Методическая статья

Обнаружение Лиганда-активированный G-белками рецепторы интернализации с помощью конфокальной микроскопии

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55514

⸱

9 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает конфокальной микроскопии обнаружения G-белком рецепторов (GPCR) интернализации в клетках млекопитающих. Она включает в себя основную клеточной культуру, трансфекцию, и конфокальную микроскопию процедуру и обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций слитого выразил GPCR.

Аннотация

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) — это метод оптической визуализации для высококонтрастной визуализации. Это мощный подход к визуализации флуоресцентных гибридных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), для определения их экспрессии, локализации и функции. Субклеточная локализация белков-мишеней важна для идентификации, характеризации и функционального анализа. Интернализация является одним из преобладающих механизмов, контролирующих передачу сигналов рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), для обеспечения соответствующих клеточных реакций на стимулы. В данной статье мы описываем экспериментальный метод обнаружения субклеточной локализации и интернализации GPCR в клетках HEK293 с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, этот эксперимент дает некоторые подробности о клеточной культуре и трансфекции. Этот протокол совместим с различными широко доступными флуоресцентными маркерами и применим для визуализации субклеточной локализации большинства белков, а также интернализации GPCR. Этот метод должен позволить исследователям эффективно манипулировать экспрессией гена GPCR в клеточных линиях млекопитающих и должен облегчить исследования субклеточной локализации и интернализации GPCR.

Введение

Клетки обладают грузовой техникой оборота для транспортировки внеклеточного материалы, такой как лиганды, микроорганизмы, питательные вещества, и трансмембранные белки-в клетку для получения информации, энергии и других целей , 1, 2. Это имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, функций тканей и общей выживаемости клеток. Экспрессии на основе клеток флуоресцирующих слитых белков является мощным средством для изучения локализации и интернализации трансмембранных рецепторов, таких как G-белком рецепторов (GPCR), в 3 сигнальных путей.

Экспрессии слиты....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление клеток

  1. восстановление клеток
    1. Передача криоконсервированных клеток почек эмбриона 293 (НЕК293), клетки человека из жидкого азота резервуара до С водяной бане при 37 ° и трясти непрерывно в течение 1 - 2 мин.
    2. Добавляют 10 мл ростовой среды, уравновешенную (среда Игла в модификации Игла (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и 1% пенициллина-стрептомицина раствор) до 10 см культивирования клеток в чашке. Осторожно добавьте размороженные клетки в уравновешенной среду роста.
    3. Инкубируйте клетки в водяной рубашке СО 2 инкубатора при 37 ° C с увлажненной атмосферой , содержащей 95% во....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показан пример конфокальной системы микроскопа. На рисунке 2 представлена экспрессия pEGFP-N1 в клетках НЕК293. Сигнал GFP, был обнаружен в цитоплазме и ядре. Рисунок 3 показывает внутриклеточную локализацию GnRHR из S. арошса в клетках НЕК293, в соответствии с ранее опубликованными результатами 15. Слитый белок с тегом EGFP на С-конце Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) появился зелен.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, представленный здесь, обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций выраженного гибридного белка GPCR в клетках НЕК293. Методика может быть легко адаптирована для многих различных генов и типов клеток, таких как для клеточной локализации и интернализации рецепторов corazonin от тутового шелкопряда в НЕК293 и BMN клеток 16.

Успешное применение этого мощного анализа зависит от неск.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы этой статьи хотели бы поблагодарить профессора Цзяянь Се за техническую помощь и использование оборудования. Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (41406137).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточная линия HEK293 
DMEM/Гиклон с высоким содержанием глюкозыSH30022,01Высокий уровень глюкозы 4,0 мМ L-глютамин
Фетальная сыворотка бычьего скота (FBS)PuFei1101-100
Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)ГеномGNM10010
пенициллин-стрептомицинГеномGNM15140
0,25% трипсин и 0,02% геномЭДТА
Opti-MEM (1x)GIBCO, от Life Technologies31985-062восстановленные сывороточные среды
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииИнвитроген11668027Реагент
1 X-tremeGENE HP ДНК Реагент для трансфекцииRoche6366236001Реагент 2
DAPI Раствор для окрашиванияBeyotimeC1006
DiIBeyotimeC1036
Антивыцветающая монтажная средаBeyotimeP0126
ПараформальдегидSinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)80096618
100 мм клеточная культураCORNING430167
6-луночный планшет ExCell BioCS016-0092
12-луночный планшет ExCell BioCS016-0093
Покровное стеклоNEST801007
предметные стекла микроскопаCitoglas10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 ИнкубаторThermo3111
TCS SP5II лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeica 
GNM252005100001311

Ссылки

  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GPCRHEK293

Похожие статьи