Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

24 февраля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Данио регенерации сетчатки в основном были изучены с использованием фиксированных сетчатку. Однако динамические процессы, такие как интеркинетического ядерной миграции происходят во время рекуперативного ответа и требуют живых клеток, чтобы исследовать основные механизмы. Здесь мы описываем культуру и условия формирования изображения для мониторинга интеркинетического ядерной миграции (НИМ) в режиме реального времени с использованием многофотонный микроскопии.

Аннотация

Эндогенная программа регенерации инициируется Müller глии в взрослых данио (Danio rerio) сетчатка следующие повреждения нейронов и смерти. Глии Мюллера вновь войти в клеточный цикл и производят нейрональные клетки-предшественники, которые претерпевают последующих раундов клеточных делений и дифференцируются в потерянных нейрональных типов клеток. Оба Müller глии и нейронов клеток - предшественников ядер реплицировать свою ДНК и подвергаются митоза в различных местах сетчатки, то есть они мигрируют между базальной Внутренний ядерный слой (INL) и наружный ядерный слой (ONL), соответственно, в способе , описанном в интеркинетического Ядерная миграция (INM). INM в основном была изучена в развивающейся сетчатке. Для изучения динамики INM во взрослом регенерирующим данио сетчатку в деталях, живых клеток изображений флуоресцентно-меченых Мюллер глии / нейрональных клеток-предшественников требуется. Здесь мы предоставляем условия для выделения и культуры спинные сетчаткуот Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио , которые подвергались воздействию постоянного интенсивного света в течение 35 часов. Мы также показали , что эти культуры сетчатки являются жизнеспособными для проведения экспериментов визуализации живых клеток, постоянно приобретая Z-стек изображений по всей толщине эксплантов сетчатки глаза до 8 ч с использованием многофотонной микроскопии для наблюдения за миграционную поведение GFAP: nGFP -положительным клетки , Кроме того, мы описываем детали для проведения анализа после обработки изображений для определения скорости апикальной и базальной INM. Подводя итог, мы создали условия для изучения динамики INM во взрослой модели регенерации нейронов. Это позволит углубить наше понимание этого ключевого клеточного процесса и позволяют определить механизмы, которые контролируют INM.

Введение

В отличие от людей, данио (Danio rerio) демонстрируют надежный ответ регенерации на гибель клеток нейронов сетчатки 1, 2, 3, 4. Фактор некроза опухоли α, сигнальная молекула , которая высвобождается от смерти нейронов сетчатки индуцирует Müller глии проживающее в базальном Внутренний ядерный слой (INL) сетчатки, пролиферировать 5 и производить нейрональных клеток - предшественников , которые продолжают разрастаться до того дифференцироваться в нейронную клетку типы , которые умерли 2, 3, 4. Во время пролиферативной фазы реакции регенерации, ядра Müller глии и их производные нейрональные клетки - предшественники проходят повторяющиеся миграционную картину в фазе с клеточного цикла (интеркинетического миграции ядер, INM) 6 >, 7. Ядра расположены в базальной INL реплицировать свою ДНК, прежде чем переходить к наружному ядерный слой (ONL), где они делят до того, как возникающие ядра возвращают базально к INL. Этот процесс был впервые описан в ходе нейроэпителиальной разработки с использованием гистологических методов, в то время как методы визуализации живых клеток позже подтвердил толкование Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Обе гистохимические и живых клеток подходы формирования изображений используются для определения механизмов , лежащих INM и его функции в развитии нейроэпителия включая сетчатку 9, 11, 12, 13. Однако механизмы, регулирующие INM во взрослом регенерирующейся сетчатку не были изучены достаточно подробноXref "> 6, 7. живых клеток будет неоценимым подход для продвижения наших знаний о сигнальных путей , которые контролируют INM во взрослом регенерирующей сетчатки.

До недавнего времени живой ячейки изображения INM в сетчатке не был ограничен либо живых эмбрионов данио или к эмбриональной птенца или послеродового мыши эксплантатов сетчатки глаза 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. В то время как эксплантов сетчатки глаза от взрослых животных разных видов , включая мышей, крыс и данио были использованы для различных клетки биологические подходы 17, 18, 19, 20, эксперименты живых клеток с использованием эксплантатов сетчатки глаза гаве были ограничены короткими периодами времени и не выполняется непрерывно в течение нескольких часов 21, 22. Здесь мы описываем подробный протокол к культуре легких поврежденных взрослых данио сетчатке для проведения экспериментов живых клеток изображений INM мониторинга с использованием мульти-фотонной микроскопии 6. Подходы живых клеток имеют преимущество перед иммуногистохимических методов при исследовании механизмов , контролирующих INM, как динамика INM, например, скорости могут быть затронуты , а не место митоза, который бы не потенциально быть обнаружены с помощью иммуноцитохимии.

В дальнейшем, этот метод также имеет потенциал, чтобы быть модифицирована для изучения других динамических процессов во время регенерации сетчатки, такие как фагоцитоз смерти фоторецепторов Мюллером глии или поведение микроглии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: рерио были подняты и поддерживается на объекте Нотр-Дам данио в области наук о жизни Центра Freimann. Методы, описанные в этой рукописи утверждаются Университета Нотр-Дам уходу и использованию животных комитета и в соответствии с заявлением для использования животных в научных исследованиях зрения Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии.

1. Решения

  1. Подготовьте 70% этанола для стерилизации капот культуры тканей и любое оборудование / реагенты, которые передаются в капот культуры ткани.
  2. Добавляют 2 мл 2-феноксиэтанол до 1 л воды в системе (1: 500 2-феноксиэтанол).
  3. Приготовьте 0,1 мМ NaHCO 3, рН 8,0. Используйте шприц объемом 10 мл и размер пор шприцевой фильтр 0,2 мкм, чтобы стерилизовать раствор в стерилизованную капот культуры ткани.
    Примечание: NaHCO 3 используется для эффективного распространения клеток и тканей клей по всей поверхности покровного fluorodishes (смшаг 3.2).
  4. Готовят 1,0 M CaCl 2 и 1,0 М MgCl 2. Стерилизация с помощью шприца 10 мл и 0,2 мкм размером пор шприцевой фильтр в стерилизованные капот культуры ткани.
  5. Для подготовки Hank's-сбалансированный солевой раствор (HBSS), добавить стерильный CaCl 2 и стерильно MgCl 2 до 1х HBSS без Ca 2+ / Mg 2+, без фенола красного в конечной концентрации 1 мМ каждого. Работа в стерильной среде.
  6. Для приготовления культуральной среды, смесь 50% 1x минимальную поддерживающую среду (MEM) , без фенола красного, 25% HBSS , содержащий CaCl 2 и MgCl 2 (смотри раздел 1.4), 25% лошадиной сыворотки (HS), 10 единиц / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина. Работа в стерильной среде.
    Примечание: Избегайте среды, содержащей фенол красный, как это autofluoresces, влияя тем самым сигнал-шум. 23
  7. Приготовьте 10 мл 1% легкоплавкой агарозы в 1X MEM без фенолового красного. Растопить агарозы / 1x MEM с помощью микпросп. Приготовьте небольшие объемы агарозы (например, 10 мл) в качестве повторяющегося повторного нагрева изменит концентрации ионов из - за испарения жидкости.
  8. До начала культивирования, стерилизовать 1,5 мл микроцентрифужных трубки автоклавированием.

2. Свет-повреждение Paradigm

  1. Темно-адаптация
    1. 2 место - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио (или другой трансгенной данио интереса) на 6 - 14 месяцев в окружающую среду , лишенную света для 14 г. Для получения более подробно см ссылку 2, 6, 24, 25.
  2. Поместите резервуар , содержащий 2 - 3 темно-адаптированный трансгенного данио в воде системы между двумя люминесцентными лампами , которые излучают свет 2800 люкс 2, 6, 24, 25.
  3. Expose данио к постоянной интенсивным светом в течение 35 часов. Во время воздействия света, гарантировать, что температура воды поддерживается между 31 - 33 ° C.

3. Подготовка к культивированием (В день Ретинального изоляции)

  1. Используя 70% этанола, стерилизовать капот культуры тканей и компоненты / инструменты, которые передаются в капюшоне культуры ткани (например, флаконы , содержащие MEM и HBSS, пипетки, стерильные наконечники пипеток и т.д.).
  2. Получение fluorodishes
    1. Смазать один fluorodish для каждой сетчатки с клеткой и тканевым клеем (см Таблицу материалов).
    2. Развести клеток и тканей адгезив в 0,1 мМ NaHCO 3 до конечной концентрации 70 мкг / мл, добавляют по 50 мкл в каждую fluorodish и распространить решение через центр fluorodish с 200 мкл кончика пипетки (приблизительно 1 - диаметр 1,2 см ).
    3. Инкубируйте fluorodishes с покрытием в течение 1 - 3 ч при комнатной температуре; (В качестве альтернативы, инкубировать O / N при 4 ° С).
    4. Удалить раствор и полоскать 3 раза с 500 мкл 1х MEM для каждой стирки. Чтобы избежать fluorodishes с покрытием от высыхания, поддерживать их в MEM до эксплантов сетчатки глаза не установлены.
  3. Подготовка культуральной среды, как описано на стадии 1.6. Питательную среду можно хранить в течение до 1 недели при температуре 4 ° С.

4. Выделение и Культивирование эксплантов сетчатки

Примечание: Протокол описано ниже для выделения дорсальной части сетчатки, которая является область сетчатки глаза, который преимущественно пораженном с помощью описанной парадигмы свет на повреждения. Таким образом, повреждение-индуцированной пролиферации и связанное с ним событие интеркинетического ядерной миграции происходят в дорсальной части сетчатки. Тем не менее, процедура изоляции может быть скорректирована с получением областей сетчатки глаза в соответствии с конкретными требованиями исследователя / исследовательского вопроса.

  1. Эвтаназии один легкий поврежденной трансгенного данио Aта время в 1: 500 2-феноксиэтанол.
  2. Удалить MEM из одного fluorodish с 1000 мкл пипетки, так что только тонкая пленка остатков жидкости.
  3. Передача данио на сухую бумажное полотенце, удалить глаз с изогнутой парой Дюмон пинцетом (пинцет # 5, под углом 45 °) и передать его на fluorodish.
  4. Использование стереомикроскопа, ориентируем глаз с ученика на крышку проскальзывания fluorodish так, чтобы спина глаза с зрительного нерва видна (рис 1D).
  5. С парой МакФерсон-Vannas ножниц удалить зрительного нерва, резка близко к задней части глаза. Кроме того, удалить соединительную ткань, выстилающих вне глаза.
  6. Держите глаз между его носовой и височной стороны с парой # 5 щипцов, делая надрез в зрительном стебле, прокалывая одним ножницеобразном лезвием через решетчатой пластинки и разрезанием вдоль обоих носовой и височной стороны глаза (рис 1E , сегментированный Liпе).
  7. Используя две пары # 5 пинцетом, один для проведения спинной стороне сетчатки, а другая пара, чтобы отделить от брюшного дорсальной части сетчатки, тянуть ткани.
    Примечание: Желательно, чтобы ориентировать спинной сетчатки глаза так, чтобы объектив и слой ганглиозных клеток сталкиваются с покровное в то время как склеры обращен вверх.
  8. Удалить склеры из дорсальной части сетчатки с одной парой # 5 щипцов, придерживая объектив , который подключен к сетчатке со второй парой # 5 щипцов (рис 1Н, I).
  9. Чтобы снять объектив, используйте Макферсон-Vannas ножницы и вырезать за объективом без повреждения сетчатки глаза (рис 1I, J). Иногда линза отделяется на этапе 4.7. В этом случае удалите склеры осторожно пинцетом, удерживая сетчатку на отреза со второй парой # 5 щипцов.
  10. Удалите стекловидное тело, удаляя линзы без повреждения сетчатки глаза. Свести сетчатку со слоем ганглиозных клеток, обращенной к покровноеиз fluorodish (рис 1L, М).
  11. Объемный сетчатку с 10 мкл 1% легкоплавкой агарозы и пусть агарозном затвердевать.
  12. Смотрите, что жидкость агарозы не снимает сетчатку, так как даже небольшое возвышение может повлиять на способность глубоко сосредоточиться в ткани. Если наблюдается подъем, используйте пипетку, чтобы удалить агарозы. Пусть остаточный набор агарозы, прежде чем пытаться добавить больше.
  13. Повторите шаг 4.12 несколько раз перед добавлением 1% легкоплавкой агарозе, чтобы покрыть всю fluorodish. После того, как агароза затвердела, добавьте 1,5 мл культуральной среды.
  14. Поддерживать культуру эксплантов сетчатки глаза в 5% / воздушной среде СО 2 , установленной на уровне 32 ° С в течение примерно 12 часов , чтобы позволить сетчатка оправиться от стресса , понесенные процедуры выделения. Установите температуру до 32 ° С, чтобы поддерживать сетчатку при той же температуре в виде светло-обработанного данио рерио (этап 2.3).

