Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

Manuela Lahne; Ryne A. Gorsuch; Craig M. Nelson; David R. Hyde

doi:10.3791/55335

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

24 февраля 2017 г.

Manuela Lahne¹ , Ryne A. Gorsuch¹ , Craig M. Nelson¹^,² , David R. Hyde¹

¹Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ²Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Данио регенерации сетчатки в основном были изучены с использованием фиксированных сетчатку. Однако динамические процессы, такие как интеркинетического ядерной миграции происходят во время рекуперативного ответа и требуют живых клеток, чтобы исследовать основные механизмы. Здесь мы описываем культуру и условия формирования изображения для мониторинга интеркинетического ядерной миграции (НИМ) в режиме реального времени с использованием многофотонный микроскопии.

Аннотация

Эндогенная программа регенерации инициируется Müller глии в взрослых данио (Danio rerio) сетчатка следующие повреждения нейронов и смерти. Глии Мюллера вновь войти в клеточный цикл и производят нейрональные клетки-предшественники, которые претерпевают последующих раундов клеточных делений и дифференцируются в потерянных нейрональных типов клеток. Оба Müller глии и нейронов клеток - предшественников ядер реплицировать свою ДНК и подвергаются митоза в различных местах сетчатки, то есть они мигрируют между базальной Внутренний ядерный слой (INL) и наружный ядерный слой (ONL), соответственно, в способе , описанном в интеркинетического Ядерная миграция (INM). INM в основном была изучена в развивающейся сетчатке. Для изучения динамики INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку в деталях, живых клеток изображений флуоресцентно-меченых Мюллер глии / нейрональных клеток-предшественников требуется. Здесь мы предоставляем условия для выделения и культуры спинные сетчаткуот Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 данио , которые подвергались воздействию постоянного интенсивного света в течение 35 часов. Мы также показали , что эти культуры сетчатки являются жизнеспособными для проведения экспериментов визуализации живых клеток, постоянно приобретая Z-стек изображений по всей толщине эксплантов сетчатки глаза до 8 ч с использованием многофотонной микроскопии для наблюдения за миграционную поведение GFAP: nGFP -положительным клетки , Кроме того, мы описываем детали для проведения анализа после обработки изображений для определения скорости апикальной и базальной INM. Подводя итог, мы создали условия для изучения динамики INM во взрослой модели регенерации нейронов. Это позволит углубить наше понимание этого ключевого клеточного процесса и позволяют определить механизмы, которые контролируют INM.

Введение

В отличие от людей, данио (Danio rerio) демонстрируют надежный ответ регенерации на гибель клеток нейронов сетчатки ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^4. Фактор некроза опухоли α, сигнальная молекула , которая высвобождается от смерти нейронов сетчатки индуцирует Müller глии проживающее в базальном Внутренний ядерный слой (INL) сетчатки, пролиферировать ⁵ и производить нейрональных клеток - предшественников , которые продолжают разрастаться до того дифференцироваться в нейронную клетку типы , которые умерли ^{^2,<....}