Методическая статья

Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем установление ортотопических колоректальных опухолей путем инъекции опухолевых клеток или органоидов в слепую кишку мышей и последующее выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из этой модели.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, подкожные мышиные модели имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены модели ортотопической мыши; Однако такие модели технически требуются, особенно в полых органах, таких как толстая кишка. Для получения однородных опухолей, которые надежно растут и метастазируются, стандартизированы методы подготовки и инъекции опухолевых клеток.

Мы разработали ортотопическую модель мышиного колоректального рака (CRC), которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Опухолевые клетки из первичных опухолей, двумерных (2D) клеточных линий или трехмерных (3D) органоидов вводятся в слепую кишку и, в зависимости от метастатического потенциала инъецированных опухолевых клеток, образуют высокометастатические опухоли. К тому же,КТК можно найти регулярно. Здесь мы описываем методику получения опухолевых клеток как с 2D клеточными линиями, так и с 3D-органоидами, а также с первичной опухолевой тканью, хирургическими и инъекционными методами, а также с отделением CTC от опухолевых мышей и представляем советы по устранению неполадок.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Колоректальный рак (CRC) является одной из наиболее распространенных причин смерти от рака в западных странах. 1 В то время как первичная опухоль может часто быть иссекают, возникновение отдаленных метастазов значительно ухудшает прогноз и часто приводит к смерти. 2 , 3. Биологический коррелятор метастаза - это циркулирующие опухолевые клетки (CTC), которые отделяются от опухоли, выживают в обращении, прикрепляются к эпителию в органе-мишени, вторгаются в орган и в конечном итоге перерастают в новые очаги. 4 Хотя известно, что CTC имеют прогностическую значимость, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 их биология лишь частично понимается как результат их крайней редкости в CRC. 10

Модели мышей - мощные tOol для изучения различных аспектов биологии рака. Классические, подкожные опухолевые модели продуцируются путем подкожной инъекции опухолевых клеток мышам-реципиентам, которые могут быть либо иммунокомпетентными (если используются сингенные мышиные опухолевые клетки), либо иммунодефицитом. Модели подкожных опухолей являются недорогими и быстро производят данные; Их конечный рост опухоли может быть легко и неинвазивно измерен. Однако 88% новых соединений, которые продемонстрировали противоопухолевую активность в таких моделях, не проходят в клинических испытаниях. 11 Это отчасти связано с межвидовыми различиями между людьми и мышами; Однако большая часть этого отказа объясняется низким прогностическим значением подкожных моделей мыши.

Модели ортотопических мышей, в которых опухолевые клетки вводятся в орган происхождения и, таким образом, растут в их первоначальном микроокружении, поэтому все чаще используются в исследованиях рака. 11 , 12 , 13 , 14 Ортотопические модели не только моделируют местные условия роста опухоли; В результате анатомически правильного участка роста опухоли модели ортотопической мыши также позволяют реалистичное моделирование метастазов и поэтому используются для изучения биологии 8 , 15 , 16 CTC или их реакции на различные методы лечения в CRC. 13 , 17

Основным недостатком ортотопических моделей мыши является их техническая сложность. В зависимости от органа, в который должны вставляться клетки, кривая обучения до тех пор, пока экспериментатор не сможет индуцировать воспроизводимые опухоли, довольно длительный. Это особенно относится к колоректальным раковым моделям, поскольку опухолевые клетки необходимо вводить в стенку кишечника, что часто приводит к перфорации, утечке опухолевых клеток или потере эндолюминальной опухолевой клетки. ЭтоЦелью настоящего изобретения является описание способа подготовки клеток из образцов первичной ткани, двумерных клеточных линий и трехмерной органоидной культуры и их инъекции в слепую мышь. Описанная здесь методика приводит к высокоравномерным опухолям и, в зависимости от биологии опухоли клеточной линии, используемой для инъекций, воспроизводимому образованию отдаленных метастазов и КТК у реципиентных мышей. 15

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные здесь эксперименты на животных были независимо рассмотрены и разрешены институционным и правительственным комитетом по уходу и использованию животных и проводились в соответствии с руководящими принципами Федерации ассоциаций лабораторий животных (FELASA). Были приняты все возможные меры для сведения к минимуму страданий, включая анестезию и обезболивание, или, в случае необходимости, преждевременную эвтаназию.

