Мы описываем установление ортотопических колоректальных опухолей путем инъекции опухолевых клеток или органоидов в слепую кишку мышей и последующее выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из этой модели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, подкожные мышиные модели имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены модели ортотопической мыши; Однако такие модели технически требуются, особенно в полых органах, таких как толстая кишка. Для получения однородных опухолей, которые надежно растут и метастазируются, стандартизированы методы подготовки и инъекции опухолевых клеток.
Мы разработали ортотопическую модель мышиного колоректального рака (CRC), которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Опухолевые клетки из первичных опухолей, двумерных (2D) клеточных линий или трехмерных (3D) органоидов вводятся в слепую кишку и, в зависимости от метастатического потенциала инъецированных опухолевых клеток, образуют высокометастатические опухоли. К тому же,КТК можно найти регулярно. Здесь мы описываем методику получения опухолевых клеток как с 2D клеточными линиями, так и с 3D-органоидами, а также с первичной опухолевой тканью, хирургическими и инъекционными методами, а также с отделением CTC от опухолевых мышей и представляем советы по устранению неполадок.
Введение
Колоректальный рак (CRC) является одной из наиболее распространенных причин смерти от рака в западных странах. 1 В то время как первичная опухоль может часто быть иссекают, возникновение отдаленных метастазов значительно ухудшает прогноз и часто приводит к смерти. 2 , 3. Биологический коррелятор метастаза - это циркулирующие опухолевые клетки (CTC), которые отделяются от опухоли, выживают в обращении, прикрепляются к эпителию в органе-мишени, вторгаются в орган и в конечном итоге перерастают в новые очаги. 4 Хотя известно, что CTC имеют прогностическую значимость, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 их биология лишь частично понимается как результат их крайней редкости в CRC. 10
Модели мышей - мощные tOol для изучения различных аспектов биологии рака. Классические, подкожные опухолевые модели продуцируются путем подкожной инъекции опухолевых клеток мышам-реципиентам, которые могут быть либо иммунокомпетентными (если используются сингенные мышиные опухолевые клетки), либо иммунодефицитом. Модели подкожных опухолей являются недорогими и быстро производят данные; Их конечный рост опухоли может быть легко и неинвазивно измерен. Однако 88% новых соединений, которые продемонстрировали противоопухолевую активность в таких моделях, не проходят в клинических испытаниях. 11 Это отчасти связано с межвидовыми различиями между людьми и мышами; Однако большая часть этого отказа объясняется низким прогностическим значением подкожных моделей мыши.
Модели ортотопических мышей, в которых опухолевые клетки вводятся в орган происхождения и, таким образом, растут в их первоначальном микроокружении, поэтому все чаще используются в исследованиях рака. 11 , 12 , 13 , 14 Ортотопические модели не только моделируют местные условия роста опухоли; В результате анатомически правильного участка роста опухоли модели ортотопической мыши также позволяют реалистичное моделирование метастазов и поэтому используются для изучения биологии 8 , 15 , 16 CTC или их реакции на различные методы лечения в CRC. 13 , 17
Основным недостатком ортотопических моделей мыши является их техническая сложность. В зависимости от органа, в который должны вставляться клетки, кривая обучения до тех пор, пока экспериментатор не сможет индуцировать воспроизводимые опухоли, довольно длительный. Это особенно относится к колоректальным раковым моделям, поскольку опухолевые клетки необходимо вводить в стенку кишечника, что часто приводит к перфорации, утечке опухолевых клеток или потере эндолюминальной опухолевой клетки. ЭтоЦелью настоящего изобретения является описание способа подготовки клеток из образцов первичной ткани, двумерных клеточных линий и трехмерной органоидной культуры и их инъекции в слепую мышь. Описанная здесь методика приводит к высокоравномерным опухолям и, в зависимости от биологии опухоли клеточной линии, используемой для инъекций, воспроизводимому образованию отдаленных метастазов и КТК у реципиентных мышей. 15
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Представленные здесь эксперименты на животных были независимо рассмотрены и разрешены институционным и правительственным комитетом по уходу и использованию животных и проводились в соответствии с руководящими принципами Федерации ассоциаций лабораторий животных (FELASA). Были приняты все возможные меры для сведения к минимуму страданий, включая анестезию и обезболивание, или, в случае необходимости, преждевременную эвтаназию.
1. Подготовка клеток и органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте объем 20 мкл с 100 000 клеток для каждой инъекции. Используйте базовую мембранную матрицу (BMM), чтобы предотвратить утечку и обеспечить стандартизированную инъекцию. Чтобы обеспечить воспроизводимые результаты, проводите проверки подлинности клеточной линии ( например , через профилирование STR) через регулярные промежутки времени.
- Получение суспензий первичных клеток из свежей ткани
ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда работайте в стерильных условиях. Немедленная передача свежегоДля обеспечения высокой жизнеспособности клеток требуется резецированная ткань из операционной в лабораторию на льду.
Благополучие пациента и оптимальное лечение всегда должны быть первоочередными. Поэтому образцы тканей для исследования должны быть получены таким образом, чтобы не мешать последующей патологической обработке и постановке резецированной опухоли. Поэтому в большинстве случаев разумно иметь образцы для исследований, полученных квалифицированным патологом, чтобы обеспечить невмешательство в патологический диагноз.- Сразу же после стерильного удаления из резецированного образца (в идеале ~ 1 см 3 ) поместите образец ткани в пробирку объемом 50 мл, предварительно заполненную 20-30 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Храните трубку на льду и немедленно переведите в лабораторию.
- Положите ткань в чашку Петри и дважды промойте ее большим количеством PBS, чтобы удалить оставшуюся кровь.
- Разрежьте ткань на мелкие кусочки (~ 2-4 мм) с помощью scaLpel ( например , с лезвием № 20 или # 36).
- Используйте диссоциатор в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы далее диссоциировать опухолевую ткань с одноклеточной суспензией. Альтернативно, используйте другие протоколы ферментативного расщепления опухоли.
- Подсчитайте клетки полученной одноклеточной суспензии ( например , в сошнике или гемоцитометре).
- Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
- Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
- Подготовка клеточных линий для инъекций
- Растите все клеточные линии колоректального рака в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ) и подготовьте их в день операции.
- Убирайте клетки в соответствии со стандартными протоколами клеточной культуры, подсчитывайте клетки ( например , в сошнике или гемоцитометре) и вычисляйте reqДля всех инъекций в зависимости от количества вводимых животных.
- Подготовьте 3-5х фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца.
- Центрифуга (5 мин при 1500 г) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
- Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
- Подготовка органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ. Все трехмерные органоидные культуры выращивают в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ). Подробные протоколы для органоидной культуры были опубликованы ранее. 18 , 19 , 20 Подобно обычным клеточным линиям, мы рекомендуем объем 20 мкл BMM с 100 000 клетками на инъекцию. Органоиды готовятся в день операции следующим образом:- Подготовьте следующую среду (в следующем(DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Глутамина (200 мМ) + 1% пенициллина / стрептомицина.
- Предварительно заполните 15 мл пробирки 1 мл DMEM / F12 +++.
- Осторожно аспирируйте органоиды с поверхности культуральной пластины и перенесите содержимое 3 - 5 лунок в одну пробирку объемом 15 мл.
- Осторожно сломайте органоиды на мелкие кусочки, пипетируя их вверх и вниз с помощью удлиненной стеклянной пипетки.
- Добавить 5 мл DMEM / F12 +++ в пробирку с последующим центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин.
- После центрифугирования удаляют супернатант, ресуспендируют гранулу в 600 мкл ферментативного диссоциационного буфера и переносят суспензию в одну лунку 6-луночного планшета.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 1-5 минут, а затем тщательно пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы растворить органоиды.
ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте пищеварение с помощью микроскопа; Он завершен, когда все клеточные кластеры диссоциируютD к отдельным ячейкам. - После успешного пищеварения добавьте 1,4 мл DMEM / F12 +++, чтобы остановить переваривание. Затем перенесите все лунки переваренных органоидов на 50 мл пробирку.
- Подсчитайте ячейки и рассчитайте необходимое количество для всех инъекций.
- Подготовьте 3 - 5x фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца
- Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
- Ресуспендировали клетки в BMM до концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и удерживали их на льду.
2. Модель ортотопической мыши
- Подготовка животных-реципиентов для хирургии
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте в качестве получателей 6-8-недельные мыши NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). 21 NSG относятся к числу наиболее иммунокомпрометированных мышей, у которых отсутствуют зрелые B, T и NK-клетки, а также несколько других иммунных дефекты. 21 Они надежно вырабатывают опухоли, даже если низкие числа клеток вводятся и сильно подвержены отдаленным метастазам. Мыши NSG являются прекрасными селекционерами и могут храниться в обычных специальных патогенных (SPF) единицах.- Перед первым разрезом вводят 0,05 мг / кг бупренорфина подкожно.
- Используйте севофлуран при 3-3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря рефлекса пальцевого пальца указывает на достаточную анестезию.
- Накройте глаза анестезированных мышей офтальмологической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Удерживайте мышей в положении лежа на маленьком столе.
- Бритье живота с помощью электробритвы (в качестве альтернативного варианта можно использовать депиляционный крем) и дезинфицировать, по крайней мере, в 3 раза клорексидин / йод и 70% спирта.
- Покройте хирургическое поле стерильными драпировками.
ПРИМЕЧАНИЕ. Использование периоперационных антибиотиков является необязательным и регулируется институциональными рекомендациями.
- Средняя лапаротомия и облучение слепой кишки
- Используйте ножницы (скальпели можно использовать альтернативно), чтобы сделать небольшой срединный разрез (3 - 5 мм) кожи на нижней части живота. Возьмите мускулатуру брюшной стенки с помощью щипцов и аккуратно поднимите ее ножницами, открыв таким образом брюшную полость.
- Выявление и тщательное экстериоризацию слепой кишки с помощью атравматических щипцов. Поместите слепой конец мешка слепой кишки на живот, указывающий краниально.
- После экстериоризации держите влагу в сырой воде, используя теплые солевые тампоны.
- Ортотопическая инъекция, закрытие брюшной полости и послеоперационное выздоровление
- Для инъекции intracecal используйте стандартный 1 мл шприц с 30-футовым канюлем. Установите этот шприц на микроинъекционный насос, который, в свою очередь, установлен на микроманипулятор.
- Тщательно схватите кончик слепой кишки с помощью атравматических щипцов и аккуратно разгладьте его, поглаживая его внизD со вторым набором щипцов, смоченных теплым солевым раствором.
- Поместите канюлю прямо над слепой кишкой.
- Выполните следующие шаги под визуальным контролем с помощью бинокулярного хирургического микроскопа.
- Тщательно схватите слепую кишку двумя атравматическими щипцами на обоих концах экстерриториальной части слепой кишки, слегка растяните ее, а затем медленно потяните ее через канюлю, которая расположена параллельно и прямо над ней. Крайне важно не перфорировать всю стенку кишечника (таким образом, вставляя клетки в просвет), а также не перфорировать серозную оболочку за пределы начальной точки проникновения, так как это приведет к утечке и перитонеальному распространению.
- Переместите кишечник в направлении канюли, а не канюлю к кишечнику. Держите и растяните кишечник между двумя щипцами. Руки хирурга должны опираться на поверхность, чтобы уменьшить тремор.
- Внедрение клеток между серозной (рассматривается как очень тонкая, полупрозрачная накладка вышеИнтрамуральные кровеносные сосуды) и мышцы. Поэтому канюлю следует визуально размещать над кровеносными сосудами и под тонкой прозрачной мембраной.
- Используйте ножной переключатель, чтобы начать инъекцию, чтобы уменьшить тремор, пока канюля находится внутри стенки кишечника.
- Как только канюля встанет на место, начните инъекцию. Используйте длительность 20 с, что приводит к установке 1 мкл / с на блоке управления насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекция в поврежденный кровеносный сосуд или вблизи него приводит к прямому внутрисосудистому распространению и отдаленному метастазированию и поэтому его следует избегать. - После завершения инъекции осторожно удалите канюлю, потянув ее назад.
- Поместите сухой тампон под слепой кишкой, а затем тщательно промойте слепую кишку дистиллированной водой, чтобы лизировать просочившиеся клетки и тем самым предотвратить искусственное перитонеальное распространение.
- Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
- После rВдавливая, аккуратно возвращайте слепую кишку в брюшную полость.
- Закройте брюшную стенку с помощью быстрорастворимых швов на 6-0.
- Закройте кожу хирургическими раневыми зажимами.
- Поместите мышь на карту нагрева, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
- Внимательно наблюдайте послеоперационное состояние мышей в течение следующих 48 часов. В случае дистресса обработайте 0,05 мг / кг бупренорфина каждые 12 ч.
- Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день за признаки дистресса из-за роста опухоли.
3. Выделение циркулирующих опухолевых клеток из образцов цельной крови
ПРИМЕЧАНИЕ. Получают кровь путем чрескожной сердечной пункции у анестезированных мышей, за которой следует эвтаназия. В идеале 1000 мкл крови втягивают в шприц, предварительно заполненный 100 мкл антикоагулянта (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или гепарин). Использовать анти-человеческий-EpCAM (адгезия эпителиальных клетокМолекула) для идентификации КТК. Это очень хорошо работает, если линии мышиных эпителиальных клеток используются в модели мыши. Для других приборов могут потребоваться различные антитела.
- Обогащение КТК:
- Предварительно заполните 15 мл пробирки средой с градиентом плотности 5 мл и осторожно переносите кровь в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифуга (30 минут при 300 xg без тормоза) и осторожно удалите верхний супернатант.
- Вылейте остаток в новую 15-миллилитровую пробирку и центрифугу (15 минут, 300 xg с тормозом).
- Восстановите интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки (отбросьте остальную часть), и промойте клетки дважды PBS.
- Ресуспендируют гранулу в 200 мкл PBS / 1% ЭДТА и добавляют 4 мкл антитела EpCAM. Инкубируйте 20 минут на льду в темноте.
- Скрининг и сбор
- Подготовьте следующий буфер (в дальнейшем называемый собирающим буфером): PBS + 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) + 1% пенициллин / SТрептомицин (1%) + 0,8% ЭДТА.
- Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать круг диаметром 1 см в стерильной чашке Петри на 6 см (предотвращает диспергирование жидкости в тарелке) и пипеткой 700 мкл буфера для сбора в этот круг.
- Добавить 50 мкл клеточной суспензии в буфер для сбора 700 мкл в пределах круга. Проверьте плотность клеток с помощью микроскопа. Разделите образец на разные блюда, если он слишком плотный.
- Подождите, пока ячейки опустится (~ 5 мин).
- Экранная суспензия клеток для окрашенных клеток (= EpCAM-положительных).
- Как только ячейка обнаружена, подберите ячейку с микроманипулятором и поместите в буфер 50 мкл в зависимости от предполагаемого анализа ниже по потоку ( например , буфера для экстракции РНК или среды для культивирования).
- В зависимости от предполагаемых анализов нижестояния изолируйте отрицательные клетки EpCAM и / или среду в качестве отрицательных контролей.
- Продолжайте анализы ниже по течению ( например , клеточная культура, ПЦР).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное и воспроизводимое генерирование колоректальных опухолей в этой модели критически зависит от точной инъекции клеток без утечки или утечки. Если это будет достигнуто, эта модель чрезвычайно надежна и очень редко приводит к искусственному перитонеальному распространению. Кинетика роста опухолей, а также их картины распространения зависят от биологии используемых органоидов и клеток. 15 В то время как клетка НСТ116 надежно метастазировать в печень в этой моде...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на их доклинически доказанную активность в подкожных моделях мыши, подавляющее большинство новых соединений терпят неудачу в клинических испытаниях и никогда не попадают в клинику. 11 Эта очевидная недостаточность подкожных моделей мыши для точного моделирования биологии и моделей роста опухолей привела к разработке моделей ортотопических мышей, основанных на инъекции опухолевых клеток непосредственно в исходный орган.
Модели ортотопической мыши способны имит...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Германским исследовательским фондом (WE 3548 / 4-1) и Роланд-Эрнст-Штифтун фюр-Гесундхицвезен (1/14).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильные>среды и компоненты для клеточных культур | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12+++ средний |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12+++ средний |
| добавка Glutamax-I (200 мМ) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12+++ средний |
| пенициллин/ Стрептомицин (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | среда DMEM/ F12+++ DMEM |
| Life Technologies GmbH | 61965026 | основная среда 2D клеточных линий (DMEM/10% FCS) | |
| Фетальная телячья сыворотка (FCS) | BIOCHROM AG S | 0115 | основная среда 2D клеточных линий (DMEM/10% FCS) |
| Ферментативный буфер диссоциации TrypLE Express | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Матрица базальной мембраны Matrigel (BMM, фенол красный свободен) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salt | Salt Technologies GmbH | 14190169 | |
| трипсин-ЭДТА (0,25%, фенол-красный) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-луночные планшеты с крышкой | CORNING | 3516/3548 | |
| колба для клеточных культур 75 см², 250 мл | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| колба для клеточных культур 150 см², 600 мл | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| пробирки Eppendorf 1,5 мл / 2 мл | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 мл, 50 мл центрифужные пробирки | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Счетные стекла (для счетной машины TC20) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| пипетки Пастера (стекло, 150 мм) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | тонкие протяжки с помощью горелки Бунзена |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | для первичного препарата опухолевой ткани |
| MACSmix Tube | Rotator Miltenyi Biotec | 130-090-753 | для первичного препарирования опухолевой |
| тканиMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | для первичного препарирования опухолевой ткани |
| Набор для диссоциации опухоли человека | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | для первичного препарирования |
| опухолевой тканиFalcon 70 и микро; m Клеточный фильтр | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | для подготовки первичной опухолевой ткани |
| Название< | strong>Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Медицинский | ||
| кислород | Air Liquide Medical | GmbH-Бупренорфин | |
| Temgesic-Bepanthen | |||
| - офтальмологическая мазь | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| физиологический раствор 0,9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 мл Шприц (без мертвого объема) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| игла для инъекций 30G | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| целлюлозные тампоны | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Микро-Адсон Щипцы | FST - Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | FST - Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder FST | - Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST - Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (хирургический шов) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Настольный исследовательский наркозный аппарат с промывкой O2 и испарителем севофлурана | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Ультрамикро насос с контроллером Micro4 | World Precision Instruments | UMP3-4 | оборудование для высококонтролируемой ортотопической инъекции |
| Ножной переключатель для SYS-Micro4 Контроллер | World Precision Instruments | 15867 | оборудование для высококонтролируемой ортотопической инъекции |
| Трехосевой ручной микроманипулятор | World Precision Instruments | M325 | Магнитная |
| стойка для микроманипулятора | World Precision Instruments | M10 | |
| Стальная опорная плита для M10 Магнитная стойка для | World Precision Instruments | 5479 | оборудование для высококонтролируемых ортотопических инъекций |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Бритва для волос | AESCULAP - | ||
| хирургический микроскоп | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Название | Company | Номер в каталоге | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Градиент плотности medium – | Ficoll StemCell - Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 античеловеческий клон CD326 (EpCAM) Антитело 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 антимышиный CD326 (EpCAM) Клон антитела G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Чашка Петри, ø 60 x 15 мм, 21 см², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| флуоресцентный клеточный культурный микроскоп | Leica | ||
| Transferman 4r Микроманипулятор | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | аспирационный насос подключен к микроманипулятору | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | требуется для изготовления микрокапилляров для аспирации одиночных клеток | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salt | Life Technologies GmbH | 14190169 | подбирающий буфер |
| Фетальная сыворотка теленка (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | пиринговый буфер |
| Пенициллин/стрептомицин (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | пиринговый буфер |
| ЭДТА | Рот | 8040.1 | подбор буфера |
| Name | Company | Номер в каталоге | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) антитела клон 9C4 | BioLegend | 324201 | иммуногистохимии EpCAM (см, рис. 2C) |
| HRP кролик против мышей IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM иммуногистохимия (см, рис. 2C) |
Ссылки
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
