Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Длительная инкубация Острый нейронную ткань для электрофизиологии и кальций-изображений

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55396

⸱

15 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The MARCS Institute, Western Sydney University, 2School of Medicine, Western Sydney University

В этой статье

Краткое содержание

После удаления из организма, нервной ткани в значительной степени зависит от условий окружающей среды, что приводит к возможному ухудшению ткани после того, как 6 - 8 ч. Используя уникальный метод инкубации, который внимательно следит и регулирует внеклеточный среду ткани, жизнеспособность тканей может быть значительно расширена в течение> 24 ч.

Аннотация

Острые препараты нервной ткани, мозг ломтиками и Wholemount сетчатки глаза, как правило, может сохраняться только в течение 6 - 8 ч после рассечения. Это ограничивает время эксперимента, а также увеличивает количество животных, которые используются в исследовании. Это ограничение конкретно влияет на протоколы, такие как изображения кальция, которые требуют длительной предварительной инкубации с ванной-прикладному красителей. Экспоненциальный рост бактерий в течение 3 - 4 ч после того, как нарезка тесно коррелировало с уменьшением здоровья ткани. В данном исследовании описан способ ограничения распространения бактерий в острых препаратах для поддержания жизнеспособных невральной ткани в течение длительного периода времени (> 24 ч) без необходимости антибиотиков, стерильных процедур или тканевой культуральной среде, содержащей факторы роста. Велосипедным внеклеточную жидкость через УФ-облучения и поддержание ткани в пользовательской удерживающей камере при 15 - 16 ° С, ткань не показывает никакой разницы в электрофизиологических свойств, или си кальцияgnaling через внутриклеточных красители кальция в> 24 ч postdissection. Эти методы не только продлить время эксперимента для тех, кто использует острый невральной ткани, но уменьшит количество животных, необходимых для завершения экспериментальных целей, и устанавливает золотой стандарт для профилактики острой инкубации нервной ткани.

Введение

Электрофизиологии и функциональной визуализации (кальций, напряжение чувствительных красителей) являются одними из наиболее часто используемых экспериментальных методик в области неврологии. Мозговые препараты срезов и Wholemount сетчатки глаза, который будет рассмотрен здесь, служат средством изучения электрофизиологических свойств и синаптические соединения без загрязнения от анестетиков или мышечных релаксантов. Мозговые срезы и сетчатки глаза Wholemount сохраняют свою структурную целостность, в отличие от культур клеток или гомогенатах, что позволяет изучение конкретных цепей и сетей мозга 1. Записи из изолированной ткани имеют преимущества по сравнению с записями в естественных условиях , как движений , связанных с сердцебиением и дыханием устраняются. Кроме того, прямая визуализация позволяет определенные классы ячеек для адресных и местное применение фармакологических средств 2, 3.

Патч-зажим записи и известковоНМУ краситель загрузкой в ​​Wholemount сетчатки глаза осложняется наличием внутренней ограничивающей мембраны (ILM), который покрывает слой ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и предотвращает прямой доступ к клеткам. Как правило, эта мембрана разгреб со стеклянной пипеткой для прямого применения заплатки пипеткой и формирования gigaohm печатью на одной ячейке. Кроме того, ванны с нанесенным красители кальция не пересекают ILM и либо должен быть введен под этой мембраной 4, ретроградно транспортируются после инъекции в зрительный нерв 5 или электропорации через ткань 6. Кроме того, при использовании грызуна модель пигментный ретинит, то й / й мышь, ILM толще и более непроницаемой. Здесь мы используем технику для удаления ILM с ферментативным расщеплением 7, чтобы обеспечить как вездесущий кальция краситель-налива, а также прямой доступ к ганглиозных клеток сетчатки для патч-зажим recordiNGS 8.

Успешные записи либо из срезов головного мозга или Wholemount сетчатки зависят от рассечения и инкубации жизнеспособной нервной ткани. Как правило, ткань извлекают утром эксперимента и инкубируют в искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) до тех пор, пока используется для записей. Как правило, ткань остается жизнеспособной в течение 6 - 8 ч, со значительным ухудшением следующего временного окна. Тем не менее, оба срезах мозга и Wholemount препараты сетчатке обычно производят больше ткани, чем может быть записан с в течение этого короткого периода времени. Следовательно, ткань часто отбрасываются в конце дня и рассечение завершается снова в последующие дни. Это означает, что используется другое животное и ~ 2 ч установки и рассечение / окрашивания повторяется. Следующий протокол описан способ продления срока службы нервной ткани в течение более 24 ч, а это означает меньше животных используются, и более экспериментальное время доступно. Ткань жизнеспособность шкак оценено посредством записи электрофизиологических свойств и динамики кальция, и эти свойства были неотличимы от <4 ч и> 24 ч postdissection.

Эти результаты указывают на то, что не только единичные свойства ячеек нетронутыми и функциональный после длительной инкубации, но сетевую активность, как оценено с помощью кальций-визуализации и Электрофизиологические записи, неизменна> 24 ч postdissection. Кроме того, показано, что красители кальция может оставаться в клетках в течение длительных периодов, не вызывая каких-либо отрицательных последствий. Применение этого протокола свидетельствует о том, что функциональная активность нейронов в острой нервной ткани может сохраняться в течение длительного времени после того, как внешняя среда сильно регулируется. Кроме того, как жизнеспособность тканей очень широк и варьируется между лабораториями в связи с различными протоколами инкубации, этот метод устанавливает золотой стандарт для идеальных параметров, которые должны применяться для снижения изменчивости в здоровье острого NeuRonal ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол ниже описывает получение C57BL / 6 и С3Н / Он (retinally вырожденный) мыши нервной ткани, но подобные методы могут быть применены к другим видам. Все животные были здоровы и обработаны с помощью стандартных условиях температуры, влажности, 12 ч цикл свет / темнота, свободный доступ к пище и воде, а также без каких-либо стрессовых стимулов, предназначенных. Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с Western Sydney University Уход за животными и комитет по этике и в соответствии с использованием животных и руководств по уходу (Animal Research Authority # A9452, # A10396 и # A8967).

1. Мозг Кусочек Приготовление

  1. Обезболить животное при вдыхании изофлуран (5%) и обезглавить с помощью грызуна гильотину. Удалить мозг быстро, как было описано выше 9 и поместить его в охлажденный льдом физиологический раствор (ACSF) , содержащий (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25Раствором NaHCO 3, 25 декстрозы, и его насыщают карбогена (95% O 2/5% смеси СО 2; 310 мОсм, рН 7,4).
  2. Вырезать срезах мозга, в области, представляющей интерес, 300 мкм с вибрирующим микротома.
  3. Перенесите ломтики в пользовательский встроенной системы инкубации , которая близко контролирует и регулирует уровень рН (рН 7,2 - 7,4), поток карбогена и температуры , как описано выше 10, 11.
  4. Установить начальную температуру в камере до 35 ° С в течение 15 - 30 мин, а затем медленно снижают до 15 - 16 ° C , как показано на фиг.1С. Затем инкубировать срезы в инкубационной системы до тех пор, пока это необходимо, либо для электрофизиологических или изображений.
    Примечание: Если срезы, которые будут использоваться для кальция визуализации, выполните указанные ниже действия перед охлаждением ткани ниже комнатной температуры.

2. сетчатке Wholemount Подготовка и внутренняя пограничная мембрана для удаления

  1. Подготовка wholemounts сетчатки глаза под нормальным либолабораторные условия освещения или тусклый красный / инфракрасный свет.
  2. Эвтаназии животных путем смещения шейных позвонков и немедленно вылущивать глаза. Сделайте небольшой разрез вдоль зубчатый край, и место в любом Ames средах или ACSF , содержащего (мм): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 глюкозы, 0,5 L-глутамина, и насыщают карбогена (95% O смеси CO 2 2/5%; ~ 300 мОсм, рН 7,4), при комнатной температуре.
  3. Немедленно удалите роговицу, хрусталик и стекловидное путем разрезания вдоль зубчатый край с маленькими ножницами и удалением хрусталик и стекловидное с пинцетом. Поместите ткань в системе инкубации при комнатной температуре.
    Примечание: ткани сетчатки может поддерживаться в наглазник, после снижения температуры до медленного 15 - 16 ° C, в течение> 24 ч в инкубационной системы до тех пор, пока это необходимо.
  4. Чтобы удалить ILM, перенести наглазник, содержащую сетчатку в небольшой стеклянный сосуд, содержащий 30 Ед / мл папаин, 1 мМ L-цистин, 0,5 мМ ЭДТА и 0,005% ДНКазы в Earl's-Сбалансированный солевой раствор (BSS), при 37 ° С в течение 20 мин. Применить 95% O 2/5% CO 2 в раствор через крышку , но не пузырь. При использовании ткани от молодых животных (<6 недель), разбавьте раствор до вполсилы.
    1. Прекратить ферментативного пищеварения, помещая ткань в растворе овомукоид (10 мг / мл) и БСА (10 мг / мл) в течение 10 мин в ПБС Эрла. Вымойте ткань тщательно ACSF перед переносом в инкубационной системы и снизить температуру до 15 - 16 ° C.
  5. Поддерживать ткани сетчатки в глаза чашке, пока не понадобится. Для перевода в микроскоп, изолировать сетчатку от глаз чашку и разрезать на 4 части с бритву. Если требуется вся сетчатка, сделать четыре небольшие порезы на периферии сетчатки, чтобы позволить ему лежать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с изображениями, нагрузкой с кальциевой красителей перед переносом в инкубационной системы, смотрите ниже.

3. Поддержание ткани в инкубаторе

  1. Место ткани в основной камере , содержащей зонды для измерения рН и температуры (рис 1а, б).
  2. Циркулируйте ACSF через вторую камеру (UVC камеры, построена как описано ранее 12) , выделенных из основной камеры и подвергаются воздействию 1,1 Вт UVC света (254 нм, 5 Вт / 2P стерилизатор УФ - лампа) для того , чтобы Eradiate бактерий , плавающих в растворе (рис 1А). Контроль УФС стробоскопа с помощью программируемого таймера с использованием случайной функции, который включается временами колеблется от 15 до 26 мин через каждые 15 - 30 мин, чтобы избежать чрезмерного нагрева ACSF.
  3. Установите скорость потока в камере УФС до 12 мл / мин , как сообщалось ранее 12. Крышка камеры UVC с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить UVC освещение снаружи камеры, которая может повредить нейронную ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения приспособленности к темноте ткани сетчатки, нанесите заказные крышку основной камеры, чтобы исключить свет.
  4. Используйте перистальтический насос для циркуляциейТЕ раствор (ACSF) через две камеры и Пельтье термоэлектрический холодный пластинчатый охладитель либо охлаждать или нагревать основную камеру до желаемой температуры в диапазоне 0 - 50 ° C. Для инкубации оптимальной ткани, используют 15 - 16 ° C для долгосрочной жизнеспособности.

4. Кальций Dye Загрузка

  1. Выберите красители кальция на основе предпочтений отдельного исследователя. Здесь мы используем фура-2АМ, Fluo-8AM или Fluo-4 утра. Тем не менее, этот метод может быть применен к другим красители , а также: растворить красители кальция в ДМСО к блоку 1 мМ раствор и 1% сополимеров (например, Pluronic кислота-127) до конечного объема 50 мкл и разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
  2. Добавить решение ACSF до конечной концентрации 10 мкМ, 0,01% блок-сополимеры для срезов мозга, и 20 мкМ (сетчатка), 0,02% блок-сополимеры для сетчатки. В сетчатке (папаин лечение) и срезах мозга от молодых животных, загрузка в ванне в течение 45 мин при 37 ° C (фура-2 AM) или при комнатной температуре (Fluo-4 AM, FLuo-8 AM).
    1. Для взрослых животных (> 12 недель) пипеткой красители (50 мкл) непосредственно на срезах мозга, и поддерживать в течение 75 мин, чтобы обеспечить лучшее проникновение красителя в глубокие слои.
    2. Для того, чтобы обеспечить адекватную оксигенацию погруженной среза во время инкубации с красителем, получения стеклянной загрузочную камеру с закрытой крышкой (круглой баночке диаметром 2,5 см, 3,5 см высотой) с красителями кальция, разведенного в 2,5 мл ACSF. Кислородсодержащих соединений непрерывно с 95% O 2/5% CO 2. Не пузырь.
  3. После загрузки красителя, промойте ткань с ACSF и переход к системе инкубации, медленно снижают температуру до 15 - 16 ° C до экспериментального использования.

5. Электрофизиологические записи и обработки изображений

  1. Поместите ткань в затопленную камеру записи под микроскопом, и заливать с окисленной ACSF при скорости потока 4 - 5 мл / мин либо при комнатной температуре (~ 22 ° C) или физиологической температуре (~ 35 ° С). Хольd ткань на месте, используя выполненное на заказ '' арфа '', сделанный из нейлона или золотыми нитями растянутых и склеенных через U-образный кусок золота или платиновой проволоки.
  2. Для электрофизиологии:
    1. Подготовка записи пипеток от 1,5 мм (1,19 мм ID) боросиликатного стекла с использованием микропипетки съемник для достижения конечного сопротивления 5-6 МОм.
    2. Заполните пипетку с 3 - 4 мкл внутреннего раствора , как описано ранее 13 и визуализировать клетки под инфракрасным Дифференциальная интерференционного контраста (ИК-DIC) с помощью ПЗС - камеры. Внутриклеточное решение должно быть адаптировано для каждого эксперимента для достижения экспериментальных результатов.
    3. Позиция пипетка, сохраняя при этом положительное давление, подаваемое через всасывающее отверстие на держателе пипеток, на мембране клетки, используя микроманипулятора. Поскольку ILM была удалена из сетчатки, не требуется никакого предварительного мембранного соскоб. После того, как пипетка находится на клетке, нежный отрицательныйдавление в пипетке для достижения gigaohm уплотнения. Затем разрывают клеточную мембрану с коротким количеством отрицательного давления.
    4. Сделать цельноклеточная или напряжения по текущим-зажим записи с использованием стандартных методов в зависимости от обстоятельств.
  3. Кальций изображений:
    1. Для логометрической визуализации Fura-2, используют сверхвысокую скорость длин волн переключатель для обеспечения возбуждения длинами волн 340 нм и 380 нм. Pass, излучаемый свет от отдельных клеток через фильтр излучения 510 ± 20 нм, а также захватить с высокой чувствительностью, высокоскоростной цифровой камерой.
    2. Для одной длины волны возбуждения Fluo-4, фильтр возбуждения света через 460 - фильтр нижних частот 490 нм полосы и испускаемого света через 515 - фильтр нм полосы пропускания 550. Для самых быстрых и наиболее чувствительной записи использовать цифровую камеру высокоскоростной такой. Получение изображений по мере необходимости.
    3. Мера изменения флуоресценции в зависимости от времени, либо на одной длине волны (Fluo-4), или с использованием соотношения длин волнМетод (фура-2), как было описано выше 8, 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Жесткое регулирование бактериальной нагрузки и температуры ACSF во время инкубации имеет важное значение для поддержания жизнеспособности нервной ткани. Это может быть оптимизировано с помощью облучения UVC света и поддержания температуры ACSF при 15 - 16 ° С (рисунок 1). Кроме того, ACSF параметры штампа (APS; фиг.1С) обеспечивает экспериментатору с записью условий окружающей среды (рН и температура), таким образом предлагая золотой стандарт для парамет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной статье описывается способ инкубации продлить жизнеспособность острой нервной ткани для работы с изображениями и электрофизиологических экспериментов, тем самым снижая число животных, необходимых для завершения экспериментальных целей. Два основных процесса определяют ухудшение состояния нервной ткани с течением времени: я) повышенные уровни бактерий, и сопровождающий увеличение бактериального эндотоксина выпущен, и II) экзитотоксичность , который следует за травматический процедуру нарезки 10....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Йосси Бускила и Пол Брин заявляют, что они являются совладельцами PAYO Scientific Pty Ltd, компании, специализирующейся на создании инкубационных систем для острой нервной ткани. Все остальные авторы не сообщают об отсутствии финансовых интересов или потенциальных конфликтов интересов, связанных с текущим исследованием.

Благодарности

Благодарим Колина Саймонса и Джеймса Райта за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом начального финансирования (WSU) для Y.B. и инновационного офиса Университета Западного Сиднея. M.C. поддерживается стипендией ARC (DECRA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigma Aldrich VETECV800372
хлорид калияSigma AldrichP9333
N-метил-D-глюкаминSigma AldrichM2004 
D-глюкозаSigma AldrichG5767
Бикарбонат натрияSigma AldrichS6014
Одноосновной фосфат натрияSigma AldrichS2554
Хлорид магнияSigma AldrichM9272 
Хлорид кальция Sigma Aldrich223506
PapainWorthington 
Диметилсульфоксид безводныйSigma Aldrich276855
Pluronic F-127 Низкое поглощение ультрафиолетаLife technologiesP-686720% раствор в ДМСО 
Фура-2 АМ&nбсп;  Anaspec84017
Fluo-4 AM   Life TechnologiesF23917
Fluo-8 AMAbcamAb142773
Вибрационное лезвие микротом Leica BiosystemVT1200 Sоснащена функцией Leica с Vibrocheck™ Измерительное устройство 
Антивибрационный столKinetic Systems Vibraplane Виброплан 9100/9200 
Вертикальный микроскоп с неподвижным столикомOlympusBX51WI 
Объектив микроскопаOlympusXLUMPlanFLN 20x/1.00w20X 
Объектив для микроскопаOlympusLUMPlanFLN 60x/1.00w60X
CCD камераAndorIxon +
Высокоскоростной переключатель длины волныИнструмент SutterLambda DG-4 
Патч Clamp усилительMolecular DevicesMultiClamp 700B
Система сбора данныхMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® Система
капилляров из боросиликатного стеклаSutter Instrument CoBF150-86-10
Съемник микроэлектродовSutter Instrument CoP-97Съемник микропипеток типа Флейминг/Браун
тип Записывающая/перфузионная камераWarner InstrumentsRC-40LPНизкопрофильные открытые ванны
Программное обеспечениеМолекулярные устройстваpClamp 10.2
Andor iQ Программное обеспечение для визуализации живых клетокAndor AndoriQ3
BraincubatorPayo ScientificBR26021976www.braincubator.com.au
Термоэлектрический охладитель холодной пластины ПельтьеTE TechnologyCP-121
Регулятор температурыTE TechnologyTC-36-25 RS232
Система диссоциации LK003150*

Ссылки

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396(2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588(2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
  8. Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
  13. Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Braincubator
Длительная инкубация Острый нейронную ткань для электрофизиологии и кальций-изображений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.