Анализ лимфоцитов экстравазации спользование In Vitro Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Краткое содержание

Здесь мы описываем модель гематоэнцефалического барьера человека, позволяющую исследовать трансмиграцию лимфоцитов в центральную нервную систему in vitro.

Аннотация

Лимфоцит экстравазация в центральную нервную систему (ЦНС) имеет решающее значение для иммунного надзора. Болезни, связанные с изменениями в лимфоцитах кровоподтек может привести к патофизиологических изменений в ЦНС. Таким образом, исследование миграции лимфоцитов в ЦНС важно понимать, воспалительные заболевания ЦНС и для разработки новых подходов терапии. Здесь мы представляем модель в пробирке человеческого гематоэнцефалического барьера для изучения лимфоцитов кровоизлияния. микрососудистый мозг человеческого эндотелиальные клетки (HBMEC) являются confluently, выращенные на пористом полиэтилентерефталате Transwell вставки, чтобы имитировать эндотелий из гематоэнцефалического барьера. Функция Барьера подтверждено блокатора малой зоны иммуногистохимии, трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измерения, а также анализ Evans Blue проникания. Эта модель позволяет исследование диапедеза редких субпопуляций лимфоцитов , такие как CD56 CD16 ^{ярко тусклые / -} клетки NK. Furthermруды, влияние других клеток, цитокинов и хемокинов, связанных с болезнью изменений, а также различных схем лечения на миграционный способности лимфоцитов могут быть изучены. И, наконец, воздействие воспалительных стимулов, а также различные режимы лечения на эндотелиальном барьере может быть проанализированы.

Введение

Лимфоцит миграция из крови в ткань имеет решающее значение для иммунного надзора. Последовательность конкретных молекулярных взаимодействий обеспечивает сайт - специфическое экстравазации в тонком кишечнике, кожи, лимфатических узлов, центральной нервной системы (ЦНС), и других тканей ^1. Изменения в миграции лимфоцитов участвуют в патофизиологии ряда широких распространенных заболеваний ^2. Миграция в иммунной привилегированном ЦНС жестко регулируется и , соответственно , изменения этого процесса вовлечены в ЦНС заболеваний , связанных как энцефаломиелита ^3, оптиконевромиелит, инсульт и рассеянный склероз (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Поэтому важно изучить лимфоциты кровоизлияния, чтобы лучше понять патофизиологию болезни и разработать инструменты для агромелиорация болезни бремени ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Лимфоциты мигрируют в ЦНС с помощью различных маршрутов. Экстравазационный через посткапиллярные венули в субарахноидальное пространство через кровь цереброспинальной жидкости барьера в пределах сосудистого сплетения и через гематоэнцефалический барьера, были описаны ^{1, 13, 14, 15.} Миграция через гематоэнцефалический барьер проводится при взаимодействии лимфоцитов с эндотелиальными клетками ^14. В отличие от эндотелиальных клеток на периферии, эндотелиальные клетки ЦНС экспрессируют высокие количества плотных молекул перехода, таким образом, строго ограничивая количество клеток и белков, способных пересекать гематоэнцефалический барьердеваха = "Xref"> 16. Результаты Воспаления в разрыхлении плотных контактов и индуцируют экспрессию молекул адгезии; Таким образом, усиление миграции лимфоцитов в ЦНС ^{1, 17, 18.}

Экстравазационный через гематоэнцефалический барьер является многоступенчатым процессом. Лимфоциты привязь к клеткам эндотелия , а затем катиться по эндотелию в процессе , главным образом , опосредованного селектинов ^{1, 15.} Впоследствии, взаимодействия между хемокинов , секретируемых эндотелием и соответствующих рецепторов хемокинов , выраженные на лимфоциты индуцируют конформационные изменения интегринами, тем самым способствуя твердую адгезию к клеткам эндотелия ^1. И, наконец, лимфоциты либо ползать по эндотелиальному барьеру против кровотока, прежде чем переселяется в периваскулярное пространстве, или срыв немедленно и непосредственно радиопередающиеigrate на сайте фирмы адгезии ^{1, 19, 20.} Все эти этапы экстравазации лимфоцитов могут быть проанализированы в пробирке с использованием различных методик ^21. Покадровое видео микроскопия используется для изучения начальных привязывать и прокатки ^15. Адгезионные анализы предоставляют подробную информацию о твердом аресте в эндотелиальные барьеры ^22. Трансмиграция анализы , как продемонстрировано здесь , позволяют анализ иммунной клетки трансмиграции ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Использование человека в пробирке крови барьер мозга модель, недавно мы могли бы показать , что выше MIGRAtory емкость CD56 CD16 ^{ярко тусклая / -} клетки NK по сравнению с их CD56 ^DIM CD16 ⁺ аналоги отражались преобладанием этой субпопуляции NK в интратекальной камере ^21. Таким образом, наша экспериментальная установка , кажется, подходит для имитации ситуации в естественных условиях.

