Этот протокол описывает клоаки Массаж, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц и экстракции ДНК от птичьего спермы с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Птичий Семен коллекции клоаки массаж и изоляции ДНК из спермы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Коллекция спермы может быть полезным для широкого спектра приложений, включая исследования с участием качества спермы, сперма теломер динамики и эпигенетики. Птицы являются широко используемых предметов в биологических исследованиях и идеально подходит для исследования образцов неоднократные спермы. Однако мало ресурсов в настоящее время доступны для тех, кто хочет научиться собирать и извлечь ДНК от птичьего спермы. Здесь мы описываем клоаки Массаж, нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора птичьего спермы. Хотя этот метод установлен в литературе, это может быть трудно узнать из имеющихся описаний. Мы также предоставляем информацию для извлечения ДНК от птичьего Семен, с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями. Клоаки массаж легко может использоваться на любых малого среднего размера мужчина птица в репродуктивного состояния. После сбора спермы можно использовать немедленно для анализов подвижность, или замороженные для экстракции ДНК после протокол, описанные здесь. Этот протокол извлечения был усовершенствован для птичьего спермы и успешно используется на образцы, собранные из нескольких видов воробьиных (Passer domesticus, Воробьиные овсянки Овсянковые кардиналы, гракл Haemorhousи migratorius дрозд ) и один columbid (Columba livia).
Введение
Птицы являются идеальным темы для исследований с участием качества спермы и конкуренции1, спермы теломер динамики2, эпигенетики3и подобные темы, как они широко используются в биологических исследованиях и спермы можно легко попробовать с помощью клоаки Массаж. Клоаки массаж – нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц4,5,6. Повторные образцы могут быть легко получены, и требуются никаких специальных инструментов, что делает его простым для выполнения в поле или лаборатории. Хотя клоаки массаж был в использовании на протяжении десятилетий, трудно узнать из доступных письменного описания. Эта публикация предназначена для сокращения времени и неопределенности, участвующих в процессе обучения клоаки массаж.
Семен, собранных от птиц, используя клоаки массаж может быть немедленно использованы для оценки подвижности4,7 или искусственного оплодотворения8или замороженные для других целей, например расширенные изображений и экстракции ДНК. Образцы спермы от воробьиных птиц малы, но содержат плотно упакованных спермы. ДНК добывается с использованием коммерческой добычи комплект для простоты, с изменениями для преодоления специализированные защитные функции сперматозоиды9. После извлечения спермы теломеры может быть измерена с помощью ПЦР10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол включает позвоночных животных темы и был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Северная Дакота.
1. Семен коллекции из певчих птиц, используя клоаки Массаж
Примечание: Клоаки массаж является эффективным Семен коллекции техника на репродуктивно активных птицы только, но может быть успешно выполнена вне сезона размножения в неволе соответствующих ситуациях. Репродуктивной деятельности должны определяться для целевых видов перед использованием клоаки массаж. Этот метод может использоваться на диких птиц после захвата или на птиц в плену.
- Начиная с мужской птица, (в разведении условие) Бандер в тисках в руке недоминирующих, доминирующей рукой передавать птица с его вентральной стороне прикосновения ладони (рис. 1).
- Убедитесь, что голова птицы рядом с бокового края ладони. Слегка защитить голову и тело, используя мизинец, кольцо и средним пальцами. Это оставляет дефлектора и хвост подвергаются птицы.
- Оставьте птицы ноги loose или слегка сдержанной, используя ладони.
Рисунок 1 : Сцепление для клоаки массаж. Птица слегка обеспечивается в доминирующей рукой с его вентральной стороне прикосновения ладони и голову, обеспечены pinky палец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Поместите доминирующей указательный палец и большой палец на обе стороны Улучшенный конца клоаку и слегка сожмите пальцы вместе очень легким нажимом к хвосту ( рис. 2). Клоака будет Эверт, обнажая слизистую оболочку клоаки (розовый интерьер).
Примечание: Если птица не является в настоящее время производство спермы, клоаки выпуклости могут быть небольшими и клоаку трудно Эверт. С опытом это легко различать cloacas репродуктивно активных и неактивных мужчины5,11.
Рисунок 2 : Пальцем позиции и клоаки протуберанцем. Эверт клоаку, применяя небольшое давление к концу улучшенный (A). В репродуктивно активных мужчин Воробьинообразные, очевидно клоаки бугорками и фирмы (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Недоминирующих рукой Поместите панель указательный палец на спинной стороне основания хвоста стабилизировать руку и затем поместите кончик пальца чуть ниже everted клоаку.
Примечание: Короткая и гладкая эскизов является выгодным для выполнения клоаки массаж и защищает птица от случайного повреждения. - Перемещение пальца недоминирующих глубоко и краниально в повторяющихся движений с среднего давления, оставаясь ниже клоаку. Продолжайте, пока птица эякуляции. В зависимости от личности это обычно занимает от 1 и несколько десятков ударов.
- Как только птица эякуляции, сбора спермы в гематокритной трубку. Повторите клоаки Массаж, чтобы получить несколько эякуляции.
