморозить-оттаивания циклов, и может проходить дифференциацию в нейроны / глии. Важно отметить, что мы определили, что нейросфера полученных нейронныестволовые клетки / клеток-предшественников и дифференцированные нейроны в культуре мерцательные и локализовать сигнальные молекулы, имеющие отношение к функции цилиарной в этих отсеках. культуральные методы нейросферы основы могут служить в качестве идеальной модели системы для изучения цилиогенезом и цилиарные торговель NSCs и дифференцированных нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение Нейросферы из мозга мышей для взрослых

  1. Эвтаназии взрослой мыши (около 2 месяцев) от передозировки изофлурана. Дважды проверьте, что мышь перестала дышать и рассекает сразу же после смерти.
  2. Используя ножницы, сделать срединный разрез, чтобы открыть череп. Удалить мозг.
  3. Поместите мозг в холодном PBS в 10 см чашку на льду. Выполните все-Mount метод рассечение , чтобы получить SVZ от бокового желудочка 48.
  4. Поместите боковой желудочек в 1,5 мл пробирку, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубировать трубку в течение 15 мин при 37 ° С в водяной бане.
  5. Через 15 мин добавляют 500 мкл тормозящей среды и осторожно пипеткой 20 - 30 раз с 1 мл наконечником. Избегайте образование воздушных пузырьков во время пипетки.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для выживания клеток.
  6. Спин вниз клетки при 500 мкг в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают, добавляют 1 мл PBS и ресуспендируют тон клетки осторожно пипеткой 5x с 1 мл наконечником.
  7. Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
  8. (Необязательно) Если наблюдаются клеточные остатки, проходят клетки через 70 мкм-фильтр клеток.
  9. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра; в общем, около 30 000 - 60 000 клеток / SVZ получены.
  10. Пластина клетки от одного SVZ в 10 см чашку с 10 мл среды и культуры НСК при 37 ° C с 5% CO 2.
  11. (Необязательно) Чтобы избежать слияния между сферами 49, поместили 1000 клеток в одной скважине ультра-низкого связывания 6-луночный планшет , который предварительно заполненном 1,5 мл среды и культуры НСК при 37 ° С с 5% CO 2.
    Примечание: Через 5-7 дней, нейросфера может наблюдаться (фиг.2А). Период культивирования может отличаться в зависимости от возраста мыши или генетического фона.
  12. Добавляют 2 мл NSC среды каждые 3-4 дня, чтобы поддерживать культуру(Не удалить существующую среду).

2. Анализ дифференциации пропускной способностью нейросферы и цилиогенез испытаний

  1. Для анализа возможностей дифференциации, анализ нейросферы под прилипшими условиями дифференциации среды.
  2. Стерилизовать 12 мм круглые покровные автоклавированием или с помощью УФ-облучения до использования. Для культуры прикрепленных клеток, поставить стерилизовать 12 мм круглые покровного стекла в лунку 24-луночного планшета в асептических условиях.
  3. Шерсть покровного стекла в течение 10 с с 500 мкл 0,002% поли-L-лизин (PLL). Аспирируйте раствор и высушить его в течение 10-15 мин.
  4. Добавьте 500 мкл раствора ламинин (5 мкг / мкл). Инкубируйте покровного стекла в течение 1 ч при 37 ° С.
  5. Аспирируйте ламинин и добавьте 500 мкл среды или дифференциации среды НСК (недифференцированная контроль).
  6. Для анализа дифференциации, подобрать 100 - 200 мкм сферу с наконечником 200 мкл под микроскопом. Добавить5-10 нейросферы в каждую лунку планшета 24-луночного и культур в течение 7-10 дней в среде для дифференцировки.
  7. Для анализа недифференцированных нейросфер, добавьте 5-10 нейросфер в каждую лунку планшета 24-луночного и культуры в течение 1-2 дней в среде НСКА. Приложенные нейросферы распространяться и расти в виде монослоя (фигура 2В).
  8. После тщательного удаления среды, фиксации клеток с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем промывают PBS в два раза в течение 5 мин при комнатной температуре. Пластина может храниться при температуре 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
    Примечание: Для визуализации нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников в NSC среде и дифференцированных клеток в дифференциации среды, выполняют иммунное окрашивание против нестин (нейронные стволовые клетки / клеток-предшественников маркер), β-тубулина III (TUJ1 моноклональное, нейронный маркер), GFAP (глиального фибриллярного кислого белка , астроцитов маркер), и О4 (олигодендроцитов маркер) (фигура 2В-Е). Для анализа реснички, выполнять иммуноокрашивание против Arl13b (первичный CIЛия Маркер) и Gpr161 (цилиарный ХВГФ) (фигура 3).
  9. Установить крышку стекло с монтажным раствором на предметное стекло. Наклон слайд стекла для удаления избытка раствора.

