Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы

Summary

Последовательные добыча соли хроматина связаны белков является полезным инструментом для определения свойств привязки крупных белковых комплексов. Этот метод может использоваться для оценки роли отдельных подразделений или домены в общей схожести белкового комплекса для массового хроматина.

Abstract

Выяснения свойств привязки хроматина таргетинг белков может быть очень сложным из-за сложного характера хроматина и неоднородный характер наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы адаптировали assay последовательный добыча соли (SSE) для оценки относительной привязки сходство хроматина привязанных комплексов. Этот простой и простой assay может использоваться не-экспертов для оценки относительной разницы в обязательную силу сходства двух соответствующих комплексов, изменения в близость комплекса когда субъединицы теряется или инактивированная отдельный домен, и изменения в сродство после изменения ландшафта хроматина. Приостановив последовательно повторно массовых хроматина в увеличении количества соли, мы способны профиль элюции белка от хроматина. Используя эти профили, мы в состоянии определить, как изменения в комплексе chromatin изменения или изменения в окружающей среде хроматина влияют на привязки взаимодействия. Муфта SSE с другими в пробирке и в естественных условиях анализов, мы можем определить роли отдельных доменов и белков на функциональность комплекса в различных средах хроматина.

Introduction

Регулирование ДНК в эукариотических клеток является сложной и сложной системы, которая жестко контролируется ассортимент белков, которые координируют ответы на внутриклеточные и внеклеточной стимулы. ДНК оборачивают вокруг гистона octamers к форме нуклеосом, которые могут быть свободно распространяется вдоль ДНК или уплотняется в жесткой катушек¹. Этот структурный механизм ДНК и гистонов известен как хроматина, которая регулируется сеть белков, которые читать, писать и стереть сообщение поступательные изменения (ПТМ) гистонами². Некоторые гистона PTMs, таких как ацетилирования, изменить заряд аминокислоты, которые они оседают на, изменяя взаимодействие между гистонами и ДНК². Гистона PTMs также служат для набирать транскрипционный анализ регуляторов, ремонтом хроматина, ДНК повреждения ремонт техники и механизма репликации ДНК для конкретных регионов генома³.

Большинство методов для изучения взаимодействия хроматина зонд взаимодействия малых масштабах или привлекать большие генома широкий анализ. В vitro исследования привязки часто используют отдельные рекомбинантных домены с гистонов пептидов или ДНК в анализов таких анализов сдвиг мобильность электрофореза (EMSA), изотермический титрования калориметрии, поляризации флуоресценции и pulldowns пептида. Потому что эти анализы обычно сосредоточены на домене индивидуальных белков, они облегчают понимание небольшой кусок головоломки, но не позволяют нам понять кооперативного характера многодоменной белки, не говоря уже о их роли в нескольких белка комплексы. Еще один слой сложность добавляется гетерогенных состав наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Эта разнородность белка, в сочетании с динамичный характер ландшафта хроматина, делает его сложно резюмировать в естественных условиях привязки взаимодействия белков хроматина хроматина в пробирке.

В естественных условиях методы добились значительных успехов; Однако они часто дорого, много времени и технически сложным. Иммунопреципитации Chromatin, следуют виртуализации (чип seq) является весьма полезной для определения локализации белков и изменения гистона по всему геному, однако она требует существенной оптимизации⁴. Белки являются часто высокоструктурированные chromatin для сохранения взаимодействия; Однако это может производить искусственные взаимодействий и может вызвать epitope маскировки⁵. Кроме того immunoprecipitations (IP) требуют весьма специфических антител и обширные оптимизации ДНК стрижка и IP условий по чип ПЦР с помощью известных привязки сайта, который часто не доступны априори. После оптимизации условий чип обработка образцов является дорогостоящим и требует нескольких недель до месяцев последовательности и анализировать. Хотя этот метод имеет неоценимое значение для выявления локализации хроматина привязывается белки по всему геному, стоимость и время обязательство сделать это непомерно использовать этот метод для генерации гипотез о как небольшие изменения могут повлиять на глобальные привязки свойства .

