Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Здесь представлена методика инфузии протоков поджелудочной железы для доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Инфузия протоков поджелудочной железы: эффективный и селективный метод доставки лекарств и вирусов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поджелудочная железа является бифункциональным органом как с эндокринными, так и с экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии. Существует мало инструментов для дальнейшего развития этих областей обучения. Инфузия протоков поджелудочной железы является важным методом, который может позволить отслеживать родословную, вводить гены и нацеливаться на клеточную линию. Техника требует сложного рассечения второй части двенадцатиперстной кишки и ампулы с последующим окклюзией желчного протока и канюляцией протока поджелудочной железы. Хотя поначалу техника технически сложна, приложений множество. Неоднозначность в специфике процедуры между группами подчеркнула необходимость стандартного протокола. Эта работа описывает экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией. Инфузия и, следовательно, экспрессия специфичны для поджелудочной железы, без экспрессии, присутствующей в любом другом типе ткани.
Введение
Поджелудочная железа является бифункциональным органом, с эндокринными и экзокринными компонентами. Ряд патологий может поразить поджелудочную железу, включая диабет, панкреатит и рак поджелудочной железы1. Все эти три заболевания отмечают активные направления исследования, не только для разработки немедленной терапии, но и для лучшего понимания их патофизиологии.
Целевой терапевтический метод доставки был бы полезен. Мы разработали методику инфузии протоков поджелудочной железы, которая является эффективным и селективным методом доставки лекарств и вирусов к клеткам поджелудочной железы. В этой модели проток поджелудочной железы избирательно канюлятируется, а общий желчный проток закупоривается, что позволяет доставлять исключительно в поджелудочную железу.
Этот метод может позволить проследить родословную конкретных типов клеток для дальнейшего выяснения путей развития, важных для развития поджелудочной железы и патологии2,3. Различные промоторы в вирусных векторах позволяют специфически нацеливаться на клеточные линии и ввести гены в эти клеточные линии4,5. Эта работа демонстрирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в поджелудочной железе после инфузии протока поджелудочной железы вирусного вектора, экспрессирующего GFP, по сравнению с фиктивной операцией.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Детской больнице Питтсбурга и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга.
1. Предоперационная подготовка
- Вводят ингаляционный изофлуран (1 - 3% для поддержания и до 5% для индукции) через носовой конус до соответствующего анестезирующего уровня. Следите за адекватностью анестезии путем ущемления щипцами. Отсутствие ответа считается адекватным, и обязательно не следует чрезмерно принять лекарства, так как может возникнуть угнетение дыхания.
- Поместите животное на спину на сцену рассекающего микроскопа, с брюшком, центрируемым с учетом цели. Обездвижить животное хирургическим скотчем. Наносите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Нанесите гладкий толстый слой крема для удаления волос и оставьте на месте на 3 мин. Проверьте небольшой участок для удаления волос. Аккуратно протрите крем и волосы 70% пропитанной этанолом марлей.
- Очистите и продезинфицируйте брюшко животного, протирая его 70% пропитанной этанолом марлей, а затем пропитанной бетадином марлей. Поддерживать стерильные условия на протяжении всей хирургической процедуры.
2. Правильная экспозиция
- Сделайте разрез средней линии в коже от ксилоидного отроста до пупка с помощью скальпеля. Поднимите брюшину щипцами Адсона и сделайте ножницами небольшое отверстие в средней линии.
- Удлините брюшинный разрез до длины разреза кожи, заботясь о том, чтобы оставаться на средней линии (linea alba).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к лапаротомии верхней средней линии брюшной полости. - Поднимите печень с помощью тупых втягивателей, чтобы обнажить общий желчный проток. Зажмите общий желчный проток изогнутым сосудистым зажимом бульдога.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр предотвращает нежелательный вливание в печень.
3. Идентификация сосочков поджелудочной железы и дуоденотомия
- Определите двенадцатиперстную кишку и с помощью щипцов Арруга втягивайте ее каудально, чтобы отобразить сосочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосочек представляет собой белое пятно на передней поверхности второй части двенадцатиперстной кишки. - Втягиваете двенадцатиперстную кишку каудально, позволяя выявить течение протока поджелудочной железы. Иглой 301/2 калибра проколоть стенку двенадцатиперстной кишки по касательной, прямо напротив сосочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна следовать тому же углу, что и проток, когда она входит в двенадцатиперстную кишко.
4. Настой.
- Пропустите катетер через дуоденотомию, созданную на этапе 3.2, пока катетер не будет виден в протоке. Выдвигайте катетер в проток не более чем на 1 см, чтобы предотвратить обход второстепенных протоков притоков.
- Зажмите катетер на месте вторым изогнутым сосудистым зажимом бульдога. Включите насос и влийте выбранный объем. Объем инфузии может варьироваться от 25 до 250 мкл, с идеальным объемом приблизительно 150 мкл.
- Ввести внутрибрюшинную инъекцию примерно 1,5 мл физиологического раствора, чтобы компенсировать потери. Накройте открытый кишечник влажной марлей, чтобы предотвратить высыхание.
- В конце инфузии снимите зажим бульдога, который удерживал катетер на месте. Используйте зажим бульдога, чтобы аккуратно удалить катетер из протока поджелудочной железы. Отпустите зажим из общего желчного протока.
- Закройте брюшину и кожу в один или два слоя с помощью бегущего шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости закрывать дуоденотомию, так как она будет герметизироваться сама по себе. - В качестве послеоперационной анальгезии вводят дозу кетофена в 5 мг/кг во время процедуры и одну на следующий день.
- Верните мышь в клетку под тепловой лампой, пока она не восстановится. Обеспечьте мышь пищей и водой ad libitum.
- Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудины. Не возвращайте животное, перенесшего операцию, в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.
5. Пробоподготовка
- Поместите животное в углекислотную камеру или выполните вывих шейки матки.
- Соберите поджелудочную железу, с селезенкой, печенью и двенадцатиперстной кишки в качестве контрольной. Зафиксируйте ткани в параформальдегиде на ночь при 4 °C. Криозащита образца в 30% сахарозы на ночь, как описаноранее 6.
- Заморозьте образцы. Срез ткани толщиной 6 мкм с помощью микротома. Выполняют визуализацию на микроскоп с флуоресцентной визуализацией, как описаноранее 7.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При практике и тщательной хирургической технике выживаемость этих мышей должна быть больше 95%. Через неделю после инфузии желаемый эффект должен проявляться в поджелудочной железе. Мышей в возрасте от 10 до 12 недель использовали для инфузий протоков поджелудочной железы. Здесь мы используем аденоассоциированный вирус серотипа 8 (AAV8) с промотором ЦМВ для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) по сравнению с фиктивной операцией. Поджелудочную железу мышей собирали через 7 дней ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой работе подробно описывается методология инфузии протоков поджелудочной железы, эффективная мышиная модель для доставки генов и других молекул конкретно и эффективно в поджелудочную железу. Неоднозначность в специфике процедуры между различными группами высветила необходимость стандартизированного протокола8,9,10.
Существует несколько критических этапов процедуры, начиная с отбора молодых, здоро...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
У авторов нет подтверждений. Финансирование было получено от Фонда Комиссии по здравоохранению и планированию семьи провинции Чжэцзян (грант 20146242) и Фонда Научно-технического бюро Вэньчжоу (грант Y20140248).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мыши (25 - 30 г, 8-12 недель) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Этанол (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Стерильный солевой раствор | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Защитное оборудование | |||
| Средство | Nair или триммер | ||
| Марлевые салфетки 2 дюйма x 2 дюйма | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| иглы (30,5 г и 25 г) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 и 305122 | |
| шприц для кетофена и физиологического раствора | Becton Dicksinson and Co. | ||
| Шприц для насоса | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Инфузионный насос | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Инфузионный катетер | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Изогнутые зажимы Bulldog (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Щипцы Arruga | Roboz | RS-5163 | |
| Щипцы Адсона | Roboz | RS-5234 | |
| Иглодержатель | Roboz | RS-7882 | |
| Ножницы | Roboz | RS-5982 | |
| Аппликаторы с ватным наконечником | для врачей Продажи и обслуживание | 22-9988 | |
| Микроскоп | |||
| швов | Оуэнса и малых | SXMD1B402 |
Ссылки
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