3. Анализ цилиогенеза в нейросферах

  1. Для анализа клеток в интактных нейросферах иммунного окрашивания, передача 1 мл культуральной среды, содержащие несколько нейросфер в 1,5 мл пробирки и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин. Закрепить сферы с 4% (PFA), после удалени среды в течение 15 мин и промывают PBS. Спин вниз сферы при 500 х г в течение 8 мин, удаления надосадочной жидкости, и инкубировать сферы O / N с 30% сахарозы при 4 ° С.
  2. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл кончик и добавляют 500 мкл раствора OCT с использованием разреза 1 мл кончик. Обрежьте край наконечника, чтобы расширить отверстие, в октябре является вязким.
  3. Переносят раствор, содержащий OCT нейросферы в одноразовый плесени пластиковые замораживания (10 мм х 10 мм х 5 мм).
  4. Замораживание мстарый на сухом льду в течение не менее 15 мин.
  5. (Необязательно) Остановить эксперимент и сохранить форму в морозильной камере C -80 ° до 1 года.
  6. Нарезать участки с криостатом; толщина секций должна быть 15-30 мкм.
  7. Для визуализации первичной реснички в нейросфера, выполняют иммунное окрашивание против Arl13b (рисунок 4).

4. Культура и прохождение Нейросферы и прилипшие NSCs

  1. Прохождение нейросфера в то время как размер шара между 100-200 мкм; когда нейросферы слишком велики (300 мкм или выше), они не являются идеальными для экспериментов.
  2. Передача нейросферы в трубку 50 мл с использованием 1 мл наконечника и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин.
  3. Жидкость над осадком сливают с помощью аспиратора, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Количество трипсина варьирует в зависимости от количества сфер.
  4. Добавьте 500 мкл сыворотки среды и мягко трубыт в 20 раз с 1 мл наконечником.
  5. Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
  6. (Необязательно) Если клеточный дебрис или недиссоциированные нейросферы видны, проходят клетки через клетку-сито 70 мкм.
  7. Прохождение клеток в 10 см чашки при плотности 10000 клеток / см 2 в NSC среде; клетки будут готовы к следующему прохождению через неделю.
  8. (Необязательно) Чтобы заморозить клетки, добавить замораживание среды для генерации 500000 до 1000000 клеток / мл суспензии. Замораживание клеток с использованием крио-замораживание контейнеров; недиссоциированные нейросферы также могут быть заморожены.
  9. Для культуры прикрепленной, dillute клетки до 50000 клеток / см 2 на PLL- и ламинин покрытие покровных с НСК средой и культур в течение 1-2 дней.

5. Голодание и анализ ресничек

  1. Подготовьте голодание среды (таблица 1).
  2. 1-2 дней после первоначального плюноши и девушки адгезивных клеток после диссоциации, изменений в НСКЕ среду в одну лунке (контроль) и голодной среду в других скважинах (эксперимент).
  3. Культура прилипших клеток в течение 24 часов.
  4. Закрепить клетки с 4% PFA в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре и дважды промывают PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
  5. (Необязательно) Остановка эксперимента и хранить 24-луночные планшеты с покровными в PBS при 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
  6. Выполнение протокола иммунофлюоресценции для окрашивания 7, 50.
  7. Установите покровные с помощью монтажного раствора. Сушат предметное стекло O / N при комнатной температуре в темноте.
  8. Получение изображений на соединение микроскопа при необходимом увеличении. С помощью микроскопа, камеры и целей (40X / 1.3 масла и 63X / 1.4 масла), управляемый с помощью прилагаемого программного обеспечения. Возьмем достаточное количество Z-секции с интервалом 0,5-0,8 мкм (рисунок 5).
  9. Для количественного анализа локализации цилиарной вприлипшие клетки приобретают стеки изображений из 3-8 последовательных полей с сливающимися клетками, глядя в канал DAPI. Количественно число первичных ресничек с использованием ImageJ / Фиджи. Как правило, использует «Счетчик клеток» инструмент в ImageJ плагин> диалоговое окно для подсчета клеток с ХВГФ-положительной ресничек Анализа; максимальные проекции из стопок изображений также могут быть экспортированы из ImageJ / Fiji.Use аналогичной интенсивности изображения и параметров контраста для всех изображений из того же эксперимента для подсчета и целей экспорта.

6. Трансфекция нейросфер

  1. Придерживаться диссоциированными клетки к покровным в течение 24 ч. Использование плотности клеток, как правило, между 75000 и 150000 клеток в 500 мкл среды NSC в одном лунку 24-луночного планшета.
  2. Смешайте 25 мкл восстановленного сыворотки среды и 1,5 мкл реагента для трансфекции в 0,5 мл микропробирки встряхиванием в течение 5 сек.
  3. Добавить 2,5 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды в отдельных 0,5 мл microtubе, содержащие 25 мкл восстановленной сыворотки сред и перемешать встряхивание в течение 5 с.
  4. Добавить 1 мкл реагента для трансфекции ко второму микропробирок, содержащий ДНК и перемешать встряхиванием в течение 5 с.
  5. Добавьте смесь из ДНК-содержащей трубки к первому микропробирок и перемешать с помощью пипетки.
  6. Выдержите смесь в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После инкубации, осторожно добавляют по каплям к трансфекции смеси в лунки на верхней части среды НБК (500 мкл / лунку).
  7. Изменение среды 24 ч после трансфекции среду для контроля (NSC среднего) или голодание среду (500 мкл / лунку).
  8. Закрепить клетки путем изменения среды до 4% PFA через 24 ч и выполняют иммунное окрашивание; как правило, до эффективности трансфекции 10% получают с использованием этого протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После посева клеток из SVZ в NSC среде в течение недели, плавающие нейросферы наблюдались (фиг.2А). Размеры сфер варьировались от 50 до 200 мкм. Чтобы исследовать, если шарики были получены из нервных стволовых клеток / клеток-предшественников, то нейросферы высевали на PLL- и ламинин покрытие покровных в НБК среды в течение 2-х дней. Затем они были иммуноокрашивание против нервных стволовых / прогениторных клеток маркеров, Nestin. были необходимы два дня, чтобы сферы пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем метод для создания и поддержания нейросферы культуры от взрослого СВЗА мыши. Несколько соответствующие моменты, касающиеся культуры заключаются в следующем. Во-первых, размеры сфер, как правило, в пределах от 50 - 200 мкм. По нашему опыту, когда нейросфера получает больше, чем 300 мкм в диаметре, оптимальное время для пересева было пропущено. Эти большие сферы содержат мертвые клетки в ядре. Во-вторых, в качестве нейросферы обычно используются для изучения нервных стволовых клеток / клеток-предшественник...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа в лаборатории S.M. финансируется за счет грантов от CPRIT (R1220) и NIH (1R01GM113023-01).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 мм круглое защитное стеклоFisherbrand12-545-80 
24-луночный планшетFalcon353047
4% параформальдегида (PFA)Affymetrix19943
50 мл тубаFalcon352098
95 мм x 15 мм чашка Петри, съемная крышкаFisherbrandFB0875714G10 см чашка
70 &; m клеточный фильтрFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey Anti Rabbit, Alexa 488 вторичное антитело
Arl13B, клон N295B/66НейромабAB_11000053
добавка B-27 (50X), без сывороткиThermoFisher Scientific17504001центрифуга
B27Thermo scientificST 40R
Криогенный флаконCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigmaD5025-15KUDnase I
ДиметилсульфоксидSigmaD8418-100MLDMSO
Одноразовые виниловые формы для образцовSakura Tissue-Tek Cryomold456510 мм x 10 мм x 5 мм
Дульбекко Фосфатно-солевой буфер 10X, модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния, жидкий, стерильно отфильтрованный, подходит для клеточных культурSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ЩипцыТонкие научные инструменты11254-20
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)SigmaF9026-500ML
РастворFluoromount-GSouthern Biotech0100-01монтажное решение
GFAPDAKOZ0334
Козье антитело против мыши IgG1 вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127Козье против мыши IgG1, Alexa 555 вторичное антитело
Goat против мыши IgG2a вторичное антитело, Alexa Fluor 555 конъюгатThermoFisher ScientificA-21137Goat против мыши IgG2a, Alexa 555 вторичное антитело
Gpr161домашнего производстваН/Д
человека bFGFSigmaF0291FGF
гемоцитометрHausser Scientific0,100 ммглубина улучшенный нейбауэр
ИзотезияHenry ScheinNDC 11695-0500-2Изофторан
ламинин из базальной мембраны саркомы Engelbreth-Holm-Swarm SigmaL2020Ламинин
L-глютамин (200 мМ)SigmaG7513
Липофектамин 3000 Реагент для трансфекцииThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 добавка (100X)ThermoFisher Scientific17502001
N2 Нейробазальная средаGibco21103-049
Нормальная ослиная сывороткаJackson ImmunoResearch017-000-121
ОКТ-соединениеСакура Ткань-Тек4583ОКТ
пенициллин-стрептомицинSigmaP4333-100ML
Поли-L-лизин (PLL)SigmaP4707
Рекомбинантный человеческий белок EGF, CFR и D системы236-EG-200
EGF НожницыFine science инструменты14060-10
Superfrost plus предметное стекло для микроскопаFisher scientific12-550-15слайды
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Трипсин-ЭДТА раствор (10X)SigmaT4174-100Трипсин
COSTAR 6-луночный планшет, с крышкой плоское дно сверхнизкое прикрепление поверхность полистирол, стерильныйCorning3471сверхнизкосвязывающий 6-луночный планшет
β-тубулин IIICovanceMMS-435PTUJ1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857(2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902(2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422(2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576(2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669(2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ARL13BGPR161

Похожие статьи