Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Пометка внеклеточный домен мембранного белка с рН-чувствительного флуорофора, superecliptic pHluorin (SEP), позволяет внутриклеточной локализации, выражение, и незаконный оборот подлежит определению. Визуализации SEP-меченых белков с полным внутренним отражением флуоресцентной микроскопии (TIRFM) позволяет количественно оценить уровни белка в периферической ER и плазматической мембраны.

Abstract

Понимание мембраны незаконный оборот белков, сборка и выражение требует такого подхода, который проводит различие между теми, кто живет в внутриклеточных органелл и те, локализованные на плазматической мембране. Традиционные измерения флуоресценции на основе не имеют способность различать мембранных белков, проживающих в разных органеллах. Режущий край методологии выходят за рамки традиционных методов путем сочетания рН-чувствительных флуорофоров с общей микроскопии внутреннее отражение флуоресценции (TIRFM). TIRF освещение возбуждает образец до примерно 150 нм от поверхности раздела стекла и образца, что приводит к снижению фона, увеличивая отношение сигнала к шуму, и повышение разрешения. Объем возбуждения в TIRFM включает плазматическую мембрану и близлежащие органеллы, такие как периферийное ER. Superecliptic pHluorin (SEP) является рН чувствительной версия GFP. Генетически кодирующий SEP в внеклеточный домен мембранного белка, представляющего интерес позиционирует флуорофор наполостную сторона ER и во внеклеточной области клетки. СВП флуоресцентный при рН больше 6, но остается в выключенном состоянии при более низких значениях рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP флуоресцировать, когда они проживали в эндоплазматический ретикулум (ER) или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда ограничивается везикулы людьми или других органеллах, таких как Гольджи. Внеклеточный рН можно регулировать, чтобы диктовать флуоресценцию рецепторов на плазматической мембране. Различие в флуоресценции между TIRF изображений в нейтральной и кислой внеклеточный рН в той же самой клетке соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной и плазменных мембранных рецепторов резидентов. Одно вставки пузырек события также могут быть измерены, когда внеклеточный рН нейтральна, что соответствует низким везикулы оборота рН сплавленных с плазматической мембраной и перехода в флуоресцентное состояние. Это Versatilе метод может быть использован для изучения локализации, экспрессии и торговлей мембранных белков.

Introduction

Изменения в экспрессии рецепторов, распределения и сборки были связаны с широким спектром заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кистозного фиброза и наркомании ^{1, 2, 3, 4, 5.} Например, никотин и другие никотиновые лиганды влияют на торговлю никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) , что приводит к изменениям в области незаконного оборота, выражения и повышающей регуляцией ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} Никотин увеличивает общее количество собранных nAChRs внутри клетки, повышает оборотом к плазматической мембране, А.Н.d изменяет сборку субъединиц в пользу высокой чувствительности версии некоторых подтипов. Решение различных изменений в области незаконного оборота, собраний и экспрессии рецепторов в модели болезни обеспечивает важные механистические детали, которые необходимы для определения целевых наркотиков. Идеальный подход позволил бы быстро проводить различие между внутриклеточными рецепторами и те, локализованный на плазматической мембране. Это особенно сложно в тех случаях, когда большинство конкретного белка проживает внутриклеточно, например, с помощью nAChRs. Поскольку большинство nAChRs локализованы в эндоплазматической сети, традиционные измерения не имеют пространственно-временное разрешение, необходимое для локализации точно определить и незаконного оборота изменений вдоль секреторного пути. Исследования торговли людьми Рецептор и экспрессия nAChRs были в первую очередь были проведены с использованием связывания радиолиганда ^11, биотинилирования анализы ^12, Вестерн – блоттинга ¹³ или иммунопреципитация Techniq ¹² жает. Это зависит от специфичности связывания с молекулой-репортером или фиксации клеток и не имеют возможности одновременно различать между жителем плазматической мембраны и внутриклеточных рецепторов. Таким образом, исследования сборки ионных каналов и везикул динамика во многом полагались на низкой пропускной способности электрофизиологических методов ^14.

