Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка ДНК с высоким молекулярным весом геномной от мучнистой росы для Long-Read Sequencing

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55463

⸱

31 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описан метод экстракции, очистки и контроля качества геномной ДНК из облигатного биотрофного грибкового патогена, мучнистой росы, для использования в длинном секвенировании генома.

Аннотация

Мучнистая роса грибы представляют собой группу экономически важных грибковых патогенов растений. Относительно мало известно о молекулярной биологии и генетике этих патогенов, отчасти из-за отсутствия хорошо развитых генетических и геномных ресурсов. Эти организмы имеют большие, повторяющиеся геном, которые сделали секвенирование генома и сборка запредельно трудно. Здесь мы описываем методы оценки сбора, экстракции, очистки и контроля качества с высокой молекулярной массой геномной ДНК от одного порошкообразных видов плесени, Golovinomyces cichoracearum. Протокол, описанный включает в себя механическое разрушение спор с последующей экстракции геномной ДНК оптимизировано фенол / хлороформ. Типичный выход составил 7 мкг ДНК на 150 мг конидий. Геномная ДНК, которая изолирована с помощью этой процедуры подходит для длительного чтения последовательности (то есть,> 48,5 т.п.н.). Качественные меры контроля, чтобы обеспечить размер, выход и чистоту геномной ДНК такжеописанный в этом методе. Секвенирование геномной ДНК качества, описанное здесь позволит для сборки и сравнения нескольких геномов мучнистой росы, что в своей очереди приведет к лучшему пониманию и улучшения контроля над этим сельскохозяйственным патогеном.

Введение

Мучнисторосяных представляют собой группу облигатных биотрофных грибковых патогены растений , которые, взятые вместе, являются основной причиной болезни растений во всем мире 1. Есть более 900 описанных видов мучнистой росы, которые таксономически сгруппированные в пять племен в семье Erisyphaceae 2. В связи как их экономическое значение, и интимные отношения они развиваются со своими хозяевами, мучнистая роса заболевания были предметом исследования для> 100 лет. После заражения, настоящая мучнистая роса вызывают резкие изменения в клеточной структуре, метаболизма и молекулярной биологии их хозяев, в пользу этого патогена. Тем не менее, изучение мучнисторосяных является особенно сложной задачей из - за их облигатным образ жизни, и рост гриба в чистой культуре до сих пор не было описано 3, 4, 5,"Xref"> 6, 7, 8. Надежная, стабильная генетическая трансформация мучнисторосяных также еще не была достигнута, хотя переходное преобразование было сообщено в некоторых видах 9, 10.

Последовательность и монтаж мучнистой росы геномов оказались трудными из-за ряд особенностей самого генома. Мучнистая роса геном крупный (120 - 180 МВРА) по отношению к другим грибковым геном, и состоят из 60 - 90% равномерно распределенных повторяющихся элементов 11. Эти элементы включают в себя не-длинные концевые повторы, а также неклассифицированные повторяющиеся элементы. Два formae speciales одного вида мучнистой росе, Blumeria graminis ф. зр. hordei и е. зр. tritici (BGH и Bgt, соответственно), а также мучнистая роса винограда Erysiphe Necator, у пчелп секвенирования и проект геномы для ряда других были завершены 12, 13, 14. Повторяющийся характер геномов сделал сборку трудным, и заполненный BGH геном был собран в 6,989 supercontigs с L50 2 Мб 12.

Несмотря на большое генома, то настоящая мучнистая роса , как представляется, небольшое количество белковых генов , кодирующих, с 5,845 и 6,540 генов предсказанных в BGH и БГТ, соответственно. Виртуализированное мучнистая роса также , кажется, не имеют , по крайней мере 99 основных генов, которые необходимы в других грибов, что согласуется с зависимостью грибов на их растения - хозяина для выживания 11, 12, 13, 14.

