Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

Christina D. King; Joseph D. Dudenhoeffer; Liqing Gu; Adam R. Evans; Renã A. S. Robinson

doi:10.3791/55406

Method Article

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

Christina D. King¹ , Joseph D. Dudenhoeffer¹ , Liqing Gu² , Adam R. Evans³ , Renã A. S. Robinson¹

¹Department of Chemistry, University of Pittsburgh, ²SGS North America Inc., ³Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В сочетании предшественника изотопная маркировка и изобарической мечения (cPILOT) является количественной стратегией протеомики, что увеличивает возможности выборки мультиплексирования изобарических тегов. Этот протокол описывает применение cPILOT тканей от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймера.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует растущий спрос проанализировать многие биологические образцы для понимания болезни и обнаружения биомаркеров. Количественные стратегии протеомики, которые позволяют одновременное измерение нескольких образцов стало широко распространенным и значительно уменьшить экспериментальные затраты и время. В нашей лаборатории разработан метод, называемый комбинированным предшественником изотопная маркировкой и изобарической мечения (cPILOT), что повышает образец мультиплексирования традиционной маркировки изотопной или изобарических подходов мечения. Глобальный cPILOT может быть применен к образцам, происходящим из клеток, тканей, телесных жидкостей, или целых организмов и дает информацию о относительных содержаниях белка в различных условиях образца. cPILOT работает на 1) с использованием низких рН буферных условий для селективного dimethylate пептида N-концы и 2) с использованием высоких рН буфера условий для обозначения первичных аминов остатков лизина с коммерчески доступных реагентов изобарических (см Таблицу материалов / реагентов). СтепеньОбразец мультиплексирование доступно зависят от количества меток, используемых предшественников и изобарического реагента мечения. Здесь мы представляем 12-Plex анализа с использованием легкой и тяжелой Диметилирование в сочетании с шестью Plex изобарических реагентов для анализа 12 образцов из тканей мышей в одном анализе. Enhanced мультиплексирование полезно для снижения экспериментального времени и затрат, и что более важно, что позволяет проводить сравнения между многими условиями выборок (биологическими повторностями, стадией заболевания, медикаментозным лечением, генотипами или продольными временными точками) с менее экспериментальным уклоном и ошибками. В этой работе, глобальный cPILOT подход используются для анализа мозга, сердца и ткани печени через биологические повторы от модели мыши болезни и дикого типа управления Альцгеймер. Глобальный cPILOT может быть применен для изучения других биологических процессов, и выполненного с возможностью увеличения мультиплексирования образца до более чем 20 образцов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомика часто включает в себя анализ многих образцов, используемых для лучшего понимания болезненных процессов, кинетики ферментов, посттрансляционные модификации, реакция на стимулы окружающей среды, реакцию на терапевтические процедуры, обнаружение биомаркер или механизмы наркотиков. Количественные методы могут быть использованы для измерения относительных различий в уровне белка через образцы и может быть этикетками, свободными или включают изотопную метку (метаболический, химический или ферментативный). Устойчивые методы изотопного мечения выросли в популярности, поскольку они позволяют многие образцы, которые будут проанализированы одновременно и пригодны для....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этика заявление: Мыши были приобретены у независимой, некоммерческой биомедицинского исследовательского института и размещены в Отделе лабораторных животных ресурсов в Университете Питтсбурга. Все протоколы животных были утверждены уход и использование комитетом Институциональных животных путем в Университете Питтсбурга.

1. Белки Добыча и генерация пептидов для химико-мечения

Извлечение белка из ткани, клеток или телесных жидкостей.
1. Однородный 60-90 мг ткани (например , мозга, сердца и печени) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS 1x) 8 М мочевины (500 мкл) с использованием механического ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT использует химию на основе амина химически пептиды ярлыка на N-конце и остатках лизина и улучшает возможности выборки мультиплексирования. Рисунок 2 показывает репрезентативных данных MS , который получают из 12-Plex анализа cPILOT головного мозга, сердца, печени и тканей от модели мыши болезни и дикого типа управляет болезнью Альцгеймера. Как показано в таблице 1, два биологических повторностях для болезни и дикого типа мышей , страдающих болезнь.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT позволяет одновременное измерение более чем 12 уникальных образцов. Для того, чтобы обеспечить успешное мечение как на N-концевых остатки лизина и пептиды, крайне важно, чтобы иметь правильный рН для каждого набора реакций и проводить реакцию Диметилирования сначала для пептиднога маркировки. Селективное диметилирование на N-конце осуществляют имеющий рН ~ 2,5 (± 0,2). Это достигается за счет использования разности рКа-х годах аминогрупп на лизина и N-конца. При рН 2,5, лизин является неактивным (рКа ~ 10.5); Одн.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующие интересы.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, Университет Питтсбурга запуска средства и NIH, грант NIGMS R01 (GM 117191-01) в RASR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Вода - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 л количество не требуется
Ацетонитрил - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 л количество не требуется
Уксусная кислота	J.T. Baker	9508-01
раствор гидроксида аммония (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Формиат аммония	Acros Organics	208-753-9
Муравьиная кислота	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA набор для анализа белка	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Мочевина	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Дитиотреиотол (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Йодоацетамид (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-цистеин	Sigma Aldrich, Химия	168149-25G
L-1-tosylamido-2 фенилэтилхолорметилкетон (TPCK) обработанный трипсин из бычьей поджелудочной железы	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
раствор формальдегида (CH₂O); 36,5 - 38% в H₂O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Формальдегид (¹³CD₂O) раствор; 20 мас.% в D₂O, 98 атомов % D, 99 атомов % ¹³C	Sigma Aldrich, Химия	596388-1G
Цианоборогидрид натрия; реагент марки, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Цианобородоидид натрия; 96 атом % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Набор для подготовки образцов спиновых наконечников с сильным катионным обменом (SCX)	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Буфер бикарбоната триэтиламмония (TEAB)	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Изобарический набор для мечения (TMT 6 plex) - 6 реакций (1 x 0,8 мг)	Thermo Fisher Scientific	90061
Гидроксиламина гидрохлорид	Sigma Aldrich, Химия	255580-100G
Стандартный вихревой миксер	Fisher Scientific	2215365	любой миксер можно использовать
Oasis HLB 1 cc (10 мг) экстракционные картриджи	Waters	186000383	Это C₁₈ картриджи
Visiprep SPE вакуумный коллектор, DL (одноразовый вкладыш), 24 порта модель	Sigma Aldrich	57265	Также достаточно модели с 12 портами
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	любой марки скоростного пылесоса Водяная
баня Thermo	Scientific	2825/2826	Достаточно любой марки водяной бани с контролируемой температурой.
Механический гомогенизатор (т.е. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D с автосамплером Nano LC AS-2	Sciex-Эта		модель больше не выпускается. Достаточно любого nano LC с автосамплером.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	Эта модель больше не доступна. Можно использовать другие инструменты с высоким разрешением (например Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion или Orbitrap Fusion Lumos).
Программное обеспечение для белков (e. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Аналитические весы	Mettler Toledo	AL54
Пластина для перемешивания	VWR	12365-382	Любая марка пластин для перемешивания достаточна
pH-метр (совместимый с Tris)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Любая марка pH-метра достаточен
pH 10 буфер pH 10	Fisher Scientific	06-664-261	Любая марка pH-буфера 10 достаточен
pH 7 буфер	Fisher Scientific	06-664-260	Любая марка pH буфер 7 достаток
1,5 мл eppendorf tubes, 500 шт	Fisher Scientific	05-408-129	Любая марка eppendorf tubes объемом 1,5 мл Eppendorf tubes достаточно
0,6 мл eppendorf tubes, 500 шт	Fisher Scientific	04-408-120	Любая марка eppendorf tubes 0,65
&микро; m Ultrafree MC DV центробежные фильтрующие установки	EMD	Millipore UFC30DV00
микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, 72 единицы	Thermo Scientific	69720
C₁₈ упаковочный материал (5 &микро; м, 100 & Аринг;)	Bruker	PM5/61100/000	Этот предмет больше не доступен у Bruker. Альтернативный упаковочный материал с указанными характеристиками будет достаточным
₁₈ упаковочного материала (5 &микро; м, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	Этот предмет больше не доступен у Bruker. Будет достаточно альтернативного упаковочного материала с указанными характеристиками

. . C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles