Здесь мы приводим протокол для выполнения полупроницаемую с высокой пропускной способностью анализа миграции клеток на 96-луночный культуральный планшет. Этот протокол является быстрый, простой и экономичный способ создать логичную скретч раны на клетку монослоя.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Устройства для осуществления миграции клеток / заживлении ран в 96-луночный планшет
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Миграции клеток / ранив анализа является широко используемым методом для изучения миграции клеток и другие биологические процессы, такие как ангиогенез и метастазирование опухоли. В этом анализе клетки выращивают с образованием сливающийся монослой и механический рана создается царапанием с устройством. Тогда скорость миграции клеток по отношению к обнаженную область можно контролировать с помощью визуализации. Наш 8-канальный механический wounder предназначен для решения большинства проблем, связанных с миграцией клеток анализа. Во-первых, наша wounder можно легко стерилизовать автоклавированием или с общими дезинфицирующими средствами. Во-вторых, отдельные регулируемые штифты позволяют даже контактировать с клеточной культуральной пластины таким образом, что могут быть созданы острые и воспроизводимые раны. В-третьих, направляющие стержни с обеих сторон wounder обеспечить последовательную позицию ранив в каждую лунку. Использование одноразовых наконечников пластиковой пипетки для ранении может дополнительно обеспечивать лучшее обработку wounder, а также свести к минимуму перекрестные contaminatиона. В заключение, наша ячейка wounder может предоставить исследователям с удобным и воспроизводимым устройством для проведения анализа миграции клеток с использованием стандартного 96-луночного культурального пластину.
Введение
Миграция клеток играет важную роль в клеточных процессах, таких как эмбриогенез, нейрогенез, ангиогенез, заживление ран, слизистых оболочек, эпителиальные ремонт-мезенхимальных-переходов при нормальном развитии и ситуации заболевания 1. Это сложный процесс , который включает в себя координацию многочисленных меж- и внутриклеточных событий , в том числе сигнальных взаимодействий молекул, поляризация клеток, цитоскелета реорганизации, матрицы ремоделирования, мембранного выпячивания и динамическая межклеточной адгезии модуляции 2. Путем изучения миграции клеток, обнаружение и проверка химических веществ или биологических молекул, приводящих к движению клеток и связанных с ней биохимических путей может быть определена. Этот фундаментальный процесс может быть использован с выгодой в качестве прокси-сервера для различных приложений, таких как лечение заболеваний и наркомании таргетинга.
Ранив анализ является одним из клеточной миграции анализов 3. Здесь Anиндивидуальный образец клеток будут частично удалены с помощью механических средств, чтобы произвести обнаженную область, где клетки будут мигрировать, чтобы покрыть область. Процент восстановления в определенный момент времени будет контролироваться. При обработке большого количества образцов, такие вопросы, как экспериментальной стоимости и перекрестного загрязнения в образцах может быть проблематичным. Хотя многие коммерческие инструменты и анализы доступны для изучения миграции клеток 4, 5, 6, многие из них требовали дорогих и сложное оборудование , и все еще необходимы улучшения. По этим причинам, 8-канальный механический ячейки wounder (рисунок 1) разрабатывается.
Наш 8-канальный механический ячейка wounder включила несколько уникальных особенностей в решении вышеуказанных проблем. Это обеспечивает гибкость для выполнения миграции клеток / ранив анализов в формате культуры 96-луночного планшета. Регулируемое гуiding дизайн бар гарантирует, что площадь повреждения находится в центральном положении каждой лунки. Кроме того, высота направляющих стержней может быть отрегулирована таким образом, чтобы wounder применима для различных марок культуральных планшетов. И, наконец, регулируемая конструкция позволяет ранении контактный ровный контакт кончиках пипеток с поверхностью пластины культуры для достижения одновременного и воспроизводимую ранению 7, 8.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Введение в Части Wounder (Рисунок 1)
- Подготовьте держатель штифта путем фиксации ранении штифты на равных расстояниях. Держите кончики пипеток и отрегулируйте высоту наконечника путем перемещения регулируемых ранив штифты вверх и вниз.
- Установить регулируемый ориентируемся планку на различных марок 96-луночные культуральные планшеты и убедитесь, что площадь ранении находится в фиксированном положении.
- Закрепите регулируемое ранив штифт, затянув болт с шестигранной головкой. Закрепите направляющую-бар в положении, затянув колпачки с шестигранной головкой гнездо на обоих концах.
2. Установка ширины держателя Pin (Рисунок 2)
- Ослабьте крышки головки шестигранником с шестигранным ключом M5.
- Вставьте подходящее количество регулировочных колец с обеих сторон держателя штыря таким образом, чтобы направляющие стержни идеально подходят с шириной культуры 96-луночного планшета.
Примечание: Corning и Иваки пластины требуется 1 пара больших колец и 1 пару маленьких колец. Сокол и Nunc плАтес нужно 1 пара больших колец. - Затянуть головку шестигранной крышки, чтобы зафиксировать направляющую планку.
3. Регулировка Руководящие Бары (Рисунок 3)
- Установить контакты с ранив стерильные 10 мкл пластиковыми наконечниками пипетки.
- Ослабьте крышки головки шестигранником с шестигранным ключом M5.
- Держите wounder и окунуть ранении булавки в одну колонку культуры пластины 96-луночного.
- Отрегулируйте высоту направляющих стержней, пока все советы едва касаться дна лунок.
- Затянуть крышки головки шестигранником. Убедитесь в том, что в настоящее время wounder идеально подходит на культуральном планшете и что контакты хорошо расположены в центре лунки.
4. Калибровка Pins
- Держите wounder перпендикулярно к плоской поверхности стерильной (т.е. чашки Петри) и ослабить все шестигранные винты с шестигранным ключом M3.
- Нажмите wounder пока все советы равномерно касаться плоской стерильной поверхности.
- Затянуть шестигранные винты снова, чтобы зафиксировать штифты в нужном положении.
- Проверьте ровность каждого наконечника, нажав на wounder аккуратно на плоской поверхности стерильной.
5. Царапины монослой клеток (рисунок 4)
- Семенной пупочные эндотелиальные клетки сосудов человека на 0,1% желатин покрытием 96-луночный культуральный планшет. Культура клеток в среде 199 с добавлением 20% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина и 0,09 г / л гепарина. Поддерживать клетки в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа при 37 ° С в течение ночи перед использованием. Клетки должны достигнуть 100% слитности, прежде чем ранив.
- Поместите кончики Wounding на крайнего левого (или крайней правой) стороне каждой лунки в той же самой колонке культурального планшета. Вставьте wounder на другую сторону скважины; убедитесь, что ранении советы касаются дна колодца.
- Повторите царапать (шаг 5.2) для всех столбцов.
- После того, как ранении, отбрасывать тон среда в каждую лунку, и заменяют свежей средой, содержащей соединения тестирования.
6. Сбор данных и анализ изображений
- Изображение в целом хорошо с механической раной на монослой клеток с использованием малой мощности микроскоп с цифровой камерой (например , объективной 10X) сразу после того, как ранении (Т = 0 ч).
- Добавить тестируемые соединения, если это необходимо, и инкубировать в течение желаемого промежутка времени. Изображение в целом хорошо с области раны снова после требуемого времени инкубации (т =) & delta; н.
- С помощью анализа изображений программное обеспечение как ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), измерьте раненую область на изображении с помощью инструмента Freehand.
- Вычислить процент закрытия раны:
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот 8-канальный механический wounder построен поцарапать монослой клеток для выполнения анализа миграции клеток. Это удобно устройство, которое может выполнять клеточные царапать анализы в 96-луночные планшеты в менее чем за минуту без специальной подготовки. Это wounder можно ввести области , намотанных на клеточных монослоев с равномерной шириной около 600 мкм и с острыми краями (5 и 6). Ширина раны зависит от марки пипеток и производительности пользо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наша ячейка wounder имеет несколько уникальных особенностей в решении проблем традиционной миграции клеток анализов. 8-канальный механический ячейки wounder изготовлен из высококачественной нержавеющей стали (сталь 304) с длительным сроком службы, который можно стерилизовать автоклавированием. Почти все коммерческие марки 96-луночные планшеты для культуры, доступных на рынке могут быть использованы с этой механической клетки wounder из-за регулируемым направляющим брусом. Конструкция регулируемого направляющим брусом та...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить г Tam Po Leung, г-н Вонг Чи Кин и технический состав факультета Workshop науки, Гонконг Baptist University, за свои технические навыки и консультации в создании прототип этого wounder.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-луночный планшет для клеточных культур | Nunc | 167008 | Другие бренды 96-луночных планшетов для клеточных культур также могут быть использованы |
| наконечники для пипеток P10 | Axygen | 301-03-051 | Короткий наконечник для пипетки P10 более прост для создания прозрачной раны |
| Wounder | R& P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | Для клеточной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Используйте соответствующую питательную среду и условия для других типов клеток. |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 26140079 | Для клеточной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Используйте соответствующую питательную среду и условия для других типов клеток. |
| Пенициллин/стрептомицин | Gibco | 15140122 | Для клеточной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Используйте соответствующую питательную среду и условия для других типов клеток. |
| Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи | Sigma | H3393 | Для клеточной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Используйте соответствующую питательную среду и условия для других типов клеток. |
| Желатин из кожи крупного рогатого скота | Sigma | G9391 | Для клеточной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Используйте соответствующую питательную среду и условия для других типов клеток. |
Ссылки
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