Повторяющиеся последовательности вблизи теломеры, центромеры, рибосомальной Р.Н.Ген , массивы и область , обогащенная мобильных элементы плохо собраны из коротких чтения стратегий секвенирования и часто недостаточно представлены в геноме сборках 15. Такие области , как полагает, ответственны за многие пробела , которые происходят в геномных последовательностях, и это относится к мучнисторосяным с их экстенсивным расширением повторяющихся элементов 16. Высококвалифицированный пластические участки генома часто встречается в таких повторяющихся областях 3. Они служат в качестве сайта хромосомных перестроек и часто кодируют гены под сильным селективным давлением, такие как гены, кодирующие эффекторные белки и гены, кодирующие ферменты вторичного метаболизма. Прогресс в одной молекуле давно прочитанных технологии секвенирования обеспечивает потенциальное решение для секвенирования через повторяющиеся области геномов 15. Например, Файно и др. (2015) обнаружил, что в том числе длинных последовательностей чтения технологии и оптический мapping позволили им производить последовательность генома разрыва менее двух штаммов грибковых растений патогенов Verticillium георгина, утроение доли повторяющихся последовательностей ДНК в геноме, увеличивая количество генных аннотаций (и сокращение числа частичного или отсутствуют ген аннотации ) и выявление перестроек генома 17.

Для того, чтобы использовать эти длинные читаемые технологии секвенирования, высокие концентрации высокого качества геномной ДНК, с минимальными размерами> 20 т.п.н., необходимо. Здесь мы опишем наши методы конидий сбора, очистки ДНК высокой молекулярной массы от конидий и наши оценки контроля качества с использованием мучнистой росы видов Golovinomyces cichoracearum , выращенные на огурце 18. Этот протокол основан на протоколе , разработанном в лаборатории группы В. Келлера (Университет Цюриха, Цюрих Швейцария) 13, 19и включает в себя несколько модификаций, которые привели к повышению урожайности ДНК и более высокую долю ДНК> 48,5 т.п.н. в размере. Протокол также включает в себя этапы контроля качества на основе рекомендаций департамента Соединенных Штатов энергетики Объединенного института генома 20, 21, 22.

Функция каждого реагента , включенный в буфере для лизиса, и обоснования для каждой стадии очистки, такой , как описана в Генри (2008) 23. Доступные опубликованные протоколы для изоляции с высокой молекулярной массой геномной ДНК из растений и микроорганизмов , тканей были также проведены консультации в ходе разработки этого протокола 24, 25, 26, 27, 28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление грибного вещества,

  1. Рост к мучнистой росе
    1. Grow растений в ростовых камерах при следующих условиях: 22 ° C день температура, температуру 20 ° С ночью, 80% относительной влажности, 14-ч длина дня и интенсивность света 125 мкЕ / м 2 / с ( при условии , флуоресцентным освещением ).
    2. Infect растения огурца (Cucumis Sativa сорт Champion Буш) с штамма Golovinomyces cichoracearum UCSC1 , как описано 18, 29.
  2. Заготовка мучнистая роса Конидии
    1. Урожай конидия из зараженных растений в течение 7 - 10 дней после инокуляции с использованием небольшого вакуума с фильтром в линии (11 мкм), на котором конидия аккумулировать. Применяя мягкое давление, запустить вакуумную насадку по поверхности листа для сбора конидии.
      Примечание: Средняя урожайность Г. cichoracearum составляет 20 мг конидий из сильно инфаКТИД лист огурца примерно 130 см 2 в области.
    2. Кисть около 150 мг конидий (приблизительно 375 мкл объема, или конидии из 7-8 инфицированных огуречных листьев) из фильтра на лист чистой бумаги. Отсюда, передавать конидии в 2 мл криопробирки с двумя 5/32-дюймового диаметра, предварительно охлажденного (в жидком азоте) стальных мелющих шаров. Немедленно вернуть трубки в жидкий азот. Хранить пробирки при -80 ° С.
  3. Разламывают Конидии в шаровой мельнице
    1. Флэш заморозить алюминиевые пластины шаровой мельницы в жидком азоте. Нагрузка криопробирки в шаровой мельнице стойку. Энергично встряхнуть криопробирки с конидиями и стальными шарами в шаровой мельнице в течение 30 с при 30 циклах / с (при комнатной температуре). Немедленно замораживать криопробирки в жидком азоте.
      Примечание: Первоначально доступ образца конидий с помощью микроскопа при 100-кратном увеличении эффективности для разрыва клеточных стенок в процессе измельчения. Если необходимо, измельчить в течение дополнительных 1 - 2 раундов 30 с в течение 30 циклов / с, бешь сохранить количество раундов до минимума. Обычная оценка конидиальной поломки микроскопии на данном этапе не требуется, как только было созданы оптимальные условия.

2. геномной ДНК Очистка

  1. Конидии лизиса
    1. Работая быстро, чтобы избежать размораживания конидии, удалите стальные шарики из криопробирок с магнитом. Добавьте 700 мкл 65 ° C буфер для лизиса (Таблица 1) и вихрь 5 - 10 сек , пока суспензия не образуется.
    2. Добавьте 300 мкл предварительно нагретую (65 ° С) 5% (об / об) саркозил и осторожно перемешать инвертировать (1 инверсию за 3 секунды) пять раз. Инкубируйте пробирки в течение 30 мин при 65 ° С; инвертировать аккуратно 3 раза по 10, 20 и 30 мин. Использование широкого отверстия пипетки, передавать весь раствор к новым 2 мл микроцентрифужных трубки. На всех последующих этапах, перемешать, осторожно, медленно инверсию и перенос ДНК-содержащие растворы с широким отверстием наконечников пипеток.
  2. Экстракции ДНК I
    1. Добавить 1 объем хлораФорма: изоамиловый спирт (24: 1 об / об) к раствору для лизиса и осторожно инвертировать смешать пять раз. Инкубирую в течение 10 мин при комнатной температуре, осторожно переворачивая, чтобы смешать пять раз на полпути и снова в конце инкубации. Центрифуга при комнатной температуре в течение 15 мин при 14000 х г. Использование широкого отверстия пипетки, осторожно переносить водный слой к новым 2 мл микроцентрифужных трубки; избегать включения материала из интерфейса.
  3. ДНК Осаждение I
    1. Добавить 1 объем комнатной температуры 100% изопропанола (примерно 750 мкл) и аккуратно инвертировать смешать шесть раз. Центрифуга при комнатной температуре в течение 15 мин при 14000 х г. Осторожно удалите супернатант и выбросьте.
    2. Добавить 450 мкл предварительно охлажденной (-20 ° С) 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при комнатной температуре при 14000 х г. Осторожно удалите супернатант и выбросьте. Центрифуга при 1000 мкг в течение 3 секунд, осторожно удалить супернатант с тонким наконечником пипетки и выбросить. Высушите гранулы в течение 15 мин добавлт при комнатной температуре. Не сушить дольше, чем 15 мин.
    3. Ресуспендируют осадок в 300 мкл ТЕ (10 мМ Трис-Cl, 1 мМ этилендиамин-тетра-уксусной кислоты, рН 8,0). Инкубируют в течение ночи при 4 ° С. Аккуратно вылить ресуспендирование остаточного материала, который не пошел в раствор.
  4. Для того, чтобы удалить загрязнения РНК, добавляют 10 мкл РНКазы А (10 мг / мл). Аккуратно инвертировать смешать три раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 3 сек. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч.
  5. Экстракции ДНК II,
    1. Добавьте 300 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1 об / об) и осторожно инвертировать смешать пять раз. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре, осторожно переворачивая, чтобы смешать пять раз на полпути и снова в конце инкубации. Центрифуга 15 мин при комнатной температуре при 14000 х г. Использование широкого отверстия пипетки, передача супернатантов в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  6. ДНК Осадки II,
    1. Добавьте 0,01 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2 (approximatelу 3 мкл), осторожно инвертировать смешать пять раз. Добавьте 2,5 объема предварительно охлажденный (-20 ° C) 100% этанола (приблизительно 750 мкл). Аккуратно инвертировать смешать пять раз. Инкубируют в течение ночи при -20 ° С
    2. Центрифуга 30 мин при 4 ° С при 14000 х г. Осторожно удалите супернатант и выбросьте.
    3. Добавить 450 мкл предварительно охлажденной (-20 ° С) 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при 4 ° С при 14000 х г. Осторожно удалите супернатант и выбросьте. Центрифуга при 1000 мкг в течение 3 сек. Осторожно удалите супернатант с тонким наконечником пипетки и выбросить.
    4. Высушите гранулы в течение 30-60 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок в 27,5 мкл ТЕ. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С. Аккуратно вылить ресуспендирование остаточного материала, который не пошел в раствор.
    5. Аликвоты 2,5 мкл в 22,5 мкл ТЕ (конечный объем 25 мкл) в течение испытаний контроля качества (смотри ниже). Хранить образцы ДНК при 4 ° С до подачи для секвенирования. Для хранения долгосрочных, хранения образцовпри -80 ° C и свести к минимуму циклов замораживания-оттаивания, чтобы предотвратить срезание.
      Примечание: Будьте осторожны при пипетке на этом этапе, как с высокой молекулярной массой геномной ДНК может быть трудно пипетка должным образом, и это очень важно для того, чтобы «QC Алигота» является точным представлением геномной ДНК образца.

3. Контроль качества

  1. образец чистоты
    1. Используя ТЕ пустым, оценить чистоту образца ДНК путем загрузки 1 мкл QC Алиготе на малой громкости спектрофотометра. Запись A260 / A280 и A260 / A230 чтения. Чистый ДНК будет иметь соотношение А260 / А280 в соотношении примерно 1,8 и А260 / A230 между 1,8 и 2,2.
  2. Количественное геномной ДНК
    1. Выполнение количественной оценки аликвоты QC с использованием коммерческого набора для анализа двухцепочечной ДНК количественного в соответствии с инструкциями производителя.
  3. ДНК Качество I Оценка
    1. Нагрузка приблизительно 60 нг геномной ДНК иДНК лестницы на агарозном геле 0,7% в 1x TAE (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Запуск аппарат геля при 70 В в течение 40 - 45 мин до геномных ДНК полос приблизительно 2 см от скважины и зоны разделения в лестницах очевидно. Эти условия могут должны быть скорректированы на основе имеющихся гель-электрофореза аппарата.
  4. ДНК оценки качества II
    1. Нагрузка приблизительно 60 нг геномной ДНК и высокой лестнице молекулярной массы ДНК (подходит для электрофореза в пульсирующем поле гель) на агарозном геле 1% в 0,5х TBE (44,5 мМ Трис, 44.5 мМ борной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3) и работать в 0.5x TBE буфере работает с использованием 5 - импульсного поля протокола гель-электрофореза 80 т.п.н. сигнала в течение 16 ч.
  5. Оценка бактериальные, грибковые и загрязняющим примесям растений
    1. Выполните полимеразной цепной реакции (ПЦР), чтобы усилить соответствующие внутренние транскрибируется распорки (ИТС) области рибосомных генов с использованием праймеров и условий амплификации спискаред в таблице 2. Нагрузка 10 мкл полученной реакции на геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: группа, представляющая мучнистой росой ITS область должна быть усиленную с грибной ИТС праймеры. ДНК из этого ампликона и любого ампликона, генерируемый с бактериальными, или праймерами растений должны быть секвенированы с целью определить происхождение загрязнения. Только мучнистая роса ИТС последовательность должна быть найдена в грибковой ампликоне.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Характерным примером 60ng очищенной геномной ДНК из G. cichoracearum на агарозном геле с помощью гель - электрофореза и с помощью электрофореза в пульсирующем поле гель показаны на фигурах 1 и 2, соответственно. Геномные препараты ДНК, которые проходят, незначительно прошедшие и не контроль качества представлены. Геномные ДНК препараты, которые полностью проходят контроль качества идеально подходят для секвенирования с использов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того чтобы получить чистую, высокую молекулярную массу геномной ДНК из облигатных биотрофных грибов мучнистой росы, модифицированная версия ранее описанные методов была разработана 30. Средний выход, используя этот оптимизированный протокол составляет 7 мкг ДНК на 150 мг конидий, удвоение выхода, полученный с предшествующим протоколом. Кроме того, средний размер увеличился с приблизительно 20 т.п.н. до более чем 48,5 т.п.н.. Этот протокол был оптимизирован в cucumber- системы cichoracearu...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот протокол был разработан в поддержку совместного проекта Института генома и сообщества по секвенированию (#1657). Работа была частично поддержана Фондом Филоматии, Национальным научным фондом (#0929226) и Институтом энергетических биологических наук С. Сомервилля; и Швейцарским национальным научным фондом (#310030_163260) Б. Келлеру. Мы хотели бы поблагодарить наших коллег М. Фигуроа и М. Миллера (Университет Миннесоты), Р. Панстругу (Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена), К. Педерсена (Университет Копенгагена),. Спану (Имперский колледж), Д. Танеджу (Калифорнийский университет в Беркли), М. Вильдермута (Калифорнийский университет в Беркли), Р. Уайза (Университет штата Айова) и С. Сяо (Университет штата Мэриленд) за их щедрые советы и за добровольное участие в разработке протокола, который мы здесь разработали.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MM400 Шаровая мельницаRetsch20.745.0001Или аналогичная шаровая мельница
2 мл трубки для шарового фрезерованияSarstedt 72.694.007
Фрезерные шары из нержавеющей стали 5/32"OPS ДиагностикаGBSS 165-5000-01
Микропроцессорное управление Водяная баня серии 280 с предварительной настройкой на 65 градусов; С Thermo Fisher Scientific2825или эквивалентная водяная баня
с микропроцессорным управлением серии 280 с предварительной настройкой на 37 градусов; CThermo Fisher Scientific2825Или аналогичная водяная баня
Eppendorf 5417R охлаждаемая микроцентрифугаKrakeler Scientific 38-022621807Или эквивалентная микроцентрифуга
Хлорформ:IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich C0549Опасен при контакте с кожей или вдыхании. Носите нитриловые перчатки, защитные очки, лабораторный халат и работайте в химическом капюшоне
Фенол:Хлороформ:IAA
(25:24:1 v/v)		Thermo Fisher Scientific15593031Опасно при контакте с кожей или вдыхании. Надевайте нитриловые перчатки, защитные очки, лабораторный халат и работайте в химическом колпаке
100% ИзопропанолСигма-Альдрич;
100% этанолSigma-Aldrich 34923Охладить до -20 градусов; C Предыдущее применение
Ацетат натрияSigma-Aldrich S2889
Рназа, без ДНКАЗы (10 мг/мл)Thermo Fisher ScientificEN0531
Метабисульфит калияSigma-Aldrich P2522
Лаурилсакроинат натриясигма-олдрич L9150
База TrisSigma-Aldrich 
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-Aldrich EDS
Sodium хлорид (NaCl)Sigma-Aldrich S9888
Цетилтриметиламмония бромид (CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, UvextremeStaples423263Или эквивалентные очки
High Five COBALT нитриловые перчатки, LARGENeta ScientificHFG-N193Или эквивалентные перчатки
GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000x в водеBiotium41003
Бромид этидия 10 мг/млBiotium40042Опасен при попадании на кожу. Носите нитриловые перчатки и защитные очки
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF Стандарты размера ДНКBio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172Или эквивалентный гелевый аппарат импульсного поля
Ватман качественная фильтровальная бумага, Сорт 1Сигма-ОлдричWHA1001042Или эквивалентная ростовая камера
Percival Growth ChamberPercivalAR66LXC9
спектрофотометр NanoDrop 8000 UV-Vis ThermoFisherScientific ND-8000-GLИли эквивалентный спектрофотометр
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit ThermoFisher ScientificP11496
TAE Buffer (Tris-ацетат-EDTA) (50x)Thermo Fisher ScientificB49Разбавить 1/50 водой перед применением (до 1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
Трис-Борат-ЭДТА, 10x Раствор (электрофорез)Thermo Fisher ScientificBP13334Разбавить 1/10 водой перед использованием (до 1x)
Жидкий азотЖидкий азот (-196 &dg; В) представляет опасность замерзания. Он также будет быстро расширяться при нагревании и не должен храниться в плотно закрытой емкости
W29290710708976001

Ссылки

  1. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
  2. Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
  3. Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
  4. Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
  5. Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
  6. Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
  7. Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
  8. Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
  9. Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
  10. Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
  11. Hacquard, S. Advances in Botanical Research. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).
  12. Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
  13. Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).
  14. Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081(2014).
  15. Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
  16. Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
  17. Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
  18. Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
  19. Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
  20. Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf (2016).
  21. Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf (2014).
  22. Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf (2016).
  23. Plant genotyping II: SNP technology. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).
  24. Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
  25. Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
  26. Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).
  27. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
  28. Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470(2014).
  29. Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
  30. User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка ДНК с высоким молекулярным весом геномной от мучнистой росы для Long-Read Sequencing
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.