Протокол

1. Культура клеток головного мозга человека микрососудистой эндотелиальных клеток (HBMEC)

1. Окраска клеточной культуры колб
   1. Для приготовления раствора фибронектина, добавляют 10 мл PBS в 15 мл центрифужной пробирки. Добавьте 150 мкл фибронектин и хорошо перемешать.
   2. Для того, чтобы покрыть дно Т-25 клеточной культуры колбу добавляют 2 мл раствора фибронектина. Инкубируйте колбы для культивирования клеток в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С в инкубаторе. Фибронектина покрытием колбы может храниться в течение 2 недель при 37 ° С / 5% CO _2.
2. Посевная и культуры клеток из HBMEC
   1. Аспирируйте раствор фибронектина со дна колбы для культивирования клеток. Добавить 7,2 × 10 ⁴ HBMEC / см² суспендируют в 6 мл ЕСМ-б среды (= ЕСМ-Ь с добавлением 5% сыворотки плода коровы, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% добавки для роста клеток эндотелия). Инкубируют при 37 ° C / 5% CO _2. Проверьте рост клеток ежедневно с помощью микроскопа.
   2. Изменение среды каждые 3 дня.Урожай или разделить клетки, когда HBMEC достигают примерно 80% сплошности. HBMEC следует использовать между прохождением 1 и 15, чтобы избежать потери физиологических свойств.
3. Урожай HBMEC.
   1. Подготовка Accutase раствора путем смешивания Accutase (1x) с PBS в соотношении 1: 1. Хранить Accutase раствора при 37 ° С в водяной бане до дальнейшего использования.
   2. Передача ЕСМА-B среды из колбы для культивирования клеток в 15 мл центрифужной пробирки. Промыть HBMEC путем добавления 5 мл PBS на дно колбы для культивирования клеток. Аспирируйте PBS, и повторить стадии промывки еще два раза.
   3. Добавить 2 мл подогретого Accutase раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин. После этого, HBMEC ресуспендировали, твердо нажав клеточную культуру колбы несколько раз. Открепления клеток контролируется с помощью микроскопа
   4. ЕСМ-б-среда ранее сохраненная в трубке 15 мл добавляют обратно в колбу для культивирования клеток, как только HBMEC начинают отделяться. Промыть дно колбы несколько раз, пока большинство HBMEC нересуспендировали.
   5. Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужной пробирки. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл ЕСМ-б среды. Граф клеток и разбавленной клеточной суспензии , чтобы достичь конечной концентрации 3 × 10 ⁵ HBMEC на мл ЕСМ-б среды.

2. Получение клеточной культуры вкладышами

1. Покрытие клеточных культур вставок
   Важное замечание: Не прикасайтесь к мембране вставок клеточных культур.
   1. Добавьте 100 мкл раствора фибронектина (см 1.1.1) для каждой клеточной культуры вставки (рисунок 1А) и одну лунку 96-луночного плоским дном пластины (а оптического контроля). Инкубировать в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С. После инкубации аспирата фибронектина раствора.
   2. Добавьте 100 мкл суспензии HBMEC к вставкам культуры клеток и оптический контроль скважины. Добавьте 600 мкл ЕСМ-б среды в нижнее отделение ячейкикультуры вставки. Инкубируют в течение 3 - 4 дней при 37 ° C / 5% CO ₂ до целостности барьера (фиг.1В) достигается, проверить рост клеток путем микроскопического оценки HBMEC в оптическом контроле хорошо. Примечание: рост клеток за четыре дня не рекомендуется.
   3. Необязательно: Для имитации воспалительных состояний аспираты среды из нижнего отсека и заменить его ЕСМ-б среды с добавлением 500 ед / мл IFN-gamma / TNF-alpha 24 ч предварительного анализа миграции.

3. Контроль качества Evans Blue, на день анализа Трансмиграции

1. Приготовление раствора синего Эванса
   1. Для приготовления PBS / B27 смеси 10 мл раствора PBS 200 мклы B27 добавки с использованием 15 мл центрифужной пробирки. Развести Evans Blue маточного раствора (20 мг / мл PBS), 1: 1 000 с PBS / B27.
2. Эванс синего анализа проницаемости
   1. Аспирируйте среды из нижнего отсека, затем верхний отсекиз одной клеточной культуры, содержащей вставку сливающийся HBMEC монослой. Добавьте 100 мкл синего Эванса решение вставки клеточной культуры.
   2. Добавьте 600 мкл PBS / B27 в нижний отсек и инкубируют в течение 60 мин при 37 ° C / 5% CO _2. Осторожно удалите вставку для культивирования клеток с помощью щипцов.
3. Эванс синий измерение
   1. Удалить PBS / B27 из нижнего отсека и передачи 100 мкл каждого к двум лунки черного полистирола 96-луночного плоской нижней плите. Вставьте пластину в считывающем Tecan Бесконечного M200 Pro пластины и определить оптимальную Z-позицию.
   2. Мера возбуждения синего Эванса с использованием соответствующих настроек (например: возбуждение: 620 нм, излучение 680 нм, ширина полосы частот возбуждения: 9 нм, ширина полосы излучения: 20 нм, повышение 175x, 25 мигает, время интегрирования: 20 мкс).
   3. Для того, чтобы определить, барьерные функции HBMEC сравнить данные приобрели со стандартным кривым, изображающей Evans Blue проникания через HBMEC в различные моменты времени после семениING клетки (рис 1В, справа).

4. Анализ миграции

1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).
   1. Добавляют 10 мл RPMI в 15 мл центрифужные пробирки и добавляют 200 мкл B27 дополнения. Граф РВМС и центрифужные клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить РВМС до конечной концентрации 5 × 10 ⁶ клеток / мл RPMI / B27.
2. Настройка из анализа миграции
   1. Аспирируйте среда из нижнего отсека , затем верхний отсеком для культивирования клеток , содержащих вставки сливающегося HBMEC монослоев (Фигура 1А). За донора добавляют 100 мкл суспензии РВМС каждый к вставкам клеточных культур , а также одну лунку 24-луночного планшета на (в пробирке) управления.
   2. Добавьте 600 мкл RPMI / B27 в нижний отсек вставки для культивирования клеток и 500 мкл в РВМС контроля в пробирке и инкубируют в течение 6 ч при 37 ° C / 5% CO _2.
   3. Заготовка мигрированного РВМСА
      1. Выньте вставку для культивирования клеток с помощью щипцов и тщательно промыть дно с 400 мкл PBS, не касаясь мембраны. Выбросьте вставку для культивирования клеток.
      2. Добавьте 20 мкл подсчета потока флуоросферы (около 1000 бусин / мкл) в нижнем отсеке клеточной культуры вставки, а также к контролю в пробирке и хорошо перемешать. Передача 1 мл суспензии РВМСА в результате проточной цитометрии трубок.

   5. Проточная цитометрия

   1. Базовые приготовления
      1. Центрифуга РВМС при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Готовят раствор антител путем добавления Флуорохром-конъюгированные антитела к 100 мкл буфера проточной цитометрии (PBS / 1% БСА / 2 мМ ЭДТА) на образец. Для получения результатов, представленных ниже 1 мкл CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 мкл CD56-PC7, 1 мкл CD8-A700, и 1 мкл CD16-A750 были использованы на образец.
      3. Re-приостановить PBМС в 100 мкл раствора антител и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С.
      4. Добавьте 250 мкл буфера для проточной цитометрии и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин.
   2. приобретение образца
      1. Повторное приостановить РВМС в требуемом количестве (варьируется в зависимости от используемого проточного цитометра) проточной цитометрии буфера.
      2. Acquire окрашенную РВМС с использованием проточного цитометра с активным детектором между 525 и 700 нм для обнаружения потока подсчета флуоросферы (возбуждение 488 нм, излучение 525 - 700 нм).
         (Следующие шаги являются примером, если используется поток Gallios цитометр работает с программным обеспечением Калуца ​​G:. (1) Запустить компьютер (2) Когда операционная система полностью загружена, начинается поток цитометра, нажав кнопку «цитометра на» кнопке . (3) Загрузите соответствующий протокол сбора, нажав кнопку «открытого протокола». (4) выберите нужный протокол и выберите «открыть». (5) Дублирование протокола для каждого образца, щелкнув справакнопка мыши на протоколе видимого в виртуальной карусели и левой кнопкой мыши на поле «Дубликата». (6) Добавьте каждый образец в списке выборки. (7) Передача образцов в указанных положениях карусели и начать приобретение.)
   3. анализ проб
      1. Открыть в результате проточной цитометрии данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Определение количества субпопуляций , представляющих интерес для переселилась РВМС, а также из клеток в пробирке контрольных лунок , и поток подсчета флуоросферы с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа.
         (Пример стратегии стробирования приведен в части результатов (рисунок 1 C: Для анализа трансмиграцию НК-клеток подмножеств, сначала выбрать лимфоциты в вбок рассеяния канала (SSC) в сравнении вперед разброс канала (FSC) участка Лимфоциты. затем отображается в CD3 против CD56 и CD56 сюжета ⁺ CD3 ^-. выбраны клетки NK Чтобы различать NK-клеток подмножеств, клетки NK отображаются вCD56 против CD16 и CD56 сюжет ^яркий CD16 ^{тусклый / -} а также CD56 ^{тусклый} CD16 ⁺ NK - клетки выбраны. Кроме того, граф потока флуоросфера выбираются из FSC против SSC участка, а затем отображаются на участке канала с испусканием в диапазоне от 525 до 700 нм в зависимости от времени, чтобы определить их число.)
      2. Для того, чтобы вычислить общее количество клеток каждой пробы, нормализует обнаруженное число клеток с помощью подсчета потока флуоросферы:
         
      3. Определить процент мигрировавших клеток , как соотношение между общими мигрировавших клеток и общего числа клеток в контроле в пробирке.

Результаты

Типичные результаты , показывающие трансмиграцию NK-клеток и подмножеств Т-клеток с использованием человеческой гематоэнцефалического барьера модели (рисунок 1А) показаны. Целостность монослоя HBMEC была подтверждена окрашиванием плотных соединений молекулы ZO-1, трансэндотелиальное измерение электрического сопротивления (Тир), и Evans Blue инфильтрация (Фигура 1В). После 3 - 4 дней культуры HBMEC выразил плотную соединительную молекулу ZO-1 (Фиг...

Обсуждение

Здесь мы представляем технику для исследования перевоплощения лимфоцитов через человек гематоэнцефалического барьера. В пробирке анализа лимфоцитов миграции в ЦНС важно изучить основные процессы лимфоцитарного кровоподтека, потенциальных изменений , связанные с болезнью, и новых терапевтических подходов.

Несколько модификаций барьерной модели гематоэнцефалической возможны. Например, клетки из верхнего отсека могут быть проанализированы, чтобы исследовать состав населения неперемещен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PBS	Gibco	14190-094	без CaCl2 или MgCl2
Fibronectin 1 мг/мл	Sigma	F1141-5MG	плазмы крупного рогатого скота
	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Пенициллин/стрептомицин	ScienCell	1001-b
Добавка для роста эндотелиальных клеток	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	прозрачный, диаметр 6,5 мм, 3,0 & микро; m размер пор
96-луночная плоская нижняя пластина	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	стоковый раствор: 1 г/50 мл PBS
B27	Gibco	17504-044	50x концентрированная
Infinite M200Pro	Tecan
96-луночная черная плоская нижняя пластина	Greiner BioOne	675086
48-луночная пластина	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Подсчет потока Флюоросферы	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-цветный проточный цитометр	Beckman Coulter
Kaluza 1,5a	Beckman Coulter
TNF-α	Пепротех	300-01А ИФН
-&гамма;	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	клон UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	клон N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	клон 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	клон RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	клон B9.11