Методическая статья

Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55417

⸱

24 марта 2017 г.

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

В этой статье

Краткое содержание

Здесь авторы представляют простой и эффективный протокол для определения линейного антигенного эпитопа с использованием очищенного моноклонального антитела и сканирования пептидов с помощью дот-блот-гибридизации. Идентифицированный эпитоп затем может быть использован в терапевтических и диагностических приложениях.

Аннотация

Идентификация антигенный эпитоп иммунной системой позволяет для понимания защитного механизма нейтрализующих антител, которые могут способствовать разработке вакцин и пептидных лекарственных средств. Сканирование Пептид представляет собой простой и эффективный метод, который отображает прямолинейно линейный эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом (МАБ). Здесь авторы представляют методологию определения эпитопов с участием последовательно укороченные рекомбинантных белков, синтетический пептид дизайн и дот-блот-гибридизацию для антигенного распознавания нервного вируса некроза белка оболочки, используя нейтрализующий мАт. Этот метод основан на дот-блот-гибридизации синтетических пептидов и моноклональных антител на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану. Минимальная антигенную область вирусного белка оболочки, признанной RG-М56 мАт может быть сужен на шаг за шагом отделан пептидный отображение на 6-мерный пептид эпитопа. Кроме того, аланин-сканирующий мутагенез и остаток субзаместительной может быть выполнена, чтобы характеризовать связывающую значимость каждого аминокислотного остатка, составляющих эпитоп. Были найдены остатки, фланкирующие сайт эпитоп играть решающую роль в регуляции пептидный конформации. Указанный эпитоп пептид может быть использован для образования кристаллов эпитипа пептидных-антитело для дифракции исследования рентгеновского и функциональной конкуренции, или для терапии.

Введение

В иммунной системе, рекомбинация сегментов V, D и J позволяет создавать антитела огромные вариации определяющие комплементарность области (CDR) , для связывания с различными антигенами , чтобы защитить хозяина от патогенных инфекций. Нейтрализатор защита антител против антигенов, зависит от пространственной комплементарности между CDRs антител и эпитопов антигенов. Таким образом, понимание этого молекулярного взаимодействия будет способствовать профилактический дизайн вакцин и терапевтический пептид наркотиков. Тем не менее, это взаимодействие нейтрализация может влиять как несколькими антигенные домены из одного антигена и множественными CDRs антител, которые, следовательно, делает процесс определения эпитопов более сложным. К счастью, развитие гибридомной технологии, которая плавит отдельные антитело-продуцирующих клеток с клетками миеломы, позволяет постоянно делящей партии клеток в сексплетение одно специфическое антитело, известное как моноклональное антитело (монАТ) 1. Клетки гибридомы производят эти чистые, высоким сродством мАт связываться с одного антигенного домена специфического антигена. При соотношении антиген-антитело, установленного несколько подходов, в том числе пептидов сканирования, могут быть использованы для определения эпитопа антигена с использованием его соответствующего мАт. Последние разработки в области синтетической пептидной технологии сделали метод пептидного сканирования более доступной и удобной для выполнения. Если коротко, то множество перекрывающихся синтетических пептидов, получают в соответствии с последовательностью антигена-мишени и связаны с твердой подложке мембраны для монАТ гибридизации. сканирование Пептид не только предлагает простой способ отображения антитела область связывания, но также облегчает аминокислоту (аа) мутагенеза с помощью сканирования остатка или замещения для оценки связывания взаимодействия между каждым аа остатком эпитопа пептида и CDR-антитела.

Здесь, в настоящем исследовании описывается протокол для эффективной идентификации линейного эпитопа белка оболочки желтый группер вирус нервной некроз (YGNNV) с использованием нейтрализующего мАт 2, 3, 4. Протокол включает MAB подготовку, конструкции и экспрессии серийно усеченных рекомбинантных белков, синтетический перекрывающийся дизайн пептид, дот-блот-гибридизацию, сканирование аланин, а также заместительную мутагенеза. Принимая во внимание высокую стоимость синтеза пептидов, стадия последовательно усечения рекомбинантных белков желаемого целевого белка был изменен, и антигенную область была сужена до приблизительно 100 до 200 аминокислотных остатков, прежде чем синтетический пептид массив анализ дот-блот был проведен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление моноклонального антитела

  1. Культура RG-M56 мышиные моноклональные гибридомные клетки 2 в среде без сыворотки в 175T колбах при температуре 37 ° С с 5% CO 2 дополнения. Собирают супернатант, когда цвет среды становится желтым после пяти дней инкубации.
    Примечание: гибридомы клетки культивировали в среде без сыворотки, чтобы избежать загрязнения антител из сыворотки плода коровы.
  2. Центрифуга супернатант при 4500 х г в течение 30 мин при 4 ° С и отбросить клеточных остатков гранул.
  3. Добавляют 2 мл белка G агарозы (поставляется в виде 50% -ной суспензии) в колонку с 5 мл и уравновешивают 10 объемами смолы (10 мл) охлажденного льдом PBS.
  4. Нагрузка 200 мл супернатанта антитела (шаг 1,2) на колонку и отбрасывать сквозную.
  5. Добавить 10 мл охлажденного льдом PBS в колонну, чтобы вымыть его. Повторите дважды.
  6. Добавляют 10 мл 50 мМ глицина, рН 2,7 в колонку для элюирования белка G-связанного антитела. седлоLect 900 мкл фракции в микроцентрифуге пробирку, содержащую 100 мкл 10-кратного буфера для нейтрализации (1 М Трис, 1,5 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0).
  7. Храните очищенного антитела в 50% глицерина с 0,03% NaN 3 при температуре -20 ° С .

2. Конструирование и экспрессия Серийно усеченных рекомбинантных белков

  1. Приготовьте Реакционная смесь для ПЦР: 5 мкл 10 - кратного Pfu буфера, 0,2 мМ каждого из дНТФ, 0,2 мкМ прямого праймера 3, 0,2 мкМ обратного праймера , 3, 2 мМ MgSO 4, 1 нг pET20b-1A59 3 плазмидной ДНК, и 2,5 ед ( блок) ПФУ ДНК - полимеразы; добавить DDH 2 O до конечного объема 50 мкл.
    1. Запуск образцов в автоматическом термоциклеру с использованием следующих параметров: Цикл 1 (94 ° С в течение 5 мин); циклы 2-36 (94 ° С в течение 30 с, 63 ° С в течение 30 с, и 72 ° С в течение 60 сек); и цикл 37 (72 ° С в течение 7 минут).
  2. Экстракт полимеразной цепной реакции (ПЦР) продуктов с использованием набора для очистки ПЦР - 5 , чтобы облегчить следующую расщепления ферментами рестрикции.
  3. Переваривать ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК с помощью ферментов рестрикции Nde I и Xho I и перевязывать каждый из этих фрагментов ДНК в Nde I и Xho I фермент расщепляется пет-20b (+) вектора. Transform конструкции , в кишечной палочки DH-5-альфа-компетентных клеток 6.
    1. Готовят Переваривание смеси в пищеварении буфере (20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ Mg (CH 3 COO) 2, 50 мМ KCH 3 СОО, и 1 мМ ДТТ, рН 7,9) с 1 мкг ПЦР-амплифицированной ДНК или полиэтилентерефталата-20B (+) , ДНК - вектор, и 2 ед Nde I и ограничение Xho I ферменты в конечном объеме 20 мкл.
    2. Смешайте переваривания смесь осторожно и быстро вращаться вниз. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч в бане сухой, чтобы обеспечить полное разрезание ограничение сидетьэс.
    3. Экстракт энзим-расщепленный ДНК - фрагментов рестрикции с использованием набора для очистки ПЦР - 5 , чтобы облегчить следующую конструкцию плазмиды.
    4. Готовят смесь лигирования в лигирующем буфере (66 мМ Трис, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ АТФ и 5 мМ ДТТ, рН 7,5) с 100 нг легкоусвояемым, ПЦР-амплификации ДНК, 10 нг предварительно переваренный пет-20b (+) ДНК-вектор, и 5 ед ДНК-лигазы Т4 в конечном объеме 10 мкл.
    5. Смешайте лигирования смесь осторожно и быстро вращаться вниз. Инкубируют при 16 ° С в течение 18 часов на водяной бане.
    6. Поместите 10 мкл образцов лигирования в 100 мкл DH-5α-компетентных клеток и осторожно перемешать до размещения микроцентрифужных трубки на льду в течение 30 мин. Поместите микроцентрифужных трубку в сухом бане при температуре 42 ° С в течение 90 секунд , чтобы вызвать теплового шока 7. Сразу передачи трубки на льду в течение 2 мин.
    7. Добавить 900 мкл Лурии-Бертани (LB) бульона (1% Васто триптона, 0,5% Васто дрожжи Extracт, и 0,5% NaCl, рН 7,0) к трубе. Инкубируют при 37 ° С при 150 оборотов в минуту встряхивания в течение 45 мин. Гранул клетки центрифугированием при 4000g в течение 10 мин и отбросить супернатант.
    8. Ресуспендируют осадок с 50 мкл LB бульона и распространить каждое преобразование на предварительно нагретый пластин LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 16 ч.
    9. Возьмите одну колонию с использованием наконечника 200 мкл и поместить его в 3 мл LB бульона, содержащего 100 мкг / мл ампициллина, в неполностью закрываютс крышкой 15 мл трубки. Инкубируют при 37 ° С при 150 оборотов в минуту встряхивания в течение 12 ч.
    10. Извлечение ДНК плазмиды 8 из каждой культуры и последовательность его , используя Т7 промотор и терминатор Т7 праймеров для подтверждения последовательности 9.
  4. После подтверждения последовательности, преобразование 10 нг ДНК из этих пет-20b (+) плазмиды с различной длины гена белка оболочки YGNNV в штамм BL-21 (DE3) кишечной палочки намиИНГ метод теплового шока 7. Выполните шаги 2.3.6-2.3.8 для выполнения преобразования.
  5. Перенести одну колонию от каждого трансформированной Е.coli BL-21 клеток в 3 мл LB бульона , содержащего 100 мкг / мл ампициллина , в неполностью закрываютс крышкой 15 мл трубки. Инкубируйте культуру при 37 ° С с 150 оборотов в минуту дрожать.
  6. Охлаждают культуру 25 градусов Цельсия при OD 600 культуры составляет около 0,6 и добавляют IPTG до конечной концентрации 0,4 мМ , чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка. Выдержите культуры за дополнительную 4 ч при 25 ° С при 200 оборотов в минуту дрожать.
  7. Перенесите 1 мл культуры в микроцентрифужных трубки. Гранул клетки центрифугированием при 12000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант.
  8. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера для денатурации (8 М мочевины, 20 мМ фосфата натрия и 0,5 М NaCl, рН 7,4) с помощью пипетки вверх и вниз с помощью микропипетки. Смешайте энергичным встряхиванием.
    Примечание: Образец зольТеперь utions должны быть полупрозрачными, немного липкое, и готов к гибридизации дот-блот.

3. Проектирование и синтез перекрывающихся пептидов

  1. Дизайн и синтезировать 3 последовательных 20-мерные пептиды , которые каждая пересекаются с его преемником на 10 аминокислотных остатков от 195-338 аа области белка YGNNV пальто сужать эпитоп область RG-М56 мАт по блоттинг.
  2. Дизайн и синтезирующие 3 три 8-мерные пептиды (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 и 199 VLCRWSVR 206) с перекрытием 6 аминокислотных остатков на следующий синтетический пептид , чтобы сузить область эпитоп 195-206 аа по блоттинг.
  3. Дизайн и синтезировать 3 7-меров (196 NVSVLCR 202 и 195 VNVSVLC 201), 6-мерный (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, и 197 VSVLCR 202), а также 5-мерные пептиды (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 и 198 SVLCR 202) с перекрытием 6, 5 и 4 аминокислотных остатков, соответственно, на их соседних пептидов минимизирующих эпитоп область по блоттинг.

4. Dot-блотгибридизации

  1. Растворите каждый синтезированный пептид в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 10 мг / мл.
    Примечание: Для того, чтобы преодолеть разнообразные растворимость синтетических пептидов, все синтетические пептиды должны быть растворены в ДМСО. ДМСО является хорошим растворителем для полного растворения гидрофобные или гидрофильные пептиды.
  2. Замачивание поливинилиденфторид (PVDF) мембрану с метанолом в течение 2 мин.
    Примечание: ПВДФ мембраны до 100% устойчив к ДМСО; другие не могут быть так.
  3. Равновесие ПВДФ мембраны с модифицированным буфером Towbin (25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 0,1% SDS, рН 8,3) для2 мин.
    Примечание: на 10-20% (об / об) метанола может быть добавлен в модифицированном буфере Towbin, чтобы улучшить результаты передачи.
  4. Промыть кусок хроматографической бумаги с модифицированным буфером Towbin. Поместите PVDF мембрану на бумажной хроматографии. Подождите, пока модифицированный буфер Towbin не исчез с поверхности мембраны ПВДФ прежде чем переходить к следующему шагу.
  5. Добавляют 2 мкл каждого образца пептида к мембране с наконечником 10 мкл. Высушите PVDF мембрану на бумажной хроматографии в течение 10 мин. Добавьте каждый пептид образец медленно и постепенно на мембрану, чтобы избежать слишком большого количества диффузии.
  6. Блок мембраны в буфере TBST (0,05% (об / об) твина-20, 20 мМ Трис и 150 мМ NaCl, рН 7,4) с 5% обезжиренным молоком в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
  7. Добавить RG-M56 мАт при конечном разведении 1: 1000 в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком в мембране. Инкубируйте мембраны при 37 ° С в течение 1 ч при осторожном встряхивании.
  8. Удалить антитела таклюция. Промывают мембрану в буфере TBST в течение 5 мин при осторожном встряхивании. Повторите дважды.
  9. Добавить вторичные антитела (козье антитело против мышиного IgG, Fc, конъюгированный щелочной фосфатазы) при конечном разведении 1: 5000 в буфере TBST с 5% обезжиренным молоком в мембране. Инкубируйте мембраны при 37 ° С в течение 1 ч при осторожном встряхивании.
  10. Выбросьте раствор антител. Промывают мембрану в буфере TBST в течение 5 мин при осторожном встряхивании. Повторите стадию промывки дважды.
  11. Разработка мембраны с раствором субстрата BCIP / NBT при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Остановить развиваемого промывки мембраны с DDH 2 O при появлении сигнала.
  12. Высушите мембрану и захватить дот-блот изображение, используя систему изображения.
  13. Измерьте интенсивность каждого дот - блоттинга с использованием программного обеспечения для анализа изображения 3.

5. аланин Сканирование и Замена

  1. Дизайн и синтезировать 3 аланин и Methionine замещения пептидов. Сменяют друг аа остатки аланина для 8-мерного пептида 195 VNVSVLCR 202 и синтезируют пептиды 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 и 195 VNVSVLCA 202 , Заменить аа остаток лейцина 200 в метионин для создания SJNNV генотип эпитоп пептида 195 VNVSVMCR 202.
  2. Следуйте Раздел 4 для выполнения аланин сканирования и замещение мутагенеза дот-блоттинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цель этого эксперимента заключалась в определении эпитоп через блоттинг с использованием мАт. Для того, чтобы быстро и эффективно сузить антигенный область признана мАт, полнометражный и серийно усеченные YGNNV рекомбинантные белки оболочки с слитого тегом 6xHis на С-конце были выражены из системы экспрессии кишечной палочки ПЭТ 10 (рис 1А). Полученные рекомбинантные белки были замечены на PVDF мембрану с помощью RG-M56 МАБ и анти-6xHis а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предлагает быстрый и простой метод для идентификации МАБ признан линейный эпитоп. Принимая во внимание стоимость пептидного синтеза и эффективности производства синтеза пептидов, антигенный участок белка вируса оболочки был уменьшен путем экспрессии последовательно укороченные рекомбинантные белки перед проведением анализа пептидного сканирования. Таким образом , надежная и эффективная система экспрессии кишечной палочки ПЭТФ используется для производства этих серийно усеченные рекомбинантных белк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, связанного с этим отчетом.

Благодарности

Авторы благодарят мисс Чинг-Чун Лин и мисс Диану Лин из Основного центра Института клеточной и организменной биологии (ICOB) Academia Sinica за предоставление своих знаний в области синтеза пептидов и секвенирования ДНК, соответственно. Это исследование было поддержано Academia Sinica.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гибрид-SFM средаGibco12045-076
Фофат-буферизованный физиологический раствор Дульбеккоса (PBS)Gibco21600-069
ДНК-полимераза ПФУ Термо Научный EP0502 Включая буферы
T4 DNA LigaseRoche10799009001включая буферы
NdeI Биолаборатории Новой АнглииR0111SВключая буферы
XhoI New England BiolabsR0146SВключая буферы
pET-20b(+) векторNovagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α компетентная клеткаRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) компетентная клеткаRBC BioscienceRH217
ампициллинAmresco0339-25G
LB бульон Инвитронген12780-052
изопропилтио-&бета;-D-тиогалактозид (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
МетанолMerck Millipore106009
полиоксиэтилена 20 Сорбитан Монолаурат (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
ГлицинAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
ГлицеринAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
козий антимышиный IgG, антитело к Fc-фрагментуJackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (Поливинилиденфторид, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Protein G Agarose Fast FlowMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Image SystemUVPn/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8UVPn/a
Термоамплификатор MyCyclerBioRad1709713

Ссылки

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24(2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи