Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55319

⸱

10 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Family Drug Discovery Center and Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Anatomy, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы покажем подход ферментативной для выделения первичных гепатоцитов от взрослых мышей, и мы опишем количественную оценку воспалительного ответа с использованием ELISA и ПЦР в реальном времени.

Аннотация

Печень играет решающую роль в регуляции системного воспаления. При хроническом заболевании почек, в частности, печень реагирует в ответ на уремический среды, окислительный стресс, эндотоксемии и уменьшением клиренса циркулирующих провоспалительных цитокинов, производя большое количество острой фазы реагентов. Экспериментальные инструменты для изучения воспаления и основная роль гепатоциты имеют решающее значение для понимания регулирования и вклад печеночных цитокинов в системной ответной реакции острой фазы и пролонгированное провоспалительных сценарий, особенно в сложной обстановке, таких как хроническое заболевание почек. Поскольку исследования сложных механизмов воспаления в естественных условиях остается сложной, ресурсоемкой и обычно требует использования трансгенных животных, первичные изолированные гепатоциты обеспечивают надежный инструмент , чтобы получить механистические идеи в печеночную реакции острой фазы. Так как этот метод в пробирке особенности умеренные затраты, высокая повторнои общие продуктивность технических знаний, первичные изолированных гепатоцитах также могут быть легко использованы в качестве скринингового подхода. Здесь мы опишем метод ферментативного основе для выделения первичных гепатоцитов мышиными, и мы описываем оценку воспалительного ответа в этих клетках с помощью ELISA и количественный ПЦР в реальном времени.

Введение

Хроническая болезнь почек (ХБП) может быть определена как состояние острого и хронического воспаления 1. У больных с ХПН, уровни сывороточной phosphaturic фактора роста фибробластов 23 гормона (FGF23) постепенно повышаться с целью поддержания гомеостаза сывороточного фосфата 2. Повышенные уровни сыворотки FGF23 независимо друг от друга связаны с сердечно - сосудистой заболеваемости и смертности среди пациентов , которые начинают лечение гемодиализом 3, 4. Кроме того, некоторые клинические исследования показали сильную корреляцию между повышенными уровнями FGF23 и сывороточные уровни С-реактивного белка (CRP), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли альфа (ФНО) 5, 6. Кроме того, в экспериментальном исследовании, недавно мы показали, что FGF23 может нацелены непосредственно на гепатоциты и вызывают воспалительную реакцию путем увеличения CRP и IL-6 рroduction в печени 7. Следовательно, FGF23 может выступать в качестве циркулирующего фактора, который вносит свой вклад в системное воспаление в CKD.

В начале 70 -х годов, первичные гепатоциты были выделены и изучены впервые 8. С тех пор первичные культивируемые клетки печени широко используются для изучения обмена веществ обработки, гормональной функции, метаболизм лекарств, токсичность, а также иммунитета и воспалительных реакций 9, 10. Предыдущие протоколы основном описывали ферментативную выделение первичных гепатоцитов из ткани печени человека 11, 12. В то время как отличной модели, это оставляет вне возможность изучить, как генетические манипуляции затрагивает сложные механизмы печеночная сигнализации, а также функциональные последствия при различных типах стимулов. Далее мы опишем выделение мышиных первичных гепатоцитов, Следует отметить, что эффект нескольких медиаторов печеночной реакции острой фазы, такие как липополисахарида (LPS), IL-6 и FGF23 могут быть проанализированы в легкой, быстрой и воспроизводимым способом 13.

В данном случае мы приводим протокол для ферментативной изоляции гепатоцитов от взрослых мышей, и показано, что установленные индукторов воспалений, такие как LPS и IL-6, а также к новым медиаторов воспаления, таких как FGF23, может непосредственно стимулировать экспрессию и секрецию воспалительные цитокины, такие как CRP и IL-6 в культуре гепатоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы животных и экспериментальные процедуры были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из Университета Майами Миллер Школа медицины мимо.

1. Подготовка

  1. Подогрейте перфузии печени человека средств массовой информации и переваривания печени СМИ в водяной бане при 37 ° С.
  2. Настройка перфузионного насоса (30 мл / мин). Тщательно предварительного заполнения системы труб насоса с перфузионной печени СМИ. Избегайте пузырьков воздуха в системе и подготовить стереотаксической микроскоп.
  3. Coat блюда с использованием клеточных культур коллаген типа I в соответствии с протоколом производителя.

2. Восстановление печени

  1. Обезболить мышь доноров с использованием кислорода / изофлуран ингаляции (4% изофлуран / 2 л / мин кислорода).
    1. Поддержание анестезии путем снижения изофлуран до 2-2,5% или путем инъекции кетамина (100 мг / кг массы тела внутрибрюшинно) и ксилазина (10 мг / кг массы тела intraperitoneally). Непрерывная изофлуран анестезии является предпочтительным, так как кетамин снижает кровяное давление и может привести к гепатотоксичности.
  2. Поместите наркозом мышь на впитывающей подушечки. Закрепить конечности мышки с помощью клейкой ленты.
  3. Бритье и дезинфицировать брюшко мыши и выполнить вентральной лапаротомии от лобка к черепной границе печени с помощью хирургических ножниц с острыми / тупыми концами. Надрезать брюшной стенки с обеих сторон, каудально диафрагмы.
  4. Защиту нижней полой вены (НПВ), осторожно перемещая кишечник с правой стороны. Тщательно рассекают жировой ткани вокруг НПВ с использованием стерильных хлопка наконечником тампоны и угловой наконечник щипцами.
  5. Надрезать suprahepatic диафрагму и открыть грудную полость двумя боковыми разрезами с помощью тонких хирургических ножниц с острыми / острыми наконечниками. Перевязывать грудная IVC с помощью хирургического шелка (5/0).
  6. Инфраренального иглу IVC с помощью экранированного внутривенный катетер, осторожно удалите иглу,подключить перфузионного насоса и начать перфузии печени. Если выполнены должным образом, печень должна немедленно начать бланшируют и зыби.
  7. Трансекте воротной вене позволяет подходящий дренаж крови и перфузионных сред с использованием тонких хирургических ножниц.
  8. Заливать печени с приблизительно 30 мл перфузии печени, средств массовой информации, а затем переключиться на печень дайджест СМИ (30 мл). Выключите перфузионного насоса и снимите канюлю раз перфузия завершена.
  9. Аккуратно обнажить центральную область печени и найти соединительную ткань, связывающую долей печени. Захватите центральные соединительные волокна и тщательно проанализируем все ткани, удерживающие печень на месте и аккуратно удалить печень.
  10. Сразу передачи печени в 50 мл полипропиленовую коническую пробирку, содержащую 15 мл переваривания печени носителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет конкретного времени линии для этого шага. После перфузии печени остается в дайджеста СМИ для транспортировки в стерильной капот культуре клеток. Все Sшаги ubsequent должны быть выполнены в стерильной среде.

3. Выделение и обработка клеток

  1. Внутри капот культуре клеток, передают печень от 50 мл полипропилен коническую трубку с переваривания СМИ в стерильный блюдо культуры ткани.
  2. С помощью стерильного пинцета, осторожно разорвать четыре лопасти печени. Если выполнены должным образом, переваривание среда должна стать мутным из-за выделения гепатоцитов из печени.
  3. С помощью 25 мл стерильной пипетки, фильтровать мутную пищеварение среды через нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм в новый 50 мл полипропиленовую коническую трубку для удаления частиц непереваренные тканей и клеточных остатков.
  4. Повторите шаги 3,2 и 3,3 стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). Это помогает с удалением любых остаточных гепатоциты из печени.
  5. Центрифуга при 50 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Аспирируйте супернатант, содержащий избыток остатков клеток и осторожно повторно приостанавливать клетки в 25 мл холодной 1xУильямса Medium E.
  6. С помощью 25 мл стерильной пипетки, фильтровать ресуспензию через новый 70 мкм нейлоновый клеточный фильтр в 50 мл полипропилен коническую трубку, чтобы получить более чистую суспензию.
  7. Повторите шаги 3.5 и 3.6 для трех дополнительных промывок с использованием холодного Уильямса Medium E 1x, чтобы получить более четкую клеточную суспензию.
  8. После заключительной стадии промывки, аспирация супернатант, чтобы удалить избыток остатков клеток. Повторное приостановить и фильтровать клетки в 25 мл теплого Уильямса Медиа E 1x, которая содержит первичный оттаивание гепатоцитов и плакировка добавки через новый 70 мкм сетчатый фильтр из нейлона клеток в 50 мл полипропилен коническую трубку.
  9. Количество клеток в 25 мл суспензии клеток с помощью гемоцитометра. В среднем ожидают 15 - 20 миллионов клеток на печени взрослого. Определение жизнеспособности клеток с помощью окрашивания трипановым синим.
  10. Пластина клеток в 2 мл Williams 'Медиа-E 1x, который содержит первичную оттаивание гепатоцитов и покрытия добавки на коллаген покрытием 6-хорошо в.п.LL культуры кластера (9 × 10 5 клеток на лунку).
  11. Через 4 ч изменить носитель для Уильямса Медиа E 1x, который содержит добавки по техническому обслуживанию первичных гепатоцитов.
  12. Через 24 ч, сыворотку голодали клеток с модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), медиа-1x в течение 6 ч.
  13. Treat клетки с PBS в качестве транспортного средства, FGF23 (25 нг / мл), LPS (100 мкг / мл) или IL-6 (50 нг / мл) в среде без сыворотки и инкубировали в течение 24 ч.

4. Выделение РНК

  1. Подготовить РНК с использованием набора для коммерческого спин колонки в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Создание кДНК из выделенной РНК с помощью обратной транскрипции

  1. Добавить 200 нг выделенного образца РНК в ПЦР-пробирку.
  2. Добавьте 14 мкл эндонуклеазы свободной H 2 O на ПЦР трубки с шага 5.1.
  3. Добавить 4 мкл обратной транскриптазы в ПЦР-пробирку с шага 5.1.
  4. Повторное приостановить содержимое осторожно, чтобы сделать смесь гомогенной; центрифугировать осторожно.
  5. Поместите ПЦР-пробирку, содержащую смесь в амплификатор. Запуск Термоциклеры для обратной транскрипции: 1 цикл 25 ° С (5 мин), 42 ° С (30 мин), 85 ° С (5 мин), а затем проводить при температуре 4 ° С. Конечный продукт будет нужной кДНК.

6. Анализ клеток с помощью количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР)

  1. Подготовка 96-луночного планшета.
    1. Поместите все компоненты реакции КПЦР на льду: 1 мкл кДНК, 0,25 мкМ прямого праймера, 0,25 мкМ обратного праймера, 5 мкл SYBR Green, 3,5 мкл ПЦР-класса водой до общего объема 10 мкл. Использование SYBR Green, подготовить мастер смеси для запуска всех образцов в трех экземплярах.
    2. После того, как мастер-микс завершена, вихрь, чтобы сделать однородной. Аликвоты 9 мкл кПЦР мастер смеси в каждую лунку 96-WLL пластины. После того, как, осторожно добавляют 1 мкл кДНК в каждую лунку. Общий объем реакционной смеси будет 10 мкл.
    3. После завершения загрузки, уплотнения 96-луночного планшета с оптическимклейкая пленка и кратко центрифуге 96-луночный планшет (50 мкг в течение 1 мин).
  2. Запуск образцов в приборе в режиме реального времени ПЦР. Поместите запечатанную 96-луночного планшета в реальном масштабе времени PCR-инструмента и запустить образцы в соответствии с рекомендациями изготовителя прибора. Примеры стандартных и быстрых циклов включены ниже.
    1. Для стандартных параметров езда на велосипеде, используйте следующий: начальная денатурация при 94 ° С в течение 120 с, затем 40 циклов при 94 ° С в течение 15 с, 60 ° С в течение 60 с, а затем при необходимости проводить при температуре 4 ° С.
    2. Для быстрых параметров велосипедными: с помощью следующей: начальная денатурация при 94 ° С в течение 30 сек, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 сек, 58 ° С в течение 15 с, а затем 72 ° С в течение 10 с.
  3. Обратитесь к руководству прибора для руководства о том, как анализировать данные.

7. Анализ супернатантов клеток методом ИФА

Примечание: Все действия выполняются в соответствии с протоколом производителя.

  1. Базовые приготовления
    1. Разлить 398 мкл разбавителя в отдельные пробирки. Пипетка 2 мкл образца клеточного супернатанта в разбавитель пробирку 398 мкл. Это обеспечит смесительный складку 200.
    2. Повторите шаг 7.1.1 для каждого испытуемого образца.
  2. Процедура
    1. Пипетка 100 мкл 200-кратно разбавленного образца и стандартной в лунки 96-луночного планшета.
    2. Выдержите 96-луночный планшет при 25 ° С в течение 45 мин на микропланшет-шейкере при 150 оборотах в минуту.
    3. Промыть лунки 5 раз 1х промывочный буфер раствором. После последней промывки завершена, удалить все остатки моющего раствора с впитывающей бумагой.
    4. Добавить 500 мкл HRP-конъюгата в каждую лунку.
    5. Повторите шаги 7.2.2 - 7.2.3.
    6. Пипетка 100 мкл тетраметилбензидина (ТМВ) реагента в каждую лунку 96-луночного планшета.
    7. Тщательно перемешать в 96-луночный планшет при 25 ° С в течение 20 мин на микропланшетшейкер со скоростью 150 оборотов в минуту. Остановить реакцию непосредственно добавлением 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку и аккуратно перемешать. После остановки раствор добавляют цвет должен желтеть. Это сообщает, что остановка решение было правильно смешалась.
    8. С помощью ридере, определяют оптическую плотность при длине волны 450 нм в течение первых 5 мин.
  3. Подсчет результатов
    1. Вычислить таблицу средних значений оптической плотности (A 450) для каждого образца и каждого стандарта.
    2. Соберите стандартную кривую, откладывая 450 среднее значение каждого стандарта против его стандартной концентрации в нг / мл на линейном графике. Разрешить ось х представлять концентрацию и ось ординат для представления 450 значений.
    3. Используя среднее значение 450 из каждой разведенной пробы, определяют концентрацию целевого белка в нг / мл по стандартной кривой.
    4. Умножить концентрацию образца путем разбавления фактор. Это позволит определить фактическую концентрацию целевого белка в образце клеток супернатанта.
    5. Участок построенную таблицу из образцов в линейный график. Если OD 450 значения выходят за пределы стандартной кривой, образцы должны быть разбавлены соответствующим образом и повторное тестирование.
    6. Нормализация результаты 500000 клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

гистология

Представительные световой микроскопии образы первичных выделенных и культивируемых клеток изображены на рисунке 1А. Иммуноцитохимическая анализ показывает, что изолированные гепатоциты высоко выражают альбумин (красный), а также фактор роста фибробластов рецептор 4 (FGFR4) (зеленый). Ядра окрашиваются 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий). (Фигура 1В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разделительный первичных гепатоцитов у мышей является быстрым, недорогим и надежным инструментом для изучения воспалительных реакций бывших естественных условиях. Если выполнены правильно, результаты могут быть легко сгенерирована и воспроизведена в своевременной и экономически эффективным способом. Следующие пункты должны быть тщательно оценены, чтобы обеспечить успешную изоляцию.

Хирургический разрез и катетеризация НПВ следует проводить под общим наркозом, а не после того, как эв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов объявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH (R01HL128714 к CF) и (F31DK10236101 к КС) и Американской ассоциации сердца (CF и AG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Расходные материалы
сильноячеистый фильтр 70 μ m Нейлоновое сетчатое фильтрFalcon352350
BD Insyte AutoguardBD381412
50 мл Полипропиленовая коническая трубкаFalcon352098
100 6-дюймовых аппликаторов с ватным наконечником Puritan806-WC
1cc U-100 Инсулиновый шприц 28 г 1/2Becton Dickinson329420
Чашка для культуры тканей 100 x 20 мм StyleCorning353003
6 лунок Кластер клеточных культурCostar3516
5/0 Черный плетеный хирургический шелк (100 ярдов)LOOKSP115
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Оборудование
Minipuls 3 Перфузионный насосGilsonF155007
Комплекты гемацитометра, PropperVWR48300-474
Стекла крышки гемацитометра, PropperVWR48300-470
Ножницы хирургические - острые/тупыеF.S.T.14001-12
Ножницы с диафрагмой - ToughCut StraightF.S.T.14058-11
Щипцы Dumont SS-45F.S.T.11203-25
Студенческие тканевые щипцыF.S.T.991121-12
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Реагенты
Раствор уксусной кислоты, 2,0 NSigma      A8976-100ML
Изофлуран, USP 250 млPiramal Healthcare    66794-013-25
КетаВед 1,000 мг/10 мл (100 мг/мл)VEDCO      50989-161-06
Ксилазин 100 мг/млAnaSed для инъекций139-236
Среда Уильямса E (1x)gibco12551-032
Среда для перфузии печени (1x)gibco17701-038
Среда для переваривания печени (1x)Life Technologies17703034
Добавки для размораживания и покрытия первичных гепатоцитовLife TechnologiesCM3000
Добавки для поддержания первичного гепатоцитаLife TechnologiesCM4000
Фосфатный буферный раствор (PBS) pH 7,4ThermoFisher Scientific10010031
Коллаген типа 1Corning354236
Trypan Blue SolutionVWR45000-717

Ссылки

  1. Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
  2. Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
  3. Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
  4. Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
  5. Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
  6. Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).
  7. Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
  8. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  9. Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
  10. Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
  11. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
  12. Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
  13. Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
  14. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  15. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  16. Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
  17. Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
  18. Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

LPSFGF23IL6
Стимуляция воспалительной реакции в первичной культурах гепатоцитов мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.