В этой статье мы описываем, как пробирного последовательный добыча соли (SSE) может использоваться для изучения глобальных привязки профили хроматина прыгните белков и различие, как изменения в профиль белка, сложные, или глобальной PTM может изменять взаимодействий. Хотя соль зубов часто и широко используемый метод, мы демонстрируем, как этот последовательный метод высокую воспроизводимость и универсальным. SSE позволяет характеризовать как один Субблок комплекс или даже одного домена способствует общий комплекс сродство для сыпучих хроматина. SSE может также использоваться для определения, если привязка белка находится под влиянием изменения в ландшафте хроматина, предоставляя интересные гипотезы для гистона Марк ориентации, которые могут быть подтверждены с помощью чип seq и другие исследования генома широкий.

Первоначально мы адаптировали этот метод из Wu et al., изучить функции Polybromo1 (PBRM1) в привязке PBAF хроматина remodeler^6,7. Используя эту технику, мы определены роли PBRM1 для привязки хроматина в пределах PBAF хроматина, реконструкции комплекса и затем определить относительный вклад шести отдельных bromodomains этой функции⁷.

Здесь мы опишем, как оптимизировать этот метод для изучения привязки хроматина в различных типов клеток, чтобы оценить относительная сродство аналогичные хроматина, изменяя комплексы, для изучения перемещения белка от хроматина, химического ингибитор, и определить эффекты хроматина привязки после изменения ландшафта хроматина.

Protocol

1. препараты

1. подготовить 100 мл гипотонический раствор A: буфера 0,3 М сахарозы, 60 мм KCl, 60 мм трис pH 8.0, 2 мм ЭДТА и 0,5% NP-40. Хранить при 4 ºC.
   Примечание: Некоторые клеточные линии, такие как HEK293T, требуют менее строгие лизировать условий. Если ядер лизируют легко, использовать изменение буфера A: 25 мм HEPES рН 7,6, 25 мм KCl, 5 мм MgCl ₂, ЭДТА 0,05 мм, 0,1% NP-40 и 10% глицерина.
2. Подготовить раствор 250 мл 2 x mRIPA раствора: 100 мм трис рН 8,0, 2% NP-40 и 0,5% Дезоксихолат натрия.
3. Подготовить Стоковый раствор 100 мл по 5 М NaCl.
4. С использованием 2 x mRIPA и 5 М NaCl решения, подготовить 50 мл раствора 1 x mRIPA для каждого из шести концентрация соли: 0 мм, 100 мм, 200 мм, 300 мм, 400 мм и 500 мм NaCl. Перед началом эксперимента, прохладно все решения на льду
5. Рост клеток линии желаемых условиях.
   Примечание: При определении последствий стучать вниз белок, SSE для линии нокдаун необходимо сравнить с wildtype клеток. Эти SSE должны быть выполнены бок о бок. Примеры с использованием химических ингибиторов или стимулы, обратитесь к разделам 3-5.

2. Основные последовательные добыча соли

1. урожай 8 миллионов клеток каждого состояния и мыть дважды с 5 мл холодного льда PBS.
   Примечание: Очень важно иметь равное количество клеток иметь эквивалентные белка концентрации. Точное количество клеток может потребоваться быть оптимизированы для отдельных клеточных линий или конкретной белков. Важно, чтобы не иметь слишком много, как увеличение концентрации белка будет препятствовать наблюдению элюции кривой, которая зависит от равновесия привязки. Однако, слишком мало клеток не может быть достаточно белка для определения кривой, и пеллетные chromatin труднее изолировать и может быть потеряно между фракциями.
2. Вновь приостановить клеток в 1 мл буфера A + ингибиторов протеазы, передачи в 1,5 мл пробирок микро и поворот сверху над нижней на 4 ° c на 10 мин
3. Изолировать ядер центрифугированием в 6000 x g 5 мин на 4 ºC.
   Примечание: После этого шага ядерная оболочка должна быть нетронутыми. Если ядерная оболочка нетронутыми, гранулы будут вновь приостановить полностью; Однако когда лизированы конверт и выпущен хроматина, гранулы будет не вновь приостановить. Если ядерная оболочка не нетронутыми после инкубации буфера A, используйте изменения буфера а.
4. Добавить 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl + протеазы ингибиторов для каждого ядра гранул до повторной приостановки Пелле. Однородный каждого образца, закупорить 15 раз с Пипетка 1 мл. Пелле следует вновь приостановить легко, однако, ядер будет лизируют как это накапаны и образец станет толстым и липкое и трудно Пипетка.
   1. Для того чтобы составить гранулы в наконечник, нажмите конце кончика пипетки против нижней части пластиковых пробирок. Гранулы не растворится полностью после того, как ДНК, освобождается от ядра, но закупорить будет разорвать его наверх
5. Когда все образцы были гомогенизированные, Инкубируйте все образцы на льду на 3 мин
   Примечание: Время инкубации может потребоваться быть оптимизированы в зависимости от протеина интереса.
6. Изоляции хроматина Пелле центрифугированием образцы для 3 мин при 6500 g x 4 ºC.
7. Передачи супернатант в центрифугу чистой 1,5 мл трубки. Это будет 0 мм фракция. Это решение mRIPA 0 мм может выступать как мыть шаг лизис ядер и удалите любые свободные белки, не связанные с хроматином.
8. Добавить 200 мкл mRIPA 100 мм NaCl + протеазы ингибиторов для каждого хроматина гранул до повторной приостановки Пелле. Разбить пеллетные chromatin, закупорить Пелле вверх и вниз по 15 раз.
   Примечание: Важно соответствовать количество раз, гранулы в накапаны.
9. Инкубировать на льду на 3 мин. Этот шаг инкубации позволяет все образцы для достижения состояния равновесия, что особенно важно при наличии нескольких образцов.
10. Центрифуг в 6500 x g 3 мин 4 ºC и передачи супернатанта чистой 1,5 мл.
11. Повторить 2.6-2.10 для оставшихся концентрация соли.
    Примечание: После 400 мм NaCl, mRIPA гранулы должны быть ясно и вязком и не будет оставаться в нижней части трубки. Таблетки могут быть помещены в крышке пластиковых пробирок, хотя изолированные супернатант.
12. Добавить 70 мкл 4 x белка загрузки краситель для каждой фракции и загрузить 30 мкл каждой фракции на Полимерность гелей SDS для Западный анализ помаркой.
    Примечание: Чтобы определить профиль связывания белка, важно для загрузки эквивалент томов lysate, вместо загрузки равных белка концентраций.
13. Выполнять Стандартный западную помарку путем передачи на мембрану и использование первичных антител для протеинов интереса.
14. Чтобы quantitate белков этого eluted от хроматина, инкубировать пятно в инфракрасной флуоресценции IRDye вторичные антитела и изображения пятно с формирователь изображений. В то время как другие методы разработки могут быть использованы, мы рекомендуем флуоресценции или инфракрасных изображений, так как это более количественный характер.
15. Использование ImageJ или аналогичного программного обеспечения для расчета интенсивности для белков этого eluted на каждом концентрации соли. По графические интенсивности группы против концентрации соли, может быть определен характер элюции вашего протеина интереса.

3. Последовательные добыча соли в присутствии из " читатель " ингибитор

1. урожая два набора клеток (4 миллиона) и изолировать ядер как стандартный SSE.
2. Вновь приостановить оба набора в 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl и Инкубируйте 3 мин. Это позволит для удаления любого свободного белка в ядрах.
3. Добавить 200 мкл mRIPA 0 мм NaCl в каждой гранулы. Добавление ингибитора (2 мкл 1 мм (+) СВ1) один образец и ДМСО в наборе элементов управления.
4. Взволновать гранулы, закупорить 15 раз и инкубировать на льду на 5 мин
5. Центрифуг в 6500 x g 3 мин 4 ºC и передачи супернатанта чистой 1,5 мл.
6. Повторить 3.3-4 для всех концентрация соли и выполнять стандартные западную помарку.

4. Последовательные добыча соли в присутствии из " писатель " ингибитор

1. лечения клетки с ингибитором (10 мкм Саха) или ДМСО на 3 ч.
2. Урожая 4 миллионов клеток для каждого лечения.
3. Выполнять стандартные SSE для образцов с ингибитором, добавляются все буферы.

5. Последовательные соли извлечения следующие повреждения ДНК

1. лечения клетки с 1 мкм доксорубицина на 1 ч.
2. Измените СМИ на клетки и дать им возможность восстановить за 3 ч.
3. Урожая 8 миллионов клеток и выполнять основные SSE.

6. Не-последовательных добыча соли

1. урожая 12 миллионов клеток и мыть с PBS.
2. Деление клетки так, что есть 2 миллион клеток в микро пластиковых пробирок.
3. Вновь приостановить в 500 мкл буфера A и инкубировать на 10 мин
4. Изолировать ядер центрифугированием в 6000 x g.
5. Вновь приостановить гранул в 200 мкл каждого из mRIPA буферов + NaCl.
6. Однородности каждого образца, закупорить 15 раз с 1 мл кончиком пипетки.
7. Инкубировать на льду на 3 мин
8. Изолировать хроматина центрифугированием при 6500 x g и передачи супернатант для очистки трубок. 70 мкл загрузки красителя и запуск 30 мкл на геля SDS-page для Западный анализ помаркой.

Results

В этой статье мы продемонстрировать преимущества и приложений часто используемых последовательных добыча соли (SSE) метода, который мы адаптировали от литературы⁶. На рисунке 1мы сравниваем воспроизводимость SSE для извлечения белков не последовательно, обнаруживая элюции моделей ARID1a и PBRM1. Мы последовательно соблюдать ARID1a, субъединицы BAF, elutes прежде всего на 200 мм, NaCl и PBRM1, эксклюзивный субъединица PBAF, elutes прежд...

Discussion

Характеристика белков и хроматина взаимодействий через соль экстракции является общий метод, который был нанят для десятилетий^14,15; Однако он не был оптимизирован систематически прежде чем раскрыть свою полезность. Мы демонстрируем, как этот последовательный метод обеспечивает быстрый и недорогой способ отличить изменения в привязке хроматина, при изменении белка или окружающей среды. SSE является очень гибкой и оптимизируемыми, и главное, это технически проста ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
натрия хлорид, кристалл 2,5 кг AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
сахароза, кристалл 500 г AR¨ (СКУД)	Avantor/Macron	8360-04
хлористый калия, гранулированный 500 г AR¨ (СКУД)	Avantor/Macron	6858-04
Основание Trizma(R), Первичный стандарт и буфер, >=99,9% (титрование), кристаллический	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) Тетрауксусная кислота, соль динатрия, дигидрат 125 г AR (ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 СУБСТРАТ, 100 мл UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Буфер раствор (1M)	Gibco	15630-080
магния хлорид, 6-гидрат, кристалл 500 г AR¨ (СКУД)	Avantor/Macron	5958-04
ГЛИЦЕРИН, 1 л	Amresco	0854-1 Л
ДЕЗОКСИХОЛЕВАЯ КИСЛОТА НАТРИЕВАЯ СОЛЬ, 100 г	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus пипетка	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R охлаждаемая микроцентрифуга	Eppendorf	5424 R
Вторичная мышь IgG HRP-связанная	Клеточная сигнализация	7076
Вторичный кролик IgG HRP-связанная	клеточная сигнализация	7074
BMI-1 антитело	Millipore
PBRM1 антитело	Bethyl	A301-591A
ARID1a	антитело Santa Cruz	sc-32761
BRD4 антитело	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Доксорубицин	AK Scientific	25316-40-9
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Gel Tank	ThermoFisher	A25977
Альбумин, бычий (BSA)	Amresco	0332-100g	Используется в качестве 5% раствора в PBS-T в качестве блокирующего раствора для западных блоттингов
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, от 10 до 250 кДа	ThermoFisher	26619
Methyl Спирт, безводный	Macron	3041-10
Trypsin kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
АЗИД НАТРИЯ, 250 г UN1687	Amresco	0639-250G
НАТРИЯ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТ (SDS) 500 г UN1325	Amresco	0227-500G
Глицин, для электрофореза, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1кг
BigTop Микроцентрифужные пробирки, полипропилен	VWR	20170-333
1000 &; L Pipet Tips	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfath, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	Используется для раствора ингибитора протеазы.
АПРОТИНИН, 10 мг	RPI Research Products	20550-0.01	Используется для раствора ингибитора протеазы.
ПЕПСТАТИН А, 5 мг	RPI Research Products	30100-0.005	Используется для раствора ингибитора протеазы.
OVCA429 клетки	Подарок от Карен Коуден Даль. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa элементы	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A media	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), порошок	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) заменимая аминокислота	Gibco	11140-050
FB-11: фетальная сыворотка крупного рогатого скота, источник США	Omega Scientific	FB-11
раствор пенициллина-стрептомицина Life	Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
пируват натрия	Life Technologies	11360070
VWR Power Источник:	VWR	13-690-032