Методическая статья

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

1 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В сочетании предшественника изотопная маркировка и изобарической мечения (cPILOT) является количественной стратегией протеомики, что увеличивает возможности выборки мультиплексирования изобарических тегов. Этот протокол описывает применение cPILOT тканей от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймера.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует растущий спрос проанализировать многие биологические образцы для понимания болезни и обнаружения биомаркеров. Количественные стратегии протеомики, которые позволяют одновременное измерение нескольких образцов стало широко распространенным и значительно уменьшить экспериментальные затраты и время. В нашей лаборатории разработан метод, называемый комбинированным предшественником изотопная маркировкой и изобарической мечения (cPILOT), что повышает образец мультиплексирования традиционной маркировки изотопной или изобарических подходов мечения. Глобальный cPILOT может быть применен к образцам, происходящим из клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов и дает информацию о относительных содержаниях белка в различных условиях образца. cPILOT работает на 1) с использованием низких рН буферных условий для селективного dimethylate пептида N-концы и 2) с использованием высоких рН буфера условий для обозначения первичных аминов остатков лизина с коммерчески доступных реагентов изобарических (см Таблицу материалов / реагентов). СтепеньОбразец мультиплексирование доступно зависят от количества меток, используемых предшественников и изобарического реагента мечения. Здесь мы представляем 12-Plex анализа с использованием легкой и тяжелой Диметилирование в сочетании с шестью Plex изобарических реагентов для анализа 12 образцов из тканей мышей в одном анализе. Enhanced мультиплексирование полезно для снижения экспериментального времени и затрат, и что более важно, что позволяет проводить сравнения между многими условиями выборок (биологическими повторностями, стадией заболевания, медикаментозным лечением, генотипами или продольными временными точками) с менее экспериментальным уклоном и ошибками. В этой работе, глобальный cPILOT подход используются для анализа мозга, сердца и ткани печени через биологические повторы от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймер. Глобальный cPILOT может быть применен для изучения других биологических процессов, и выполненного с возможностью увеличения мультиплексирования образца до более чем 20 образцов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомика часто включает в себя анализ многих образцов, используемых для лучшего понимания болезненных процессов, кинетики ферментов, посттрансляционные модификации, реакция на стимулы окружающей среды, реакцию на терапевтические процедуры, обнаружение биомаркер или механизмы наркотиков. Количественные методы могут быть использованы для измерения относительных различий в уровне белка через образцы и может быть этикетками, свободными или включают изотопную метку (метаболический, химический или ферментативный). Устойчивые методы изотопного мечения выросли в популярности, поскольку они позволяют многие образцы, которые будут проанализированы одновременно и пригодны для образцов из различных клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов. Изотоп маркировка метода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 увеличение пропускной способности , экспериментальнаяпри одновременном сокращении времени приобретения, стоимости и погрешности эксперимента. Эти методы используют спектры масс-предшественник для измерения относительного содержания белков из пептидных пиков. В противоположность этому , меченые реагенты изобарических 8, 9, 10 генерируют репортерные ионы, которые либо обнаружены в MS / MS или MS 3 11 спектры и эти пики используются , чтобы сообщить об относительном содержании белков.

Текущее состояние-оф-арт в мультиплексировании протеомики является либо 10-Plex 12 или 12-Plex изобарно анализа тега 13. Улучшенное мультиплексирование образца (т.е.> 10 образцов) было разработаны методы нашей лаборатории для тканей 14, 15, 16, 17, а также других для анализа клеток 18 SUP>, 19, 20, 21, тканей или целевых пептидов 22. Мы разработали усовершенствованный метод мультиплексирования, называемый в сочетании предшественника изотопное мечение с изобарической мечения (cPILOT). Глобальный cPILOT полезно для получения информации об относительных концентрациях всех белков в различных условиях выборки (≥12) 14. На рисунке 1 показан общий технологический процесс cPILOT. Триптические или Lys-C пептиды селективно помечены на N-конце с использованием Диметилирование низкого рН 2 и в остатках лизина с 6-Plex реагентов с использованием высокого рН. Эта стратегия удваивает число выборок, которые могут быть проанализированы с изобарическими реагентами, которые помогают снизить затраты и экспериментальные кроме того, уменьшает экспериментальные шаги и время.

cPILOT гибок, как мы разработали другие методы для изучения окислительных посттрансляционных модусов, в том числе - модификации 3-нитротирозин-модифицированных белков 14 и цистеина , содержащих пептиды с S-нитрозилирования (oxcyscPILOT) 23. Мы также разработали аминокислоту селективный подход, цистеин cPILOT (cyscPILOT) 17. МС 3 с приобретением топ-иона 11 или селективного-у 1 -ионный метода 15 может помочь уменьшить репортер ионной интерференции и улучшить количественную точность cPILOT. Использование MS 3 в методе сбора требует высокого разрешения прибора с Orbitrap масс - анализатора , хотя низкое разрешение ионной ловушки инструменты могут также работать 24.

Ранее cPILOT был использован для изучения белков печени 16 из мышиной модели болезни Альцгеймера. Здесь мы опишем, как выполнить глобальный анализ cPILOT с помощью мозга, сердца и гомогенатах печени изучить роль peripheчень при болезни Альцгеймера. Этот эксперимент включает в себя биологическую репликацию. Из-за универсальности cPILOT, заинтересованные пользователи могут использовать технику для изучения других тканей для ряда биологических проблем и систем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этика заявление: Мыши были приобретены у независимой, некоммерческой биомедицинского исследовательского института и размещены в Отделе лабораторных животных ресурсов в Университете Питтсбурга. Все протоколы животных были утверждены уход и использование комитетом Институциональных животных путем в Университете Питтсбурга.

1. Белки Добыча и генерация пептидов для химико-мечения

  1. Извлечение белка из ткани, клеток или телесных жидкостей.
    1. Однородный 60-90 мг ткани (например , мозга, сердца и печени) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS 1x) 8 М мочевины (500 мкл) с использованием механического гомогенизатора. Протеаз или ингибиторы фосфатазы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. В этом проекте, они не были использованы. Используйте следующие параметры для гомогенизатора: лизировать бусинки матрицы, 4 м / с, 20 с. Сердце ткани может потребоваться до 9 циклов гомогенизации.
      Примечание: протеаз или ингибитор фосфатазы ы могут быть добавлены в буфер, если это необходимо. Они не были использованы в данном исследовании.
      1. Удалить гомогената ткань из лизирующей трубки и передач в микро-центрифужной пробирку. Промыть лизис трубки с 100-500 мкл PBS с 8 М мочевины, и объединить промывочный раствор с гомогената тканью.
    2. Центрифуга гомогенизированных тканей (9447 мкг, 4 ° С, 15 мин) и собирают супернатант.
  2. Определить концентрацию белка с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА) анализа в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Дальнейшее разбавление буфера может быть необходимо, если концентрация белка слишком высока. Полученные концентрации для образцов из этих тканей были между 6-13 мкг / мкл.
    1. Дополнительно: Добавить стандарт внутреннего контроля качества (например , крупный рогатый скот альфа - казеин или другой экзогенный белок) со стандартом мкг в соотношении 1: 100 мкг образец белка.
jove_title "> 2. Пример Переваривание

  1. Добавьте 100 мкг (100 × 10 -6 г) белка из каждого образца индивидуально помечены микро-центрифужные пробирки. Объем зависит от концентрации белка (см шаг 1.2).
  2. Добавить дитиотреитолу (DTT) (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч. Расчет для молярного соотношения базируются белковой масса бычьего сывороточного альбумина (BSA), который составляет 66,5 · 10 3 г / моль.
  3. Добавить иодацетамид (IAM) (80: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Выдержите на льду в темноте в течение 2 ч. Эту реакцию проводили на льду в течение 2 ч, чтобы избежать побочных реакций.
  4. Добавить L-цистеин (40: 1 реагент к образцу мол соотношения) к каждому образцу. Инкубирую при комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Добавьте 20 мМ трис - буфера с 10 мМ CaCl 2 (рН 8,2) для разбавления мочевины до конечной концентрации 2 М.
  6. Добавить Л-1-tosylamido-2 фенилэтила хлорметилкетона (ТРСК) -обработанной трипсин (50: 1 субстрат фермента мол соотношение) к каждому образцу и инкубировать при 37 ° С в течение 24 ч.
  7. Гасят переваривания белков путем флэш-замораживание образца в жидком азоте и хранят при -80 ° С до дальнейшей обработки.

3. Образец обессоливания

  1. Повторно подкислить образцы добавления муравьиной кислоты (FA). Добавьте достаточно FA для получения конечной концентрации 0,1%. Если образцы первоначально при температуре -80 ° С, оттаивают на льду образцы перед повторным подкисления.
  2. Де-солевой пептиды с использованием С 18 гидрофильно - липофильный сбалансированный (HLB) 10 мг картриджей , как описано выше 16.
  3. Сухие образцы от вакуумного центрифугирования (5 мм рт.ст., 45 & deg; С, 77 мкг) до объема ~ 10 мкл.

4. Диметилирование Этикетировочное (N-концы)

  1. Развести пептиды в 1% -ной уксусной кислоте (0,25 мкг / мкл), растворенные в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или нано-чистой воды класса. Удаление 50 мкм; Г порцию на новую микро-центрифужную пробирку (1,5 мл) и хранить остаток при -80 ° С.
  2. Добавить 8 мкл 60 мМ (4%) CH 2 O (37% вес / объем) или 60 мМ (4%) 13 CD - 2 О (20% вес / об) к образцам для маркировки с легкой или тяжелой диметилирование, соответственно , , Как правило, 4 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов (шаги 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Добавить 8 мкл 24 мМ NaBH 3 CN или 24 мМ NaBD 3 CN к образцам , меченных легкой или тяжелой диметилирование, соответственно.
  4. Вихревые и встряхивают на шейкере пробирки в течение ~ 10 мин при комнатной температуре.
  5. Гасят реакции путем добавления 16 мкл 1% аммиака (~ 28-30% об / об) в течение 5 мин. Как правило, 8 мкл реагента добавляют на 25 мкг пептидов.
  6. Повторно подкислить реакционных смесей путем добавления 8 мкл 5% FA (98% об / об).
  7. Смешайте легкие и тяжелые диметилированные пептиды (Рисунок 1) , чтобы генерировать в общей сложности шести образцов. Смотрите таблицу 1 для описания образца мечения и объединения, используемого для данного исследования.
  8. Выполните образец обессоливания в соответствии с шагами 3.2 и 3.3.

5. Изобарная Пометка (остатки Lys)

  1. Развести 100 мкг диметилированный пептидов (1 мкг / мкл) в 100 мМ три-этил бикарбоната аммония (TEAB) буфера (рН ~ 8,5).
  2. Подготовка изобарные реагентов , как указано в протоколе изготовителя (см Таблицу материалов / реагентов).
  3. Добавить растворенные изобарических реагенты (41 мкл) в пептидов и вихря в течение ~ 10 с. Взболтать образцы на шейкере трубки микро-центрифуге в течение ~ 1 ч. Гасят реакции с гидроксиламином 8 мкл (10% вес / объем) и инкубируют образцы в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Бассейн шесть меченых проб в одну смесь и обессоливания (шаги 3.1-3.3) или хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.
    Примечание: Для улучшения покрытия протеома и глубины, стратегия многомерное разделения предлагаютсятакие как сильный катионит (SCX).

6. Сильный катионит

  1. Выполните SCX в соответствии с протоколом производителя (см Материалы таблицу).
    1. Подготовьте ~ 1 мл формиата аммония растворов (20 мМ, 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ, и 500 мМ) с 10% ацетонитрила (ACN), 0,1% FA (рН 3).
    2. Удалите красную крышку с верхней частью наконечника пипетки и нажмите наконечник пипетки с упаковкой суспензии, чтобы гарантировать, что упаковочный материал в нижней части наконечника пипетки.
      Примечание: Критический: Не выбрасывайте кончик пипетки до конца протокола.
    3. Поместите адаптер центрифуг на верхней части микро-центрифужную пробирку (2 мл) и закрепить наконечник пипетки внутри.
    4. Добавить 150 мкл SCX восстанавливающего буфера для пипеток.
    5. Центрифуга пипеток в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG). Повторите этот шаг еще два раза и выбросить отходы.
    6. Растворите рeptides в 150 мкл буфера SCX восстанавливающей. Убедитесь, что значение рН равно 3.
    7. Добавить пептиды в пипетки, центрифуга (см 6.1.5), и держать элюент.
    8. Перенести фильтр и пипетку на новую микро-центрифужную пробирку (2 мл) и добавляют 150 мкл 20 мМ раствора формиата аммония. Центрифуга в течение 6 мин при комнатной температуре (4000 XG) и держать элюент.
    9. Повторите шаг 6.1.8 дополнительные семь раз, с использованием последовательных концентраций (т.е. 40 мМ, 60 мМ, 80 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 250 мМ и 500 мМ) формиата аммония.
  2. Передача восемь SCX фракций в микро-центрифужные пробирки (1,5 мл) и концентрируют их с помощью центробежного испарения (см шаг 3.3).

7. жидкостная хроматография-тандемной масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) и МС 3

  1. Развести пептидов в масс-спектрометрического сорта воды с 0,1% FA, фильтруют и помещают в ампулу автоматического пробоотборника. Фильтр пептиды как ФолляРМО:
    1. Добавить восстановленные пептиды в микро-центрифужную пробирку , содержащую фильтр 0,65 мкм (см Материалы таблицу).
    2. Центрифуга пептиды при 12000 мкг в течение 1 мин. Удалить фильтр, удалите и добавьте отфильтрованные пептиды в ампулу автоматического пробоотборника.
  2. Подготовьте буфера подвижной фазы следующим образом: 3% (об / об) ACN с 0,1% FA (A) и 100% ACN с 0,1% FA (B).
  3. Вводят 6 мкл каждой фракции SCX образца на колонку , заполненную ловушку до 2 см с С 18 материала (5 мкм, 200 размер пор).
    Примечание: очистка образца на ловушку выглядит следующим образом: 3 мин, 0% В; 3 мкл / мин с использованием 2D - системы жидкостной хроматографии (см Материалы таблицу).
  4. Выполнить метод аналитического разделения. Используйте 75 мкм ID х 13,2 см лазерного наконечника растянутой плавленого кварца капиллярную колонку , заполненную С 18 материал (5 мкм, 100 А). Градиент: 0-5 мин, 10% В; 5-40 мин, 10-15% В; 40-90 мин, 15-25% В; 90-115 мин, 25-30% В; 115-130 мин, 30-60% В; 130-135 мин, 60-80% В; 135-145 мин, 80% В, 145-150 мин, 80-10% В; 150-180 мин, 10% В; 300 нл / мин, 180 мин.
  5. Запуск сбора данных для масс-спектрометра в то время как метод аналитического разделения работает.
    Примечание: Параметры для обследования сканирования MS заключаются в следующем: 400-1,600 м / г, разрешение 60000, автоматическую регулировку усиления (АРУ) цель 1 × 10 6 ионы, максимальное время впрыска 500 мс. Параметры для ИДС-MS / MS заключаются в следующем: Лучшие 1-7 или 8-14 Топ данных зависит приобретение (ДВР), 3 м / з ширины изоляции, 500 минимальный сигнал, 35% энергии нормализуется столкновений (НКЭ), 0,25 кв активации , 10 мс время активации, 3 × 10 4 АРУ, 50 мс максимальное время впрыска. Параметры для HCD-MS 3 следующим образом : 200 минимальный сигнал, м / г ширина 4 изоляция, 60% NCE, время активации 0,1, 3 × 10 5 АРУ, 250 мс IT, 300-1,300 м / з диапазон выбора МС / МС , исключить не-фрагментарный родительский ион.
    6. Выполнить каждый анализ в двух экземплярах как для верхней 1-7 и верхней 8-14 пробегов.
    Примечание: Для получения образцов работать на более новую модель документа , содержащего Orbitrap или tribrid масс - спектрометр, параметры DDA будет изменяться и могут быть оптимизированы , чтобы включать больше MS / MS и MS 3 сканирования. Кроме того, для tribrid инструментов, выбор синхронного предшественника (СПС) 3 - МС должны быть использованы.

8. Анализ данных 16

  1. Поиск файлов RAW с помощью программного обеспечения для анализа белка с соответствующей базой данных, таких как мыши UniProt.
    Примечание: Важно, чтобы создать два рабочие процесс для каждого файла RAW, чтобы искать для легких и тяжелых диметилированных пептидов.
  2. Поиск файлов RAW, используя следующие параметры: трипсином с двумя пропущенных расщеплений, диапазон масс пептида 300-6,000 Da, 15 частей на миллион масс материнской толерантности, 1 Da толерантности фрагментации. Статические модификации: светло-диметилирование (28,031, пептид, N-конец) или чтяжела ое диметилирование (36,076 Да, пептид, N-конец), carbamidomethyl (57,021 Да, С).
    Примечание: Иногда тяжелый диметилированный пик ~-Да (35,069 Да, пептид, N-конец) составляет от света диметилированного пика, и, таким образом, должны быть включено в рабочий процесс поиска для тяжелых диметилированных пептидов. Динамические модификации: окисление (15,995 Da, М), 6-Plex изобарно тег (229,163 Да, К). Включите манок поиск в базе данных с получением ложных скорости обнаружения (например , 1 и 5%) и узел для поиска количественного для ионных интенсивностей репортер изобарических тегов.
  3. Статистика
    1. Экспорт данных в электронную программу электронных таблиц для того, чтобы нормализовать значения ионных белка репортер. Для каждого белка, либо разделить медианные соотношения ионов репортера или интенсивности ионов сырья репортера медианного отношением внутреннего стандарта или сырых интенсивности ионов репортера внутреннего стандарта, соответственно. Используйте соответствующее статистическое программное обеспечение, такие как программы электронной таблицы, PersEUS, или R, чтобы определить существенные изменения среди образцов условий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT использует химию на основе амина химически пептиды ярлыка на N-конце и остатках лизина и улучшает возможности выборки мультиплексирования. Рисунок 2 показывает репрезентативных данных MS , который получают из 12-Plex анализа cPILOT головного мозга, сердца, печени и тканей от модели мыши болезни и дикого типа управляет болезнью Альцгеймера. Как показано в таблице 1, два биологических повторностях для болезни и дикого типа мышей , страдающих болезнь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT позволяет одновременное измерение более чем 12 уникальных образцов. Для того, чтобы обеспечить успешное мечение как на N-концевых остатки лизина и пептиды, крайне важно, чтобы иметь правильный рН для каждого набора реакций и проводить реакцию Диметилирования сначала для пептиднога маркировки. Селективное диметилирование на N-конце осуществляют имеющий рН ~ 2,5 (± 0,2). Это достигается за счет использования разности рКа-х годах аминогрупп на лизина и N-конца. При рН 2,5, лизин является неактивным (рКа ~ 10.5); Одн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, Университет Питтсбурга запуска средства и NIH, грант NIGMS R01 (GM 117191-01) в RASR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вода - MS GradeFisher ScientificW6-44 л количество не требуется
Ацетонитрил - MS GradeFisher ScientificA955-44 л количество не требуется
Уксусная кислотаJ.T. Baker9508-01
раствор гидроксида аммония (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Формиат аммонияAcros Organics208-753-9
Муравьиная кислотаFluka Analytical94318-250ML-F
BCA набор для анализа белкаPierce Thermo Fisher Scientific23227
МочевинаBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Дитиотреиотол (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Йодоацетамид (IAM)Acros Organics144-48-9
L-цистеинSigma Aldrich, Химия168149-25G
L-1-tosylamido-2 фенилэтилхолорметилкетон (TPCK) обработанный трипсин из бычьей поджелудочной железыSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
раствор формальдегида (CH2O); 36,5 - 38% в H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Формальдегид (13CD2O) раствор; 20 мас.% в D2O, 98 атомов % D, 99 атомов % 13CSigma Aldrich, Химия596388-1G
Цианоборогидрид натрия; реагент марки, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Цианобородоидид натрия; 96 атом % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Набор для подготовки образцов спиновых наконечников с сильным катионным обменом (SCX)Protea BioSciencesSP-155-24kit
Буфер бикарбоната триэтиламмония (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Изобарический набор для мечения (TMT 6 plex) - 6 реакций (1 x 0,8 мг)Thermo Fisher Scientific90061
Гидроксиламина гидрохлоридSigma Aldrich, Химия255580-100G
Стандартный вихревой миксерFisher Scientific2215365любой миксер можно использовать
Oasis HLB 1 cc (10 мг) экстракционные картриджиWaters186000383Это C18 картриджи
Visiprep SPE вакуумный коллектор, DL (одноразовый вкладыш), 24 порта модельSigma Aldrich57265Также достаточно модели с 12 портами
Speed-vacThermo ScientificSPD1010любой марки скоростного пылесоса Водяная
баня ThermoScientific2825/2826Достаточно любой марки водяной бани с контролируемой температурой.
Механический гомогенизатор (т.е. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D с автосамплером Nano LC AS-2Sciex-Этамодель больше не выпускается. Достаточно любого nano LC с автосамплером.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermo Scientific-Эта модель больше не доступна. Можно использовать другие инструменты с высоким разрешением (например Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion или Orbitrap Fusion Lumos).
Программное обеспечение для белков (e. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Аналитические весыMettler ToledoAL54
Пластина для перемешиванияVWR12365-382Любая марка пластин для перемешивания достаточна
pH-метр (совместимый с Tris)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Любая марка pH-метра достаточен
pH 10 буфер pH 10Fisher Scientific06-664-261Любая марка pH-буфера 10 достаточен
pH 7 буферFisher Scientific06-664-260Любая марка pH буфер 7 достаток
1,5 мл eppendorf tubes, 500 штFisher Scientific05-408-129Любая марка eppendorf tubes объемом 1,5 мл Eppendorf tubes достаточно
0,6 мл eppendorf tubes, 500 штFisher Scientific04-408-120Любая марка eppendorf tubes 0,65
&микро; m Ultrafree MC DV центробежные фильтрующие установкиEMDMillipore UFC30DV00
микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, 72 единицыThermo Scientific69720
C18 упаковочный материал (5  &микро; м, 100 & Аринг;)BrukerPM5/61100/000Этот предмет больше не доступен у Bruker. Альтернативный упаковочный материал с указанными характеристиками будет достаточным
18 упаковочного материала (5  &микро; м, 200 Å)BrukerPM5/61200/000Этот предмет больше не доступен у Bruker. Будет достаточно альтернативного упаковочного материала с указанными характеристиками
. . C

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Dimethylation LabelingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Похожие статьи