Примечание: Из отряда воробьинообразных Семен светло-коричневый и обычно имеет несколько густую консистенцию. Белый или темно веществ выбрасывается из Клоака не спермы и могут загрязнять образца спермы. Внешний вид небольшое количество крови на клоаку или смешанные в с спермы обычно вызвано слишком много давления во время массажа. - Для экстракции ДНК поместите спермы в пробки microcentrifuge с 20 мкл ПБС (рН 7,4). Примечание: Семен, хранящиеся в однократном ПБС не подходит для искусственного осеменения, но может быть использован для экстракции ДНК на более позднем этапе при температуре-80 ° C. PBS может быть комнатной температуры или охлажденные, но должно быть в жидком состоянии, когда наносится образца спермы.
- Подтвердите наличие сперматозоидов в образце, просмотрев небольшой объем разреженных образец под микроскопом соединения (рис. 3).
- Храните разбавленные Семен-80 ° c до добычи.
2. Добыча ДНК из спермы птиц
Примечание: Этот протокол был протестирован с нескольких коммерческих экстракции ДНК комплекты, но только он был успешным, когда используется с одним ДНК комплект12. Шаги, которые изменяются от комплект протокола обозначаются *.
- Подготовить раствор 1м Дитиотреитол (DTT) в воде и перемешивают с помощью vortex.*
- Алиготе DTT решения и храните его при 20 ° C до непосредственно перед использованием. Каждый образец извлекаемое требует 10 мкл solution.* 1 М DTT
- Подготовить на буфер, содержащий 20 мм трис-Cl, рН 8,0; 20 мм ЭДТА; 200 мм NaCL; и 4% SDS. Каждый образец извлекаемое требует 90 мкл этой buffer.*
- Сохраните буфер при комнатной температуре. Если он осаждают, нагреть до 56 ° C до dissolve.*
- Разогрейте инкубатор, содержащий рокер или шейкер до 65 ° Отрошевская
- Непосредственно перед началом добычи, Смешайте 10 мкл раствора DTT с 90 мкл буфера, подготовленный на шаге 2.2 для каждого образца должно быть извлечено, например 900 мкл буфера плюс 100 мкл DTT решение, если извлечение 10 образцов. Эта смесь будет называться DTT-buffer.*
- Добавить 70 мкл ПБС образца спермы всей разреженных и перемешать хорошо с помощью vortex.*
- 100 мкл DTT-буфера и 10 мкл пример протеиназы K решения. Вихрь на 20 секунд, затем инкубировать в разогретой инкубатора за 1 час на качалку или shaker.*
- Добавить 200 мкл буфера Аль и 200 мкл свежие EtOH (100%) и вихревые для 20 seconds.*
- Передача всей выборки к столбцу спин и центрифуги 1 минуту на 6000 x g. удаления коллекции трубки.
- Место столбец на новой трубки и добавить 500 мкл подготовленный буфер AW1. Центрифуга 1 минуту на 6000 x g. удаления коллекции трубки.
- Место столбец на новой трубки и добавить 500 мкл подготовленный буфер AW2. Центрифуга за 1 минуту в 6000 x g. отбросить проточных и место столбце обратно на трубе.
- Центрифуга 3 минуты на 20000 x g. удаления коллекции трубки и столбце на пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Накапайте 35 мкл AE буфера непосредственно на столбец мембраны и инкубации при комнатной температуре для 5 минут.*
- Центрифуга 1 минуту в 14.000 x g. отменить столбце спин и хранить извлеченные образцы-80 ° c.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клоаки массаж и ДНК извлечения с помощью описанных протокол выступала на нескольких видов воробьиных и один columbid (Таблица 1). Присутствие спермы в образцах спермы, собранные клоаки массаж было подтверждено путем просмотра небольшое количество разреженных образцов под микроскопом соединения при 400-кратном (рис. 3). После извлечения ДНК из образцов спермы собраны из домовые воробьи, используя протокол, описанный здесь, восемь образцов были...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы опишем простой и надежный способ для сбора спермы от малых и средних птиц в состоянии репродуктивно активных и извлечения ДНК от птичьего спермы.
Протокол извлечения ДНК описанных Семен изменен из комплекта для простоты, но был доработан для использования на птичий спермы. Спермы устойчивы к лизис стандарта извлечения химических веществ9,13, и образцы спермы, собранных из семейства воробьиных довольно небольшой (обычно несколько мик...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Хосе Noguera для ранней помощи с клоаки Массаж, и Джеффри Kittilson для лаборатории поддержки. Эта работа была поддержана премию ND EPSCoR FAR0022429 для BJH. Расходы на публикации были щедро поддерживает Департамент биологических наук NDSU.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микрогематокрит капиллярные трубки | Fisherbrand | 22-362566 | Можно использовать любого поставщика. Пробирки меньшего размера могут быть более эффективными для сбора небольших образцов спермы, например, от очень мелких воробьиных птиц, таких как щелкающий воробей. |
| Микроцентрифужные пробирки | Any | ||
| 1x PBS | Any | Используются для хранения образцов спермы перед экстракцией ДНК. | |
| DL-Дитиотреитол | Сигма-Олдрич | D0632 | |
| Трис база | Сигма-Олдрич | 10708976001 | Можно использовать любого поставщика. |
| ЭДТА | Сигма-Олдрич | 1233508 | Можно использовать любого поставщика. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | может быть использован любой поставщик. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Может быть использован любой поставщик. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit особенно рекомендуется. Этот протокол экстракции ДНК был опробован с другими коммерческими наборами, но без особого успеха. Причины этого нам неизвестны. |
Ссылки
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