1. Подготовка клеток и органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте объем 20 мкл с 100 000 клеток для каждой инъекции. Используйте базовую мембранную матрицу (BMM), чтобы предотвратить утечку и обеспечить стандартизированную инъекцию. Чтобы обеспечить воспроизводимые результаты, проводите проверки подлинности клеточной линии ( например , через профилирование STR) через регулярные промежутки времени.

  1. Получение суспензий первичных клеток из свежей ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда работайте в стерильных условиях. Немедленная передача свежегоДля обеспечения высокой жизнеспособности клеток требуется резецированная ткань из операционной в лабораторию на льду.
    Благополучие пациента и оптимальное лечение всегда должны быть первоочередными. Поэтому образцы тканей для исследования должны быть получены таким образом, чтобы не мешать последующей патологической обработке и постановке резецированной опухоли. Поэтому в большинстве случаев разумно иметь образцы для исследований, полученных квалифицированным патологом, чтобы обеспечить невмешательство в патологический диагноз.
    1. Сразу же после стерильного удаления из резецированного образца (в идеале ~ 1 см 3 ) поместите образец ткани в пробирку объемом 50 мл, предварительно заполненную 20-30 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Храните трубку на льду и немедленно переведите в лабораторию.
    2. Положите ткань в чашку Петри и дважды промойте ее большим количеством PBS, чтобы удалить оставшуюся кровь.
    3. Разрежьте ткань на мелкие кусочки (~ 2-4 мм) с помощью scaLpel ( например , с лезвием № 20 или # 36).
    4. Используйте диссоциатор в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы далее диссоциировать опухолевую ткань с одноклеточной суспензией. Альтернативно, используйте другие протоколы ферментативного расщепления опухоли.
    5. Подсчитайте клетки полученной одноклеточной суспензии ( например , в сошнике или гемоцитометре).
    6. Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    7. Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
  2. Подготовка клеточных линий для инъекций
    1. Растите все клеточные линии колоректального рака в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ) и подготовьте их в день операции.
    2. Убирайте клетки в соответствии со стандартными протоколами клеточной культуры, подсчитывайте клетки ( например , в сошнике или гемоцитометре) и вычисляйте reqДля всех инъекций в зависимости от количества вводимых животных.
    3. Подготовьте 3-5х фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца.
    4. Центрифуга (5 мин при 1500 г) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    5. Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
  3. Подготовка органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все трехмерные органоидные культуры выращивают в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ). Подробные протоколы для органоидной культуры были опубликованы ранее. 18 , 19 , 20 Подобно обычным клеточным линиям, мы рекомендуем объем 20 мкл BMM с 100 000 клетками на инъекцию. Органоиды готовятся в день операции следующим образом:
    1. Подготовьте следующую среду (в следующем(DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Глутамина (200 мМ) + 1% пенициллина / стрептомицина.
    2. Предварительно заполните 15 мл пробирки 1 мл DMEM / F12 +++.
    3. Осторожно аспирируйте органоиды с поверхности культуральной пластины и перенесите содержимое 3 - 5 лунок в одну пробирку объемом 15 мл.
    4. Осторожно сломайте органоиды на мелкие кусочки, пипетируя их вверх и вниз с помощью удлиненной стеклянной пипетки.
    5. Добавить 5 мл DMEM / F12 +++ в пробирку с последующим центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин.
    6. После центрифугирования удаляют супернатант, ресуспендируют гранулу в 600 мкл ферментативного диссоциационного буфера и переносят суспензию в одну лунку 6-луночного планшета.
    7. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1-5 минут, а затем тщательно пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы растворить органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте пищеварение с помощью микроскопа; Он завершен, когда все клеточные кластеры диссоциируютD к отдельным ячейкам.
    8. После успешного пищеварения добавьте 1,4 мл DMEM / F12 +++, чтобы остановить переваривание. Затем перенесите все лунки переваренных органоидов на 50 мл пробирку.
    9. Подсчитайте ячейки и рассчитайте необходимое количество для всех инъекций.
    10. Подготовьте 3 - 5x фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца
    11. Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    12. Ресуспендировали клетки в BMM до концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и удерживали их на льду.

2. Модель ортотопической мыши

  1. Подготовка животных-реципиентов для хирургии
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте в качестве получателей 6-8-недельные мыши NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). 21 NSG относятся к числу наиболее иммунокомпрометированных мышей, у которых отсутствуют зрелые B, T и NK-клетки, а также несколько других иммунных дефекты. 21 Они надежно вырабатывают опухоли, даже если низкие числа клеток вводятся и сильно подвержены отдаленным метастазам. Мыши NSG являются прекрасными селекционерами и могут храниться в обычных специальных патогенных (SPF) единицах.
    1. Перед первым разрезом вводят 0,05 мг / кг бупренорфина подкожно.
    2. Используйте севофлуран при 3-3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря рефлекса пальцевого пальца указывает на достаточную анестезию.
    3. Накройте глаза анестезированных мышей офтальмологической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
    4. Удерживайте мышей в положении лежа на маленьком столе.
    5. Бритье живота с помощью электробритвы (в качестве альтернативного варианта можно использовать депиляционный крем) и дезинфицировать, по крайней мере, в 3 раза клорексидин / йод и 70% спирта.
    6. Покройте хирургическое поле стерильными драпировками.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Использование периоперационных антибиотиков является необязательным и регулируется институциональными рекомендациями.
  2. Средняя лапаротомия и облучение слепой кишки
    1. Используйте ножницы (скальпели можно использовать альтернативно), чтобы сделать небольшой срединный разрез (3 - 5 мм) кожи на нижней части живота. Возьмите мускулатуру брюшной стенки с помощью щипцов и аккуратно поднимите ее ножницами, открыв таким образом брюшную полость.
    2. Выявление и тщательное экстериоризацию слепой кишки с помощью атравматических щипцов. Поместите слепой конец мешка слепой кишки на живот, указывающий краниально.
    3. После экстериоризации держите влагу в сырой воде, используя теплые солевые тампоны.
  3. Ортотопическая инъекция, закрытие брюшной полости и послеоперационное выздоровление
    1. Для инъекции intracecal используйте стандартный 1 мл шприц с 30-футовым канюлем. Установите этот шприц на микроинъекционный насос, который, в свою очередь, установлен на микроманипулятор.
    2. Тщательно схватите кончик слепой кишки с помощью атравматических щипцов и аккуратно разгладьте его, поглаживая его внизD со вторым набором щипцов, смоченных теплым солевым раствором.
    3. Поместите канюлю прямо над слепой кишкой.
    4. Выполните следующие шаги под визуальным контролем с помощью бинокулярного хирургического микроскопа.
    5. Тщательно схватите слепую кишку двумя атравматическими щипцами на обоих концах экстерриториальной части слепой кишки, слегка растяните ее, а затем медленно потяните ее через канюлю, которая расположена параллельно и прямо над ней. Крайне важно не перфорировать всю стенку кишечника (таким образом, вставляя клетки в просвет), а также не перфорировать серозную оболочку за пределы начальной точки проникновения, так как это приведет к утечке и перитонеальному распространению.
      1. Переместите кишечник в направлении канюли, а не канюлю к кишечнику. Держите и растяните кишечник между двумя щипцами. Руки хирурга должны опираться на поверхность, чтобы уменьшить тремор.
    6. Внедрение клеток между серозной (рассматривается как очень тонкая, полупрозрачная накладка вышеИнтрамуральные кровеносные сосуды) и мышцы. Поэтому канюлю следует визуально размещать над кровеносными сосудами и под тонкой прозрачной мембраной.
    7. Используйте ножной переключатель, чтобы начать инъекцию, чтобы уменьшить тремор, пока канюля находится внутри стенки кишечника.
    8. Как только канюля встанет на место, начните инъекцию. Используйте длительность 20 с, что приводит к установке 1 мкл / с на блоке управления насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекция в поврежденный кровеносный сосуд или вблизи него приводит к прямому внутрисосудистому распространению и отдаленному метастазированию и поэтому его следует избегать.
    9. После завершения инъекции осторожно удалите канюлю, потянув ее назад.
    10. Поместите сухой тампон под слепой кишкой, а затем тщательно промойте слепую кишку дистиллированной водой, чтобы лизировать просочившиеся клетки и тем самым предотвратить искусственное перитонеальное распространение.
  4. Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
    1. После rВдавливая, аккуратно возвращайте слепую кишку в брюшную полость.
    2. Закройте брюшную стенку с помощью быстрорастворимых швов на 6-0.
    3. Закройте кожу хирургическими раневыми зажимами.
    4. Поместите мышь на карту нагрева, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
    5. Внимательно наблюдайте послеоперационное состояние мышей в течение следующих 48 часов. В случае дистресса обработайте 0,05 мг / кг бупренорфина каждые 12 ч.
    6. Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день за признаки дистресса из-за роста опухоли.