Улучшенный пространственное и временное разрешение можно с прогрессом в области флуоресцентной микроскопии. Генетически кодируемые репортерные молекулы, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариантов, устранить неспецифическое связывание проблем и повышения чувствительности ^15. РН – чувствительного вариант GFP, известный как superecliptic pHluorin (SEP), могут быть использованы , чтобы использовать врожденные различия рН между отсеками внутри ячейки , чтобы определить локализацию ^{5, 7, 8,}Ссылка "> ^{9, 16, 17, 18.} сентября флуоресцирует при рН выше 6, но остается в выключенном состоянии при более низком рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP на их полостной стороне обнаруживаются , когда присутствует в эндоплазматический ретикулум ( ER), или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда прикован к пузырьку оборота. манипуляции с внеклеточным рН в контакте с рецепторами на плазматической мембране, следовательно, приводит к изменению флуоресценции и, следовательно, обнаружение этих рецепторов. Если в той же клетке последовательно изображается как при нейтральном внеклеточного рН , а затем рН ниже 6, разница между изображениями приписывается рецепторы , расположенные на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной (периферический ER) и рецепторов мембранного резидентные плазмы ^{5, 7, 8} </su^{р>, 9.} Single вставки пузырек события также могут быть разрешены, когда внеклеточный рН является нейтральным. После того, как низкий везикул оборот рН сливается с плазматической мембраной, полостную часть везикулы подвергается нейтральной внеклеточный раствор, вызывая переход детектируется как взрыв флуоресценции ^{7, 18, 19, 20.} Сентябрем позволяет измерять рецепторами , локализованными на плазменной мембране и периферической эндоплазматической сети, а также предоставляет средства для измерения оборота рецепторов между этими субклеточных областей ^{5, 7, 18.}

Для достижения более высокого разрешения на мембране, рецептор с SEP генетически закодированы визуализируется с помощью полного внутреннего отражения микроскопии (цветения TIRFM). Этот метод особеннополезно, если большинство рецепторов локализованы в внутриклеточных областей, так как TIRFM увеличивает видимость плазматической мембраны. TIRFM также позволяет разрешение динамики незаконного оборота одиночных везикул, несущих SEP-меченых рецепторов при введении в ПМ. Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела материалов с различными показателями преломления, например, между клеткой и стеклянной крышкой скольжения ^{21, 22.} Сентября флуоресцирует при облучении 488 нм возбуждение, которое ориентировано на достижение полного внутреннего отражения на границе раздела стекла и клеточного раствора. Это производит мимолетную волну, которая проникает примерно 150 нм в образце, только возбуждающих флуорофоров в пределах этого объема. Только Сентябрю рецепторов, содержащих в нейтральной среде рН в указанном диапазоне возбуждения обнаружены, соответствующие тем, которые постоянно находящиеся на плазматической мембране или периферической эндоплазматический ретикулум. Поскольку обнаружение ограничено то возбуждении затухающих волн, фоновой флуоресценции из внутриклеточного области уменьшается , а соотношение сигнал – шум увеличивается ^{21, 22.} Кроме того, поскольку излучение не проникает большую часть клетки, фотоповреждение сведено к минимуму, что позволяет получение изображений живых клеток по сравнению с течением времени. В результате, TIRFM в сочетании с генетически кодируемых Сентябрю обеспечивает высокое разрешение и чувствительность, необходимую для измерения внутриклеточную локализацию и торговлей динамики мембранных рецепторов вдоль секреторного пути.

Protocol

1. Культура клеток и трансфекция Поддержание мыши нейробластомы 2a (n2a) клеток в среде для роста. Сделать 500 мл n2a питательной среды от 200 мл среды Дульбекко Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 250 мл сыворотки снижается носитель, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), и 5 мл пенициллина / стрептомицина (100х). Поддержание клеток в Т75 колбы при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Разделенные клетки 1:15, когда это необходимо, или примерно 80-90% сплошности. Это, как правило, 2-3 раза в неделю. Пальто 35 мм со стеклянным дном блюдо с поли-D-лизина. В кабинете биологической безопасности ламинарного потока, добавляют 200 мкл 0,1 мкг / мл поли-D-лизина на стеклянным дном области стерильного 35 мм блюдо. Поместите блюдо в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа. Тщательно ополосните блюдо с DDH 2 O 3-4 раза. Разрешить блюда полностью высохнуть в течение более 1 ч. SterilИзе блюда с использованием УФ-света в кабинете биологической безопасности в случае необходимости. Пластина клеток n2a для визуализации TIRFM. Удалить питательной среды из прикрепленных клеток. Отделить клеток из колбы путем инкубирования с 1 мл 1х трипсина (+ ЭДТА) в течение 5 мин при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Деактивировать трипсина путем добавления 9 мл среды роста. Смешайте СМИ, трипсин и обособленные клетки с помощью пипетки. Визуально подсчет клеток с использованием гемоцитометра и вычислить правильный том, чтобы добавить 90000 клеток в каждую поли-D-лизин стекла с покрытием нижней тарелки. Эта плотность необходима для эффективной трансфекции и одной ячейки TIRF визуализации. Добавляют 2 мл среды роста для каждого стеклянным дном блюдо с 90000 клеток. Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе в течение 16-24 часов. n2a трансфекция Получают плазмиду, содержащую конструкцию флуорофор SEP включеныво внеклеточную область белка, представляющего интерес. Стандартные методы клонирования , такие как ПЦР – амплификации 5 может быть использован для создания конструкции. Примечание: Сентябрем должны быть включены во внеклеточную область белка мембраны таким образом, что он находится в просвете эндоплазматического ретикулума или торговли везикул и подвергается воздействию внеклеточного раствора, когда на плазматической мембране. СВП аналогичные по размеру и GFP-подобные стратегии клонирования могут быть использованы. Заменить культуральную среду на посеянных клеток с 1,5 мл сыворотки пониженным носителей (например, OPTI-MEM), примерно 30 мин перед добавлением реагента для трансфекции. Примечание: Для изучения наркотиков индуцированных изменений в рецепторах, в соответствующей концентрации лекарственного средства могут быть добавлены во время трансфекции. Добавить 500 нг каждой целевой плазмиды построить к 250 мкл восстановленного сыворотки носителя (трубка 1). Добавляют 2 мкл реагента для трансфекции в отдельную пробирку Containing 250 мкл восстановленного сыворотки сред. Выдержите трубки 2 при комнатной температуре в течение 5 мин. Отношение реагента к трансфекции плазмидной ДНК, должны быть оптимизированы, чтобы выразить каждый белок, представляющий интерес. Комбинат труб 1 и 2, чтобы сделать раствор, содержащий 500 мкл трансфекции реагента и плазмиды смеси. Инкубируют при комнатной температуре в течение 25 мин. Добавляют 500 мкл трансфекция строительные смеси предварительно высевания клеток общим объемом 2 мл на чашку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 24 часов. Через 24 часа снимите смесь для трансфекции и промойте клетки с питательной среды, а затем добавляют 2 мл питательной среды в каждую чашку. Примечание: Если препарат был добавлен в момент трансфекции, он может быть пополнен снова на этом шаге. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 24 часов. Клетки Image 48 ч после трансфекции. 2. Живая съемка Cell на Всего ввнутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) Обработки изображений создана Выполните визуализацию с перевернутой флуоресцентного микроскопа настройка с помощью стадии сканирования , как показано на рисунке 1. Для этого требуется выравнивание DPSS лазерного источника 488 нм, шаговым двигателем для регулировки положения луча 488 нм и высокой числовой апертуры (1,49 NA) 60X или 100X масло погружения объективное. Пропускают лазерный луч через соответствующий фильтр возбуждения (полосовой 488/10 нм). Выравнивание поляризованный лазерный луч через одномодового волокна, соединенного с пусковой установки, установленной на шаговый двигатель. В режиме эпифлуоресцентной, луч возбуждения центрирована в середине задней отверстия объектива. Для достижения TIRF, использовать шаговый двигатель, чтобы перевести сфокусированного лазерного луча через заднюю апертуру объектива, пока критический угол не будет достигнут, и луч больше не передается через образец и вместо того, чтобы полностью отражается от стекла-Целл интерфейс. Захват изображения с помощью EMCCD (512 х 512 пикселей) , управляемый с программным обеспечением визуализации (например , Metamorph) с соответствующим фильтром выбросов , установленный в пути эмиссии (525/50 нм). Приготовьте раствор изображения Приготовьте 200 мл раствора внеклеточный (ECS) путем смешивания 150 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES и 10 мМ глюкозы в DDH 2 O. растворы запаса NaCl, KCl, MgCl 2, и CaCl 2 , могут быть подготовлены заранее , и в сочетании со свежими HEPES и глюкозу в день визуализации. Доводят рН раствора, содержащего 100 мл ECS до рН 7,4. Отрегулировать оставшиеся 100 мл ECS до рН 5,4. Промыть трансфектированных клеток с помощью 2 мл ECS (рН 7,4). Добавляют 2 мл ECS (рН 7,4) до трансфицированных клеток перед тем визуализации. Живая клетка изображений в TIRF Включите всю систему, includinг 488 нм лазер, камера, этап перевода, и программа формирования изображения. Фокус эпифлуоресцентной луч и регулировать мощность около 1 мВт на цели 60X. Добавьте масло к цели и поместить блюдо из трансфицированных клеток на стадии перевода. Закрепите антенну на месте с помощью крепления, чтобы убедиться в его не перемещается по отношению к сцене, так что клетки могут быть отображены несколько раз. В режиме эпифлуоресцентной, фокус микроскопа и найти флуоресцентные, трансфицированные клетки. Клетки будут оставаться сосредоточенными на нескольких фокальных плоскостях. Найдите одиночные, изолированные клетки продолжиться с TIRF. В программе обработки изображений, установить время экспозиции до 200 мс и оптимизировать интенсивность флуоресценции, установив коэффициент усиления EM. Переход лазерный луч в TIRF, переводя луч через цели ступенчато с помощью шагового двигателя. Поскольку критический угол подходов, луч будет заметно переводить через край тарелки, пока не сходится в гое точка полного внутреннего отражения на плоскости образца. Убедитесь в том, что клетки находятся в режиме TIRF, регулируя ручку фокусировки. В TIRF, только одна плоскость клеток может быть сфокусирован (т.е. примерно 150 нм из стекла интерфейса), создавая очень определенное изображение с высоким разрешением плазменной мембраны. Визуализации сентября , чтобы определить внутриклеточную локализацию Найдите здоровые, трансфицированные, единичные клетки в плоскости изображения. Приобретают сфокусированное изображение ячейки при рН 7,4. Сентябре меченый рецепторов на плазматической мембране и эндоплазматической сети должны быть видны. Быстро блокирует лазерный луч от достижения образца, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Запоминание позиции стадии, соответствующие каждой ячейке с помощью программного обеспечения визуализации микроскопа, способного записывать несколько местоположений ху. Повторите шаги 2.4.1-2.4.4 для 20-30 клеток на чашку при использовании программного обеспечения для записи положение каждой ячейки. Мтер все изображения клеток при рН 7,4 собирают вручную удалить раствор рН 7,4 ECS с помощью пипетки. Не прикасайтесь к блюдо, так как это может привести к смещению запоминаемые позиции стадии. Осторожно добавьте 2 мл рН 5,4 ECS на блюдо и подождать 10 минут. В течение этого времени, за исключением ранее полученных изображений. В соответствии с идентичным набором условий, используемых для сбора изображений при рН 7,4, переместить стадию в каждой сохраненной позиции и получить изображение той же самой клетке при рН 5,4. Клетки должны выглядеть менее четкими, поскольку все обнаруженные флуоресценции, происходящих из эндоплазматической сети ограниченного Сентябре меченый рецепторов. Сохранение изображений клеток рН 5,4. Визуализации одиночные вставки пузырек события в живых клетках Заменить роста средств массовой трансфекции клеток с 2 мл рН 7,4 ECS или с L-15 средств массовой информации Лейбовиц. Значение рН Лейбовиц L-15 средств массовой информации представляет собой СО 2 независимыми, что позволяет визуализации иметь место в течение длительного периода времени , если это необходимо. Placе блюдо трансфицированных клеток на стадии микроскопа. Безопасный и фокус одну ячейку в TIRF следующем шаге 2.3 выше. Если есть, установите автофокус поэтому фокус не дрейфовать в течение периода визуализации. Запись серии 1000 кадров, непрерывно захвата изображений с частотой кадров 200 мс. Всплески флуоресценции будет виден в течение этого времени, что соответствует низким везикул оборотом рН сплавленных с плазматической мембраной, подвергая SEP с внеклеточной рН 7,4. Найдите другую одну ячейку и повторите описанные выше действия. При необходимости сброса автофокусировку. 3. Анализ изображений и обработка данных Анализ SEP флуоресценции для определения внутриклеточную локализацию Открыть изображения клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений, таких как Metamorph или ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj). Вычтите фон от обоих рН 5,4 и рН 7,4 с помощью изображений подвижного настройки шара. Использовать порог на основании интенсивности для количественного определения флуоресценции из одной клетки. Вручную выбрать интересующую область вокруг ячейки в рН 7,4 изображения. Измерьте площадь ячейки, средняя интенсивность, и интегральная плотность, используя плагин в ImageJ или с помощью встроенной функции "Измерение" на вкладке Analyze. Повторите шаги 3.1.1-3.1.3 для той же самой клетке при рН 5,4, тщательно регулируя порог на основании интенсивности и области, представляющей интерес таким же образом. После того, как интегральная плотность достигается для изображений клеток в обоих рН 7,4 и 5,4, вычислить плазматическую мембрану интегральной плотности путем вычитания значения рН 5,4 с 7,4 значения рН. Различие соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране в области TIRF возбуждения. В качестве меры торговли, рассчитать относительный процент SEP меченый рецепторов, расположенных на мембране плазмы по сравнению с остальными рецепторами видимых в TIRF excitatiпо объему путем деления плазматическую мембрану интегральной плотности от общей интегральной плотности при рН 7,4, умноженное на 100. Анализ одного везикул вставки события Открыть серию 1000 TIFF изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Вычтите фон от всех кадров с использованием подвижного установки шара. Отрегулируйте цветовой баланс записи максимально интенсивные области, соответствующие везикулы вставки события. Вручную рассчитывать всплески флуоресценции длительностью более 3 кадра (> 600 мс).

Representative Results

Сентябре включение в рецептор обеспечивает прямое обнаружение этого рецептора в живой клетке. В сочетании с TIRFM, это позволяет оценить относительные уровни экспрессии на плазматической мембране и распределение рецепторов в субклеточных местах в области TIRF возбужде?…

Discussion

Чувствительность рН SEP позволяет рецепторы , находящиеся на плазматической мембране , следует отличать от внутриклеточных рецепторов в эндоплазматической сети, и он может быть использован для разрешения вставки событий Рецептор несущих везикулы ^{5, 7,<…}

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25