5. Многофотонная Микроскопия

Примечание: Эксперименты , проведенные в этой рукописи были оптимизированы для многофотонного микроскопа , оснащенного инфракрасным лазером (см Таблицу материалов), большие расстояния цели погружения в воду 40X Апо (NA 1.15), сканер гальванометра и климатическую камеру, которая содержит вставку для четырех 35 мм чашки Петри. Изображения были получены с не descanned детектором (R-NDD).

  1. До визуализации, уравновешивают экологической камеры для достижения 5% / воздуха атмосферы СО 2. Убедитесь, что пустые чашки Петри вставлены в держатель, чтобы избежать утечки газа в помещение.
  2. Включите систему микроскопии.
  3. После того, как камера окружающей среды уравновешивают, добавить показатель преломления жидкости на большие расстояния погружения в воду цели 40X Апо (NA 1.15).
    Примечание: Показатель преломления жидкость с оптическими свойствами, аналогичными свойствам воды используется во избежание испарения воды при длительном визуализации.
  4. Место гриппаorodishes с эксплантатов сетчатки глаза в камеру. Используя свет светлого, поместите образец в пути света и довести midregion спинной сетчатки в плоскости фокуса.
  5. С помощью GFP эпифлуоресцентной свет , чтобы сосредоточить внимание на GFAP: nGFP -положительным Мюллера ядер глии (рис 2А, В).
    Примечание: Если эксплантаты не установлены плоские или агарозы накопилось под эксплантов, это будет трудно сосредоточиться на GFAP: nGFP -положительные ядер , или они будут флуоресцировать слабо.
    1. Проверьте, правильно ли переезд в другой области в пределах той же эксплантов сетчатки глаза преодолеет фокусировки вопрос. В противном случае перейти к другому эксплантов сетчатки глаза.
  6. В программном обеспечении получения изображения, откройте 'A1 MP GUI', то 'TiPad', то 'A1 Компактный графический интерфейс "и" приобретение ND "окна. Для многофотонного изображений, убедитесь, что параметр в 'ИК NDD' выбрана в 'A1 Compact GUI.
  7. В "НастройG 'поле, выберите ИК-DM для 1 - го дихроичного зеркала и выбрать полосовой фильтр 525/50 приобрести GFP флуоресценции.
  8. Включите ИК-лазера в окне с надписью «A1MP GUI». Это займет несколько минут, лазер, чтобы быть готовым. Установите длину волны 910 нм для возбуждения флуоресценции GFP и выровнять лазер, нажав на кнопку "Auto выравнивания" в окне "A1 MP графического интерфейса пользователя '.
  9. Убедитесь в том, что помещение и оборудование фары выключены или закрыты перед открытием затвора в 'A1' MP GUI, чтобы избежать передержки ФЭУ. Для снижения уровня шума, размещения микроскопа в затемненном помещении.
  10. Приобретать изображения поля зрения 300 х 300 пикселей, при увеличении двух, и время пикселей жилище 4,8 мкс / пиксель. Грубо настроить мощность лазера путем изменения 'зону захвата' в 'A1MP GUI' и коэффициента усиления в окне "A1 Compact графического интерфейса пользователя '.
  11. Настройка Z-стек
    1. Сосредоточьтесь на слое ганглиозных клеток, чтобы установить верхний фокальной плоскости Z-стека в 'Z' подокна в "окне приобретения ND '. Некоторые GFAP: nGFP -положительные клетки , как правило , расположены в слое ганглиозных клеток, что помогает определить базальную предел сетчатки (рис 2А, D).
    2. Перемещение фокальной плоскости через уровень ОНЛ (рис 2А, В), которая характеризуется наличием слабо меченым GFAP: nGFP -положительным клетки , которые являются круглыми и увеличены по сравнению с их аналогами в INL (рис 2A, C) ,
    3. Установить эту плоскость в нижней части Z-стека. Убедитесь в том, что весь ОНЛ будет образ (рис 2А, В).
    4. При возникновении координационных сдвигов плоскости, которые требуют Переустановка в период формирования изображения, дважды щелкните на средней позиции в 'Z' подокна, чтобы назначить его в качестве позиции «дома». Переход в "симметричном режиме определяется 'и нажмите кнопку «родственник».
    5. Установить размер Z-шага в диапазоне от 0,7 до 1 мкм.
  12. Коррекция Z-интенсивность:
    1. Применить корректировки г интенсивности, чтобы компенсировать потери интенсивности пикселей из-за рассеяния света при визуализации в глубоких слоях ткани.
    2. Чтобы установить исправление, откройте окно 'коррекции г интенсивности ". Для того, чтобы установить 'диапазон Z-стека', выберите 'From ND'.
    3. Нажмите на нижней фокальной плоскости в окне "Z интенсивности коррекции '(в данном случае, соответствует слой ганглиозных клеток) и установить интенсивность лазерного излучения (' область приобретения 'в' A1MP GUI ') и коэффициентом усиления (A1 Compact GUI ).
    4. Нажмите на стрелку рядом с 'Z-значений' в окне 'коррекции г интенсивности ", чтобы подтвердить настройки, которые впоследствии показаны в разделе" настройки устройства "в окне" коррекции г интенсивности »для выбранного фокальной плоскости.
    5. Повторите процесс для среднего ай верхней плоскости, увеличивая мощность лазера и коэффициент усиления. Дополнительные фокальные плоскости могут быть добавлены, если это необходимо. Таблицу 1 для конкретных лазерных и усиления настройки для экспериментов на рисунках 2 - 4.
    6. Установите 'зону захвата' в окне 'A1' MP с графическим интерфейсом. Не следует выбирать зону захвата больше, чем 15, и коэффициент усиления выше, чем 126, в начале обработки изображений, чтобы обойти фотообесцвечиванию и повышенного уровня шума.
      Примечание: Как лазеры и фотоэлектронные умножители различаются между микроскопии систем, тест-лазера и настройки коэффициента усиления для получения оптимальных условий для визуализации микроскопа созданного, избегая при этом фотообесцвечивание.
    7. Выберите 'коррекции относительной интенсивности' в окне 'коррекции г интенсивности ".
  13. В подокне "таймсериях" в окне "ND" приобретение, установить срок до 8 ч и интервал до "без задержки". Затем убедитесь, что нажать 'Run Z-коррекцию' в тон 'г-стек' к югу от окна в кнопке "ND" Приобретение окна приобрести таймсерий 3-D.
  14. Поддержание эксплантов сетчатки глаза при температуре 27 - 29 ° С в течение всего времени получения изображения.
  15. На протяжении всего периода получения изображения, при необходимости, повторно отрегулировать уровень мощности и коэффициента усиления, чтобы поддерживать качество изображения для анализа пост-обработки изображений. Для корректировки выполните шаги 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Если фокальной плоскости сдвигов, приостановить или остановить прогон и выполнить шаг 5.11 снова.
    Примечание: Если 'относительно г-коррекции "был выбран на этапе 5.12.7 и 5.11.4 шаг был выполнен не должно быть необходимости перенастроить мощности и коэффициента усиления уровней, если не произошло обширное фотообесцвечивание.

6. Анализ скорости

  1. Выдержка времени, установив "область интереса" на изображении. Используйте 'измерения времени' инструмента и экспортировать значения времени в электронную таблицу.
  2. Обрезка область, которая содержит диviding GFAP: nGFP -положительным ядро.
  3. Выберите обрезанную область так, что она содержит, по меньшей мере, одно ядро, которое не подвергается INM для того, чтобы установить точку отсчета для последующего измерения расстояния, что ядро ​​разделяющая мигрировали по отношению к базальной INL. Примечание: Чтобы выбрать ядро, которое остается в базисной INL, это помогает подготовить 3-D реконструкция таймсериях а.
  4. В качестве альтернативы, если GFAP: наблюдается nGFP -положительным клеток в ONL в течение всего периода сбора данных, используют вертикальную линию фиксированной длины , охватывающей от ONl ядра к базальной INL с целью определения опорной точки.
  5. С помощью функции "показать ломтиков View ', генерируют ортогональные проекции. Затем измените режим из "среза" до "максимальной проекции интенсивности».
  6. Выключите 'ху' вид ортогональной проекции максимальной. В зависимости от ориентации, при которой мигрирующий / разделив ядро ​​лучше всего видно, AРБП выключить либо "xz'- или" yz'-вид.
  7. Нажмите на изображение, оставшееся с правой кнопкой мыши и извлечь 'хг' или 'серии yz'-изображения с помощью "функции Создать новый документ с этой точки зрения". При необходимости повернуть изображение.
  8. С помощью функции "Ручное измерение", проведите горизонтальную линию через изображение на нижнем уровне ядра , который остается в базальной INL и не подвергается INM (= опорный пункт; Рисунок 4A - Е, красная горизонтальная линия).
  9. Измерьте расстояние между опорной линией и базисной точке ядра мигрирующей для таймсериях с помощью инструмента "измерения линии" в программном обеспечении анализа (см Рисунок 4A - E).
  10. После того, как ядерная оболочка распадается, измерить базальную положение сомы, если она является идентифицируемым после диффузии GFP в всей клетки.
  11. Использование программного обеспечения электронной таблицы, построить расстояние, нюмигрировали против упоминавшихся в гл времени , прошедшего (рис 4F).
    1. Для определения скорости апикальной миграции (v а), график расстояния , пройденного за период до распада ядерной оболочки происходит (рис 4G).
    2. Выберите серию данных в рамках диаграммы, щелкните правой кнопкой мыши и вставить кривую линейной регрессии в том числе соответствующая функция 'у = х + с'. Наклон 'м' в функции представляет скорость, v а (рис 4G).
    3. Повторите шаги 6.11.1 и 6.11.2 для первой фазы быстрой миграции базальных для определения базальной миграции скорость, V б (рис 4H).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение сетчатки в соответствии с процедурой , описанной в схеме на фиг.1 , позволяет культивирование уплощенной дорсальной части сетчатки от светло-поврежденных взрослых Tg [GFAP: nGFP] mi2004 данио в течение не менее 24 ч в 5% СО в 2 / воздушная среда. Эти плоские навесные эксплантов сетчатки глаза могут быть использованы для координационных плоскостей изображения на уровне глубоких тканей. Примером может служить Müller глии / нейронные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования , расследующие механизмы , регулирующие регенерацию поврежденных взрослых данио сетчатки глаза преимущественно используются иммуноцитохимической методы 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Создание условий для эксплантов культуры сетчатки глаза и для выполнения визуализации живых клеток ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы высоко ценим поддержку, оказываемую Уильяма Арчер и Нотр-Дам Комплексная изображений фонда. Особая благодарность направлены на техников Freimann Life Sciences за их постоянную помощь и их ухода и животноводства в данио. Это исследование было поддержано грантами от Национального института глаза НИЗ к DRH (R01-R01, EY018417-EY024519) и Центра исследований данио, Университет Нотр-Дам, Нотр-Дам, IN.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пинцы Дюмон #5Мировые прецизионные инструменты14098
Пинцы Дюмон #5, угол 45 градусовМировые прецизионные инструменты14101
Ножницы McPherson-VannasМировые прецизионные инструменты501233
Флюоровые приборыМировые прецизионные инструментыFD35-100
СтереомикроскопNikon Микроскоп для рассечения аналогичного типа СМЗ-1Ббудет работать
Кабинет биологической безопасности класса А2Эквивалентный тип Labconcoбудет работать
инкубатор для культуры тканейТермонаучныйHEPA-класс 100эквивалентный тип будет работать
Люминесцентные лампы Sylvania OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 &; m пористый шприцевой фильтр AcrodiscVWR4192
10 мл шприц Luer-lokVWRBD309604
60 мл шприц Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS без Ca2+/Mg2+, без фенола красного, GibcoThermoScientific14175-095
MEM без фенола красного, GibcoThermoScientific5100-038
Лошадиная сыворотка, термоинактивированнаяThermoScientific26050-070
пенициллин/стрептомицинVWR16777-164
Ультрачистый агарозный с низкой температурой плавленияThermoScientific16520-100
этанол, абсолютныйThermoScientificBP2818-4
2-феноксиэтанолSigma77699
Corning Cell-Tak клеточный и тканевый адгезив VWR354240
показатель преломления жидкий Cargille Lab1803Y
многофотонный микроскоп Nikon A1 оснащен инфракрасным лазером MaiTaiэквивалента Nikonбудет работать
40X Apo дальним объективом погружения в воду (N.A. 1.15)
оснащенная вставкой для 35 мм опетридисэквивалентная системаOkolab
программное обеспечениедля анализа NISКомпания Nikon
Система климатическая камера, будет работать

Ссылки

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Интеркинетическая миграция ядеркультура эксплантатов сетчаткисетчатка рыбки-зебрамаркировка GFAP:nGFPполучение Z-стекамонтаж в FluoroDishпомещение в агарозуизмерение скорости
Культура взрослых Трансгенные данио Ретинального эксплантов для живых клеток изображений многофотонной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.