3. Выделение циркулирующих опухолевых клеток из образцов цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ. Получают кровь путем чрескожной сердечной пункции у анестезированных мышей, за которой следует эвтаназия. В идеале 1000 мкл крови втягивают в шприц, предварительно заполненный 100 мкл антикоагулянта (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или гепарин). Использовать анти-человеческий-EpCAM (адгезия эпителиальных клетокМолекула) для идентификации КТК. Это очень хорошо работает, если линии мышиных эпителиальных клеток используются в модели мыши. Для других приборов могут потребоваться различные антитела.

  1. Обогащение КТК:
    1. Предварительно заполните 15 мл пробирки средой с градиентом плотности 5 мл и осторожно переносите кровь в пробирку объемом 15 мл.
    2. Центрифуга (30 минут при 300 xg без тормоза) и осторожно удалите верхний супернатант.
    3. Вылейте остаток в новую 15-миллилитровую пробирку и центрифугу (15 минут, 300 xg с тормозом).
    4. Восстановите интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки (отбросьте остальную часть), и промойте клетки дважды PBS.
    5. Ресуспендируют гранулу в 200 мкл PBS / 1% ЭДТА и добавляют 4 мкл антитела EpCAM. Инкубируйте 20 минут на льду в темноте.
  2. Скрининг и сбор
    1. Подготовьте следующий буфер (в дальнейшем называемый собирающим буфером): PBS + 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) + 1% пенициллин / SТрептомицин (1%) + 0,8% ЭДТА.
    2. Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать круг диаметром 1 см в стерильной чашке Петри на 6 см (предотвращает диспергирование жидкости в тарелке) и пипеткой 700 мкл буфера для сбора в этот круг.
    3. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в буфер для сбора 700 мкл в пределах круга. Проверьте плотность клеток с помощью микроскопа. Разделите образец на разные блюда, если он слишком плотный.
    4. Подождите, пока ячейки опустится (~ 5 мин).
    5. Экранная суспензия клеток для окрашенных клеток (= EpCAM-положительных).
    6. Как только ячейка обнаружена, подберите ячейку с микроманипулятором и поместите в буфер 50 мкл в зависимости от предполагаемого анализа ниже по потоку ( например , буфера для экстракции РНК или среды для культивирования).
    7. В зависимости от предполагаемых анализов нижестояния изолируйте отрицательные клетки EpCAM и / или среду в качестве отрицательных контролей.
    8. Продолжайте анализы ниже по течению ( например , клеточная культура, ПЦР).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное и воспроизводимое генерирование колоректальных опухолей в этой модели критически зависит от точной инъекции клеток без утечки или утечки. Если это будет достигнуто, эта модель чрезвычайно надежна и очень редко приводит к искусственному перитонеальному распространению. Кинетика роста опухолей, а также их картины распространения зависят от биологии используемых органоидов и клеток. 15 В то время как клетка НСТ116 надежно метастазировать в печень в этой моде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на их доклинически доказанную активность в подкожных моделях мыши, подавляющее большинство новых соединений терпят неудачу в клинических испытаниях и никогда не попадают в клинику. 11 Эта очевидная недостаточность подкожных моделей мыши для точного моделирования биологии и моделей роста опухолей привела к разработке моделей ортотопических мышей, основанных на инъекции опухолевых клеток непосредственно в исходный орган.

Модели ортотопической мыши способны имит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Германским исследовательским фондом (WE 3548 / 4-1) и Роланд-Эрнст-Штифтун фюр-Гесундхицвезен (1/14).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>среды и компоненты для клеточных культур
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12+++ средний
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12+++ средний
добавка Glutamax-I (200 мМ)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12+++ средний
пенициллин/ Стрептомицин (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122среда DMEM/ F12+++ DMEM
Life Technologies GmbH61965026основная среда 2D клеточных линий (DMEM/10% FCS)
Фетальная телячья сыворотка (FCS)BIOCHROM AG S0115основная среда 2D клеточных линий (DMEM/10% FCS)
Ферментативный буфер диссоциации TrypLE ExpressLife Technologies GmbH12604021
Матрица базальной мембраны Matrigel (BMM, фенол красный свободен)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SaltSalt Technologies GmbH14190169
трипсин-ЭДТА (0,25%, фенол-красный)Life Technologies GmbH25200072
6-/48-луночные планшеты с крышкойCORNING3516/3548
колба для клеточных культур 75 см², 250 млVWR International GmbH734-2066
колба для клеточных культур 150 см², 600 млCorning B.V. Life Sciences355001
пробирки Eppendorf 1,5 мл / 2 млSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 мл, 50 мл центрифужные пробиркиGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Счетные стекла (для счетной машины TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
пипетки Пастера (стекло, 150 мм)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251тонкие протяжки с помощью горелки Бунзена
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235для первичного препарата опухолевой ткани
MACSmix TubeRotator Miltenyi Biotec130-090-753для первичного препарирования опухолевой
тканиMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237для первичного препарирования опухолевой ткани
Набор для диссоциации опухоли человекаMiltenyi Biotec130-095-929для первичного препарирования
опухолевой тканиFalcon 70 и микро; m Клеточный фильтрCorning B.V. Life Sciences352350для подготовки первичной опухолевой ткани
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-Медицинский
кислородAir Liquide MedicalGmbH-Бупренорфин
Temgesic-Bepanthen
- офтальмологическая мазьBayer Vital GmbH10047757
физиологический раствор 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
1 мл Шприц (без мертвого объема) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
игла для инъекций 30GBECTON DICKINSON304000
целлюлозные тампоныLohmann & Rauscher Deutschland13356
Микро-Адсон ЩипцыFST - Fine Science Tools11018-12
Iris Scissor - ToughCutFST - Fine Science Tools14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST- Fine Science Tools12002-12
AutoClip KitFST - Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (хирургический шов)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Настольный исследовательский наркозный аппарат с промывкой O2 и испарителем севофлуранаParkland ScientificV3000PS/PK
Ультрамикро насос с контроллером Micro4World Precision InstrumentsUMP3-4оборудование для высококонтролируемой ортотопической инъекции
Ножной переключатель для SYS-Micro4 КонтроллерWorld Precision Instruments15867оборудование для высококонтролируемой ортотопической инъекции
Трехосевой ручной микроманипуляторWorld Precision InstrumentsM325Магнитная
стойка для микроманипулятораWorld Precision InstrumentsM10
Стальная опорная плита для M10 Магнитная стойка дляWorld Precision Instruments5479оборудование для высококонтролируемых ортотопических инъекций
Hot Plate 062Labotect13854
Isis - Бритва для волосAESCULAP -
хирургический микроскопParkland ScientificVS-2Z
НазваниеCompanyНомер в каталогеComments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
Градиент плотности medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 античеловеческий клон CD326 (EpCAM) Антитело 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 антимышиный CD326 (EpCAM) Клон антитела G8.8BioLegend118210
Чашка Петри, ø 60 x 15 мм, 21 см², VentGreiner bio-one628102
флуоресцентный клеточный культурный микроскопLeica
Transferman 4r МикроманипуляторEppendorf
CellTram AirEppendorfаспирационный насос подключен к микроманипулятору
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationтребуется для изготовления микрокапилляров для аспирации одиночных клеток
Prism Glass CapillariesDagan Corporation
PAP penAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered SaltLife Technologies GmbH14190169подбирающий буфер
Фетальная сыворотка теленка (FCS)BIOCHROM AGS 0115пиринговый буфер
Пенициллин/стрептомицин (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122пиринговый буфер
ЭДТАРот8040.1подбор буфера
NameCompanyНомер в каталогеComments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) антитела клон 9C4BioLegend324201иммуногистохимии EpCAM (см, рис. 2C)
HRP кролик против мышей IgGAbcamab97046EpCAM иммуногистохимия (см, рис. 2C)
магнитной стойки Braun-Бинокулярный

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи