Методическая статья

Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

DOI:

10.3791/55461

⸱

15 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем генерацию человеческой инженерии сердечной ткани от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) -derived кардиомиоцитов. Мы представляем метод анализа сжатия силы и примерное изменение сжатия рисунка с помощью ингибитора HERG канала E-4031. Этот метод показывает высокий уровень надежности и пригодности для сердечного скрининга лекарственных средств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

инженерные ткани сердца описывается методы для образования трехмерных силы, генерирующей инженерии тканей. Для осуществления этих процедур в области фундаментальных исследований и разработках доклинических наркотиков, важно разработать протоколы для автоматической генерации и анализа в стандартных условиях. Здесь мы представляем технику для создания Engineered ткани сердца (EHT) из кардиомиоцитов различных видов (крысы, мыши, человек). Метод основан на сборке фибринового-гель, содержащий диссоциированные кардиомиоцит между упругой полидиметилсилоксан (PDMS) сообщениями в формате 24-луночного. Трехмерная, силогенерирующая EHTs составляет в течение двух недель после отливки. Эта процедура позволяет генерировать несколько сотен EHTs в неделю и технически ограничен только наличием кардиомиоцитов (0,4-1,0 × 10 6 / EHT). Оценка auxotonic мышечных сокращений производится в модифицированной инкубационной камере с Mechanческие блокировки для 24-луночных планшетов и камеры размещены в верхней части этой камеры. Программное обеспечение управление камерой перемещается по системе координат XYZ каждой EHT. EHT сокращение обнаруживается с помощью автоматизированного алгоритма распознавания фигуры, а сила рассчитываются на основе укорочения EHT и упругой склонность и геометрии сообщений PDMS. Эта процедура позволяет автоматизированного анализа большого числа EHT в стандартных и стерильных условиях. Надежное обнаружение эффектов препарата на кардиомиоциты сокращения имеет решающее значение для развития сердца наркотиков и безопасности фармакологии. Мы демонстрируем, с примером HERG ингибитора канала E-4031, что человеческая система EHT размножается реакции лекарственного препарата на сжимающих кинетике человеческого сердца, что указывает на то, чтобы быть перспективным инструментом для скрининга сердца безопасности лекарственных средств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечные побочные эффекты, такие как синдром длительного медикаментозного интервала QT привели к рыночному снятию за последние года. Статистические данные показывают , что около 45% всех снятий обусловлены нежелательных эффектов на сердечно - сосудистую систему 1. Эта неудача наркотиков после дорогостоящего процесса и утверждения развития является наихудшим сценарием для фармацевтических компаний. Поэтому научные исследования и разработки отделов сосредоточиться на выявлении таких нежелательных сердечно-сосудистых эффектов на ранних стадиях. Для экономических и этических проблем, усилия по сокращению экспериментов на животных и заменить их новыми в пробирке скрининга на постоянной основе.

Набор установленных анализов включены в пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) и Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) руководящих принципов для доклинической оценки проаритмических эффектов препарата 2. Технология перепрограммирования соматических клеток с последующим дифференцированиемчеловек , индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) увеличили эту область исследований 3. Он предлагает возможность экранировать новые кандидат наркотиков на кардиомиоцит человека в пробирке и избежать проблем с межвидовыми различиями. Последние сердечные дифференциация протоколы 4, 5 обеспечивают неограниченный запас кардиомиоцитов без этической проблемы. Тем не менее, измерение сократительной силы, наиболее важной и лучше всего характеризуется в естественных условиях параметра кардиомиоцитов, не установлено. Это связанно с относительной незрелостью 6 клеток , полученных кардиомиоцит плюрипотентных стволовых человека индуцированного (hiPSC-CM) по сравнению с взрослыми кардиомиоцит. Возможное улучшение является инженер 3-мерные тканей сердца от отдельных клеток 7 (инженерия ткани сердца, EHT). Протокол EHT основан на встраивание одного мышиные или человеческие кардиомиоциты 8 SUP>, 9, 10 в фибрин гидрогеля между двумя гибкими полидиметилсилоксан (PDMS) сообщений 11 в формате 24-луночного. В течение нескольких дней кардиомиоциты начинают сжиматься спонтанно в виде отдельных клеток и начинают формировать сотовые сети. Через 7-10 дней, макроскопические стягивания всей ткани видны. В ходе этого процесса внеклеточный матрикс ремоделируется, что приводит к уменьшению диаметра и длины. Укорочение результатов EHT в изгиб PDMS отправлять даже во время отдыха, подвергая кардиомиоцитов в развивающемся EHT к непрерывной нагрузке. EHTs продолжает выполнять auxotonic сокращения мышц в течение нескольких недель. Человеческие EHTs показывают ответы на физиологическую и фармакологическую стимуляцию , указывающие на их пригодность для скрининга лекарств и болезни моделирования 7.

В этой рукописи мы представляем надежный и простой протокол для generatiна человека EHT и автоматизированного анализа сократимости концентрации зависимых изменений шаблона сокращения в присутствии ингибиторов HERG канала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Следующие шаги описывают протокол для культивирования клеток. Выполните в стерильных условиях и использовать подогретые СМИ.

1. Сердечная Дифференциация hiPSC

  1. Развивайте hiPSC
    1. Шерсть 6-луночные планшеты (1 мл / лунка) или колбы Т75 (7 мл / колба) с уменьшенным фактором роста матрицей базальной мембраны (например , geltrex, 1: 200; смотрите таблицу материалов) , разведенные в модифицированном Дульбекке среды Иглы (DMEM) , для 30 мин при 37 ° С. Подготовка FTDA носителя 12 путем смешивания основным DMEM / F-12 среды с 2 мМ L-глутамина, 0,5% пенициллина / стрептомицина, 5 мг / л трансферрина, 5 мкг / л селена, 0,1% человеческого сывороточного альбумина, 1x липидно-микс, 5 мг / л инсулина, 50 нМ dorsomorphin, 2,5 нг / мл активина а, 0,5 нг / мл человеческого TGFß1 и 30 нг / мл FGF2.
    2. Семенной hiPSC (~ 3 х 10 на 5/10 кв.см) , в среде и культуре FTDA при 37 ° С, 5% СО 2, 21% O 2 с ежедневной сменой среды (Фигура 1А). При 80% конфлюэнтности, прохождение (1: 2-1: 6) с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA, 0,5 мМ; время инкубации ~ 4 мин).
  2. Формирование эмбрионального телец (EB)
    1. Выращивают hiPSC в колбах Т75 до высокой плотности.
      1. Промыть колбы с клетками сливающихся в два раза фосфатно-солевым буфером без кальция и магния (PBS) и инкубируют в 0,5 мМ ЭДТА в течение ~ 10 мин. Убедитесь в том, что клетки не отделяются от дна колбы.
      2. Удалить ЭДТ со стеклянной пипеткой, промойте от клеток с 10 мл PBS, кран колбы на скамье, чтобы отделить клетки.
        Примечание: Используйте ячейки скребок, если это необходимо.
      3. Собирают клетки в 50 мл коническую пробирку, добавьте ¼ объема (например , 10 мл RMPI до 40 мл клеточной суспензии) RPMI 1640 (или любой другой стандартной средой , содержащей 1,8 мМ кальций) и центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин.
    2. Ресуспендируют осадок клеток в FTDA среде с добавлением 4 мг / мл поливинилового спирта (ПВС) и10 мкМ Y27632 и подсчет клеток в камере Neubauer.
    3. Заполните вращающуюся колбу с клеточной суспензии (30 х 10 6 клеток / 100 мл FTDA среде с добавлением ПВА и Y-27632; смотри стадию 1.2.2) и инициировать формирование в EB вращающихся колбах (регулировать скорость ротора магнитной мешалки до 40 оборотов в минуту ) в инкубаторе для клеточных культур (37 ° с, 5% СО 2, 5% O 2) в течение ночи.
  3. Мезодерма дифференциация
    1. Во время формирования EB, пальто культура клеток колбы подходит для суспензионной культуры с неионогенным поверхностно-активным веществом (14 мл / T175) в течение ночи при 37 ° C.
    2. На следующее утро, мыть колбы поверхностно-покрытием дважды PBS (30 мл / T175). Добавить PBS снова и держать в инкубаторе до тех пор, пока это необходимо.
    3. Удалить вращающуюся колбу из инкубатора.
      Примечание: Клеточная суспензия должна быть ясно , с небольшим макроскопический видимым ЭТ (рис 1В).
    4. Передача 50 мл суспензии в конической ванну 50 мле, и пусть ЭТ соглашайтесь на 5-20 мин.
    5. Удалить супернатант и промыть осадок с 7 мл RPMI 1640 с добавлением 2% поливинилового спирта и 10 мкМ Y-27632. Передача суспензии в градуированный 15 мл коническую пробирку и оценки EB объема (~ 50-100 мкл).
    6. Передача содержимого вращающихся колбах с непокрытыми колбах Т175 и оставьте на V-образной стойки для осаждения на срок до 20 мин. Удалить супернатант и мыть эмбриональные органы, как указано выше. Не заполняйте T175 колбу с более чем 200 мл, как седиментация бы слишком долго. Если первоначальный объем вращающейся колбы превышает 200 мл, разъемный EB суспензию до нескольких колб Т175 и объединить ЭТ снова после мытья.
    7. Удалить промывочной среды и ресуспендируют в среде для дифференцировки мезодермы, то есть среда RPMI с добавлением 4 мг / мл поливинилового спирта, 0,5% пенициллина / стрептомицина, 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES), 0,05% сыворотки человека альбумина, 5 мкг / мл трансферрина, 5 нг / мл селенит натрия, 0,1% смеси липидов, 250 мкМ фосфо-аскорбат, 10 мкМ Y-27632, 10 нг / Мл Бон морфогенетического белка-4 (BMP-4), и 3 нг / мл активина А, 5 нг / мл FGF2 стабильным.
    8. Удалить PBS из поверхностно-активного вещества, покрытые колб Т175 и залить клеточную суспензию (200 мкл ЭТ в 40 мл). Используйте меньшие колб меньшего объема для EB.
    9. Выращивают ЭТ в виде суспензии в течение трех дней (37 ° С, 5% СО 2, 5% O 2). Обмен 50% от среднего (того же состава, что и в шаге 1.3.7) каждый день (использование V-образная стойка седиментации). Приготовьте среду свежей каждый день до кормления.
  4. Сердечная дифференциация
    1. Подготовьте новые сосуды поверхностно-покрытием за день до и ручки, как указано выше (1.3.2).
    2. После трех дней индукции мезодермы, пусть ЭТ оседать до 5 мин на оседания стойки. Удалить большую часть среды и промывают RPMI 1640 с добавлением 0,5% пенициллина / стрептомицина и 10 мМ HEPES.
    3. Передача 10 мл суспензии EB закончил15 мл трубки и оценка объема ЕВ после осаждения.
    4. Ресуспендируют ЭТ тщательно в сердечной дифференциации среде, состоящей из среды RPMI 1640 с добавлением 0,5% пенициллина / стрептомицина, 10 мМ HEPES, 0,05% сывороточного альбумина человека, 5 мкг / мл трансферрина, 5 нг / мл селенита натрия, 0,1% смеси липидов, 250 мкМ фосфо -ascorbate, 1 мкМ Y-27632, 100 нМ ингибитора Wnt-ДС-I-7 13.
    5. Передача ЭТ к новым поверхностно-покрытием колбы для культивирования клеток (~ 200 мкл ЭТ в 46 мл / T175).
    6. Инкубировать в течение трех дней (37 ° С, 5% СО 2, 21% O 2) с 50% среднего изменения (состав среды смотри стадию 1.4.4) на второй и третий день. Не изменять среду в течение первых 48 часов.
    7. Инкубировать в среде , состоящей из среды RPMI 1640 с добавлением 500 мкМ 1-тиоглицерина, 10 мМ HEPES, 0,5% пенициллина / стрептомицина, 1 мкМ Y-27632, 2% свободной от сыворотки нейронные культуры клеток добавка (например , В27) с инсулином, 100 нМ Wnt Ингибитор DS-I-7 при ежедневном обмене 50% среды в течение следующих четырех дней. ЭТ должны начать бить в течение этого периода.
    8. После одной недели сердечной дифференциации, переключиться на ту же самую среду без ингибирования Wnt и с бессывороточной нейронной клеточной культуральной добавки. Изменение 50% среды каждый день, в первый день, за исключением.
  5. Диссоциация кардиомиоцитов человека
    Примечание: После двух недель протокола дифференцировки, ЭТ должен показать спонтанные сокращения (рис 1C). Если да, то начать диссоциацию и подготовить коллагеназы решение.
    1. Подготовка раствора коллагеназы путем взвешивания и решения 200 ед / мл в бескальциевом сбалансированном солевом растворе Хенкса без кальция / магния (HBSS) и добавляют 1 мМ HEPES, 10 мкМ Y-27632, 30 мкМ N-бензил-п-толуола-сульфонамида ( БПС). Стерилизовать фильтрацию (фильтр 0,2 мкм) и хранить аликвоты при -20 ° C. Оттепель аликвот при 4 ° С в течение ночи.
    2. Settle ЭТ на оседания стойку,аспирата среды и заменить 20-25 мл предварительно подогретого HBSS. Повторите этот шаг стирки еще раз.
    3. Аспирируйте HBSS, и заменить подогретым раствором коллагеназы (15 мл / T175). Инкубировать в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С, 5% СО 2, 21% O 2).
    4. Подготовьте блокирующий буфер с DMEM, с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина и ДНКазы (12 мкг / мл).
    5. Нажмите колбы культуры клеток на скамейке, диссоциированный ЭТ должен распадается и распадается (если нет, то увеличить время инкубации). Аккуратно растирают суспензию клеток и перенос в коническую пробирку 50 мл. Промыть колбы с блокирующим буфером (15 мл / T175) и переносят в пробирку.
    6. Центрифуга в течение 10 мин при 100 х г. Ресуспендируют клетки в теплой DMEM, растирают и подсчет клеток.

2. Формирование Engineered ткани сердца (EHT)

  1. Автоклав коммерчески доступные стойки PDMS и политетрафторэтилена (PTFE) распорки (см Материалы иОборудование электронных таблиц; Рисунок 2) и подготовить следующие растворы в стерильных условиях, за один день до поколения EHT.
    1. Подготовьте 2% агарозы путем взвешивания и растворения в соответствующем объеме PBS, автоклав, немедленно хранят при температуре 60 ° C.
    2. Подготовьте апротинин (33 мг / мл) путем взвешивания и растворения в соответствующем объеме объявлений iniectabilia аква, фильтр стерильный фильтр (0,22 мкм), аликвоты и хранят при -20 ° С.
    3. Подготовьте фибриноген (200 мг / мл) путем растворения стерильного фибриногена в соответствующем объеме стерильной 0,9% NaCl (тепловатая), аликвоты и хранят при -20 ° С.
    4. Подготовьте тромбин (100 Еда / мл) путем растворения стерильного тромбина в трех частях стерильной PBS и 2 части аква iniectabilia объявлений, аликвотные части 3 мкла в трубочках и хранить при -20 ° С.
    5. Подготовьте 10x DMEM путем растворения 670 мг 10x DMEM порошок в 5 мл аква объявлений iniectabilia, фильтр стерильными и хранят при температуре 4 ° С.
    6. Приготовьте 2x DMEMпутем смешивания 2 мл DMEM с 10-кратным 2 мл инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки, 0,2 мл пенициллина / стрептомицина и 5,8 мл аква объявлений iniectabilia, фильтр стерильными и хранят при температуре 4 ° С.
    7. Подготовка EHT-литья среды (ECM) путем смешивания DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамина (200 мМ), хранят при температуре 4 ° С.
  2. Подготовка литейных форм в 24-луночных планшетах с помощью пипетки 1,6 мл теплой агарозы (2%, PBS) и размещения PTFE прокладки (фигура 2А) в лунки.
    Примечание: Место распорка сразу после того, как пипетка максимума на 8 лунок - агарозном затвердевает очень быстро. Не оставить агарозы при комнатной температуре в течение более 5 мин.
  3. После агарозного затвердевания (~ 10 мин, агарозы станут непрозрачными), удалить распорки PTFE (рис 2c) и поместите PDMS стойку (Фигура 2В) в пресс - форму для литья таким образом , чтобы пары сообщений PDMS достигают в каждую пресс - форму (рис 2D).
  4. Ресуспендируют кардиомиоцитов в ECM с минимальной концентрацией 15 × 10 6 клеток / мл.
  5. Подготовьте 110% от расчетного объема восстанавливающей смеси в круглом дне 15-мл пробирки на ice.For 24 EHTs, пипетка восстанавливающей смеси, перечисленную в таблице 1 для человека, крысы или мыши кардиомиоцитов, соответственно (10% дополнительно включен).
    Примечание: Концентрация клеток восстанавливающей смеси различна для человека (10 × 10 6 клеток / мл), крысы (4,1 × 10 6 клеток / мл) и мышей (6,8 × 10 6 клеток / мл) EHTs. В зависимости от концентрации клеточной суспензии, добавить дополнительный ECM до конечного объема 2640 мкл. Фибриноген должен быть теплыми для пипетки. Медленно заполнить кончик пипетки и не прикасаться к поверхности холодной восстанавливающей смеси с фибриногеном, содержащей пипеткой при добавлении фибриногена в восстанавливающей смесь - вязкость фибриногена в наконечнике пипетки будет немедленно увеличить.
  6. Растирает восстановленную смесь 10 - 15 раз с серологической пипеткой до фибриногена сгустка растворяются. Проверьте соединение восстановленным в пипетку однородности.
  7. Для каждого EHT, пипетку 100 мкл смеси в восстанавливающей одного тромбина аликвоты (3 мкл в 200 мкл трубки), перемешать и пипеткой смесь в агарозном-образных пазов так быстро , как это возможно (рис 2Е). Используйте новый наконечник фильтра для каждого EHT. Ресуспендирует восстановленным смесь (растирание с серологическими пипеткой 5-10 раз) после каждых 8 EHTs.
  8. После того, как все слоты заполнены восстанавливающая смесь, закрыть крышку для культивирования клеток Петри и инкубируют при 37 ° С, 7% CO 2 в течение 2 ч.
  9. Удалите пластину из инкубатора и место под стерильным колпаком. Накройте каждую лунку с небольшим количеством среды (например , DMEM, приблизительно 200 - 500 мкл), встряхнуть пластину осторожно и снова инкубировали при 37 ° С в течение по меньшей мере 10 мин. Добавление DMEM облегчит удаление из фибриновых гелей агарозы из литейных форм.
  10. Подготовьте новый 24-луночный планшет с 1,5 мл EHT-среды на лунку, состоящий из DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, 10 мкг / мл инсулина, 33 мкг / мл апротинина.
  11. Осторожно снимите стойки PDMS из пресс - форм для литья агарозы и передавать их в среде заполненной 24-луночного планшета (рис 2F). Поместите блюдо обратно в инкубаторе (37 ° С, 7% CO 2, 40% O 2 для человека и крыс EHTs, 21% O 2 для EHTs мыши) и корм понедельники, среды и пятницы с свежеприготовленным EHT-средой. EHTs должен показать спонтанные сокращения отклоняющих постов стеллажей PDMS через 7-10 дней после литья (рис 1D, 2G).
    1. Для мыши EHTs добавляют 25 мкг / мл 5-цитозин βDarabinofuranoside к культуральной среде в течение 48 ч, чтобы ограничить пролиферацию фибробластов.

3. Сужение анализ

Примечание: Анализ сжатия основан навидео-оптической записи в коммерчески доступном инструменте анализа EHT (таблица материалов). Центральный блок этого прибора является инкубационной камерой (фиг.3А). Программное обеспечение , предоставленное с прибором вычисляет силу сжатия на основе отклонения постов PDMS с известным модулем упругости и геометрии 11 (Дополнительный рисунок 1).

  1. Включите нагревательное устройство машины 2 ч до начала измерения. Включите поставку газа и электронного снабжения системы координат непосредственно перед анализом сокращения.
  2. Для базовой записи (опорная точка в анализе), место 24-луночного планшета с EHTs в EHT-среде в анализе инструмент EHT и запустить программное обеспечение для анализа сжатия в соответствии с инструкцией поставщика.
    1. Перейдите на вкладку «Протокол» на правой панели и введите соответствующую информацию относительно имени исследования, пользователей, видов, Ceтип Л.Л., возраст, продолжительность записи и дополнительные замечания.
    2. Перейдите на вкладку «Вид камеры» на левой панели и начать камеры живой режим с режимом автоматического обнаружения фигуры. Перейдите на вкладку «Настройка» на правой панели andadjust положение камеры с АБВ координаты для каждой лунки в 24-луночного блюдо. Убедитесь, что EHT находится в центре окна и в фокусе камеры.
      1. Убедитесь, что крышка клеточной культуры блюда не туманно, так как это приведет к ухудшению распознавания фигуры и анализа сжатия.
        Примечание: Алгоритм распознавания фигуры основан на выявлении зоны высокого контраста и контроля за их изменение положения. В программном обеспечении эти области распознавания фигуры будут отмечены синим крестом, который движется с сокращениями EHT.
      2. Убедитесь , что позиции синих крестов на обоих верхних и нижних концах EHTs и движется только по вертикали соответствие сокращениями EHTs (рис 3B). Sпросп позиции установки каждой лунки, нажав на кнопку «позиция ОК».
    3. Затем перейдите на вкладку «Параметры» на левой панели. Отображаемые здесь параметры определяют критерии, по которым программа идентифицирует пик сжатия и помечает его с зеленым квадратом. Эти значения очень важны для правильной идентификации пиков сжатия (рис 3C) и без каких - либо ложных точек данных (рис 3E-F).
      Примечание: Перечень видов зависимых параметров и примеров изображен на рисунке 3Н. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к руководству программного обеспечения.
    4. Перейдите на вкладку «Автоматический» на правой панели и начать анализ с помощью нажатия кнопки «Пуск». Программное обеспечение будет перемещаться последовательно от одной скважины к следующим, записи EHT сокращениям и рассчитать силу во время записи (отображаются на вкладке «реальное время» на левой панели). В конце анализа, отчет в формате PDF конспектыЗин результаты будут сгенерированы автоматически.
  3. Сохранить и анализировать PDF отчет системы сгенерированной для подведения итогов.
  4. Контроль параметров сократительной от повторных измерений в течение нескольких дней. EHT будет увеличиваться в силу сжатия до тех пор, пока не достигнет плато (обычно около 15-й день культуры).
  5. скрининг Drug
    1. Подготовка белок свободного решения Тироды за один день до измерения и уравновешивает в 24-луночных планшетах (2 мл / лунка) в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С, 7% СО 2, 40% O 2) в течение ночи: 120 мМ NaCl, 5,4 мМ КСl, 1 мМ MgCl2, 0,1-5 мМ CaCl 2, 0,4 мМ NaH 2 PO 4, 22,6 мМ NaHCO3, 5 мМ глюкозы, 0,05 мМ Na 2 ЭДТА, 25 мМ HEPES. Добавить кальций до 1,8 мМ или ранее определенного [EC 50] для изучения положительных инотропных эффектов.
    2. Взвесить и растворения лекарственного средства в ДМСО и фильтруют стерильно, если это необходимо.Подготовьте 6 различных 1000x-суб-растворы (в ДМСО) в рабочей концентрации (например , 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 мкМ для соответствующего диапазона наномолярной).
    3. Развести соответствующий запас в Тироде пластин (2 мкл в каждой 2 мл на лунку) и тщательно перемешать. Поместите пластины обратно в инкубатор, пока не понадобится.
    4. Начало базовых измерений, принимая первую Тироду заполненного 24-луночного планшета под капотом стерильных и положение угольных электродов в скважинах. Передача стойки PDMS с EHTs, расположенной на верхней части угольных электродов, закрыть крышку, поставить пластину обратно в инкубаторе и ждать уравновешивающий период ~ 30 мин.
    5. Перенесите EHTs из инкубатора в интерлки в анализе инструменте EHT. Закройте прибор и запись спонтанной базовой сократимость (20 с / EHT).
    6. Подключение угольных электродов к стимуляции кабеля и начать электрической стимуляции EHTs (2,5 В, 4 мс длительность импульса, человек: ~ 1 Гц, крыса: ~ 2Гц, мышь: ~ 4 Гц). Записывает "шагает" базовую линию (10 с / EHT). Убедитесь, что все EHTs правильно темп. Частота стимуляции и напряжение могут варьироваться в зависимости от клеточной линии к клеточной линии.
    7. После того, как базовой записи, удалите EHTs из прибора и передачи электродов с PDMS стоек на верхней части, к 24-луночного планшета с первой концентрации лекарственного средства. Передача EHTs обратно на блокировку анализа инструмента EHT немедленно и инкубировать там (стандартный препарат инкубационного времени , например , 20 мин).
    8. Заново стимуляция кабелей, настроить распознавание фигуры и запись EHT схваток реагирующих на первую концентрацию лекарственного средства.
    9. Для следующих концентраций препарата, повторить шаг 3.5.7 и 3.5.8 с 24-луночные планшеты, содержащие-более высокие концентрации лекарственного средства.
    10. Сохранить все записи в формате PDF. Проверьте каждую запись для распознавания фигуры, правильного расположения зеленых квадратов идентификации пиков сжатия и артефактов (см 3.2.1 и Рисунок 3 ).
    11. Выполните дополнительный автономный анализ , если это необходимо.
      1. Выберите соответствующий прогон из базы данных «наезжает» на левой панели, нажав кнопку «Выбрать Выполнить». На вкладке «Параметры» на левой стороне, изменить параметр для анализа сжатия. Теперь выберите «Автономный анализ» на вкладке «Автономной» на правой панели, чтобы повторно проанализировать видео.
      2. Для настройки распознавания фигуры и, следовательно, записать новое видео файл, выберите «обзор Sample» после корректировки распознавания фигуры во вкладке «реальное время». Примечание: Обзор образца может только повторный анализ одной скважины за один раз, в то время как автономный анализ можно применить новый параметр для всех скважин, нажав на кнопку «Использовать параметр на все скважины» на панели «Параметры» слева. Оба типа оффлайнового анализа будет автоматически создавать новые файлы данные и PDF, отображающие результаты.
    12. Анализ эксперимента путем объединения результатов бiological реплицируется и суммировать данные в кривых концентрации отклика для частоты, силы, сокращения времени сжатия и временем релаксации (рис 5D) и / или графическое отображение средних пиков сжатия (рис 5с).
      Примечание: PDMS стойки и ПТФЭ прокладка может быть использована повторно (ПДМС стеллажи макс 5 раз, и ПТФЭ спейсер бесконечно.). После использования, очистите их вручную с водой, кипятить дважды в деминерализованной воде и автоклав. Будьте в курсе возможных перенесенных эффектов, при повторном использовании стойки, так как препараты могут быть поглощены PDMS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечное Дифференцирование и подготовка EHT

HiPSC были расширены на уменьшенном фактор роста матрицы базальной мембраны, диссоциируют с ЭДТА и эмбриональным телец (ЭТ), образованный в вращающихся колбах в течение ночи. После индукции мезодермы в течение трех дней, сердечная дифференциация была начата с ингибитором Wnt. После ~ 17 дней протокола дифференцировки, бьющий ЭТ были диссоциированы на отдельные клетки с коллагеназой тип...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engineered ткань сердца предлагает ценный вариант для панели инструментов сердечно-сосудистых исследований. EHTs в формате 24-луночного доказали свою ценность для моделирования болезни 8, 14, безопасности лекарственных средств скрининга 7, 8, 10, 11, 15, или основной сердечно - сосудистых исследований...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IM, TE и AH являются соучредителями EHT Technologies GmbH, Германия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны Алессандра Моретти и Деннис Шаде за их любезный вклад материала. Мы признаем большую поддержку рабочей группы иКА и EHT на кафедре экспериментальной фармакологии и токсикологии УКЭ. Работа авторов поддержана грантами от DZHK (Немецкий центр по изучению сердечно-сосудистых) и немецкого министерства образования и научных исследований (BMBF), Немецкий исследовательский фонд (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Британский Национальный центр по замене Refinement и сокращение животных в научных исследованиях (NC3Rs CRACK-IT грант 35911-259146), британский Heart Foundation RM / 13/30157, исследовательский Совет Европы (Advanced Grant IndivuHeart), Фонд немецкого кардиологического и Свободном унд Ганзейский город Гамбург.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EHT Analysis intrumentEHT Technologies GmbHA0001Программное обеспечение входит в комплект EHT
PDMS RackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE SpacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT электродEHT Technologies GmbHP0001
EHT адаптер/кабель для электростимуляцииEHT Technologies GmbHP0002
24-луночный планшетNunc144530
6-луночный планшет для культивирования клетокNunc140675
соколиной пробиркой 15 мл, градуированный Sarstedt62,554,502
Скребок для клетокSarstedt831,830
Колба-спиннерIntegra182 101
Мешалка Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Отрегулируйте частоту вращения ротора до 40 об/мин
Колба для клеточных культур T175 Сарстедт 831,812,002
V-образный стеллаж для осаждения Индивидуальное изготовление в UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-тиоглицерин Sigma AldrichM6145
2-фосфо-L-аскорбиновая кислота тринатриевая сольSigma Aldrich49752
Activin-A НИР Системы D338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
АпротининSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS инсулин Gibco17504-044
БМП-4R& D системы314-BP
Коллагеназа II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, тип V (из бычьей селезенки)Sigma D8764
Дорсоморфин abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Фетальная сыворотка для телятGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Фибриноген (бычий)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302Для покрытия: разведение 1:200
HBSS без Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Лошадиная сывороткаLife technologies26050088
Сывороточный альбумин человека Биологическая промышленность05-720-1B
Инсулин, человеческийSigma Aldrichi9278
L-глутаминGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234для реконструирования EHT.
N-бензил--толуолсульфонамидTCIB3082-25G
PBS без MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Пенициллин/стрептомицинGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Поливиниловый спирт Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Селенит натрияSigma AldrichS5261
TGFß 1Пепротех100-21
ТромбинСигма ОлдричТ7513
Трансферрин Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio США, Inc.У10075

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

hERGE 4031

Похожие статьи