Методическая статья

Обнаружение Лиганда-активированный G-белками рецепторы интернализации с помощью конфокальной микроскопии

DOI:

10.3791/55514

⸱

9 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает конфокальной микроскопии обнаружения G-белком рецепторов (GPCR) интернализации в клетках млекопитающих. Она включает в себя основную клеточной культуру, трансфекцию, и конфокальную микроскопию процедуру и обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций слитого выразил GPCR.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) — это метод оптической визуализации для высококонтрастной визуализации. Это мощный подход к визуализации флуоресцентных гибридных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), для определения их экспрессии, локализации и функции. Субклеточная локализация белков-мишеней важна для идентификации, характеризации и функционального анализа. Интернализация является одним из преобладающих механизмов, контролирующих передачу сигналов рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), для обеспечения соответствующих клеточных реакций на стимулы. В данной статье мы описываем экспериментальный метод обнаружения субклеточной локализации и интернализации GPCR в клетках HEK293 с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, этот эксперимент дает некоторые подробности о клеточной культуре и трансфекции. Этот протокол совместим с различными широко доступными флуоресцентными маркерами и применим для визуализации субклеточной локализации большинства белков, а также интернализации GPCR. Этот метод должен позволить исследователям эффективно манипулировать экспрессией гена GPCR в клеточных линиях млекопитающих и должен облегчить исследования субклеточной локализации и интернализации GPCR.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки обладают грузовой техникой оборота для транспортировки внеклеточного материалы, такой как лиганды, микроорганизмы, питательные вещества, и трансмембранные белки-в клетку для получения информации, энергии и других целей , 1, 2. Это имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, функций тканей и общей выживаемости клеток. Экспрессии на основе клеток флуоресцирующих слитых белков является мощным средством для изучения локализации и интернализации трансмембранных рецепторов, таких как G-белком рецепторов (GPCR), в 3 сигнальных путей.

Экспрессии слитых белков , помеченные с зеленым флуоресцентным белком (GFP) из медузы Aequorea виктория, в сочетании с методами обнаружения прямой флуоресценции, получили широкое признание в белках-ориентации исследования 4, 5, 6. GFP основе detectiот того, имеет то преимущество , что позволяет в режиме реального времени обработки изображений живых клеток, избегая при фиксации артефактов 7. Серия универсальных векторов клонирования была построена , чтобы облегчить экспрессию слитых белков с GFP в различных клетках 8, 9. Вектор pEGFP-N1 является широко используемым и коммерчески плазмидный вектор, кодирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), который был оптимизирован с дикого типа GFP для более яркой флуоресценции и более высокой экспрессии в клетках млекопитающих. Для наблюдения флуоресцентный сигнал EGFP, экспрессированный в клетках млекопитающих, то флуоресцентной микроскопии следует проводить с возбуждением на 488 нм и излучение на 507 нм, предпочтительно с конфокальной микроскопии.

Мониторинг внутриклеточной локализации и лиганд-опосредованная интернализации рецепторов является общим методом для исследования сигнальной трансдукции и функции GPCRs 10 вверх>, 11. В большинстве случаев, приводит к интернализации десенсибилизации из GPCRs (затухание реакции стимула, несмотря на присутствие агонистов) 12, 13. Интернализированные рецепторы могут быть включены в лизосомы и деградируют, или они могут быть переработаны обратно к клеточной поверхности, в зависимости от природы рецепторов и клеточных линий, используемых в экспериментах.

В гонадотропин-рилизинг гормона (рецепторы GnRHRs) принадлежат к семейству GPCR и имеют типичную структуру ХВГФ белка, с внеклеточным аминоокончанию, внутриклеточный -СООН терминала, и семь трансмембранных (ТМ) домены 14. Трансфекция рекомбинантной плазмиды Sj GnRHR-EGFP (с геномом GnRHR от Sepiella арошса) и конфокальная микроскопия Обнаружение EGFP-меченного Sj GnRHR (выраженной в клетках НЕК293) были сообщено Previouхитрое и флуоресценция GFP , была создана в качестве репортера трансмембранного белка локализации анализов 15. Теперь, интернализации Sj GnRHR, активированные С. японика гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ Sj), была продемонстрированы в временных и дозозависимых способах с помощью конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление клеток

  1. восстановление клеток
    1. Передача криоконсервированных клеток почек эмбриона 293 (НЕК293), клетки человека из жидкого азота резервуара до С водяной бане при 37 ° и трясти непрерывно в течение 1 - 2 мин.
    2. Добавляют 10 мл ростовой среды, уравновешенную (среда Игла в модификации Игла (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и 1% пенициллина-стрептомицина раствор) до 10 см культивирования клеток в чашке. Осторожно добавьте размороженные клетки в уравновешенной среду роста.
    3. Инкубируйте клетки в водяной рубашке СО 2 инкубатора при 37 ° C с увлажненной атмосферой , содержащей 95% воздух и 5% СО 2 в течение 2 - 4 ч.
    4. Через 2 - 4 ч, проверьте, что клетки прикреплены. Заменить уравновешенную среду для роста и культуры еще в течение 24 - 48 ч.
      Примечание: Изменение уравновешенной ростовой среды является полезным, поскольку она удаляет диметилсульфоксид (ДМСО) и защищает от повреждения клеток.
  2. <сильный> сотовый канал
    1. Через 24 - 48 ч, когда клетки выросли почти до слияния, отбросить уравновешенной ростовой среды и промыть клетки с 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Вихревой блюдо мягко.
    2. Отменить PBS и добавляют 1 мл трипсин-ЭДТА (физиологический раствор, 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА). Для того, чтобы полностью переварить клетки, вихрем блюдо тщательно и аспирата от раствора трипсина-ЭДТА. Поместите блюдо в 37 ° C водяной рубашкой СО 2 инкубаторе в течение 3 мин.
      Примечание: В течение этого периода, подготовить три новых 10-см блюда культуры клеток и добавляют 10 мл уравновешенной ростовой среды для каждого.
    3. С помощью светового микроскопа, определить, если клетки подняли со дна тарелки. Добавляют 2 мл уравновешенной ростовой среды к блюду. Смешайте с помощью пипетки и немедленно пипетка 0,6 мл клеточной суспензии к каждому из новых блюд. Аккуратно перемешать с помощью пипетки и позволяют клеткам инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2.

2. Посев клеток

  1. Через 24 - 48 ч, когда пассированные клетки выращивали до слияния вблизи, отбросить уравновешенную ростовую среду и промыть клетки с 2 мл PBS. Вихревой блюдо мягко.
  2. Отменить PBS и добавляют 1 мл трипсин-ЭДТА. Для того, чтобы полностью переварить клетки, вихрем блюдо тщательно и аспирата от трипсин-ЭДТА. Поместите блюдо в 37 ° C водяной рубашкой СО 2 инкубаторе в течение 3 мин.
    Примечание: В течение этого периода, подготовить 6-луночного планшета, добавив 2 мл уравновешенной ростовой среды в каждую лунку.
  3. Добавить 1 мл ростовой среды, уравновешенной на блюдо, если под микроскопом, чтобы клетки подняли из дна чаши. Смешайте с помощью пипетки и немедленно пипеткой 0,1 мл суспензии клеток (объем регулируется в зависимости от плотности роста клеток) в каждую лунку подготовленной 6-луночного планшета (клеточно-менее 6-луночный планшет с 2 мл уравновешенной ростовой среды). Аккуратно перемешать с помощью пипетки и позволяют клеткаминкубировать при 37 ° С и 5% СО 2.

3. Cell Трансфекция

  1. Метод Трансфекции 1, с липосомными
    Примечание: Пожалуйста , смотрите таблицу Материалы для трансфекции реагента 1.
    1. На следующий день, убедитесь, что клетки должны быть 85 - 95% сплошности.
    2. Добавьте 3 мкг плазмидной ДНК (500 нг / мкл) и 100 мкл восстановленного сыворотки носителя в стерильной микроцентрифужных пробирку и осторожно перемешать. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Подготовьте 9 мкл реагента 1 и 100 мкл восстановленного сыворотки среды в другую пробирку микроцентрифужных и осторожно перемешать. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Смешайте разбавленный плазмиду смеси разбавленным реагентом 1 (общий объем = 215 мкл). Осторожно перемешать и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Аспирируйте среды от клеток-культивированных пластин, и добавляют 1,5 мл свежей DMEM без FBS.
    6. Добавить 215 мкл ДНК-элеменСмесь прогиба реагента к каждой капле скважины, и осторожно перемешать с помощью закрученной пластины.
    7. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 4 - 8 часов. Заменить со свежей DMEM с 10% FBS.
    8. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение еще 24 - 48 ч перед запуском каких - либо экспериментов.
  2. Метод Трансфекции 2, с липосомными
    Примечание: Пожалуйста , смотрите таблицу Материалы для трансфекции реагента 2.
    1. Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (500 нг / мкл), 4 мкл реагента 2, и 100 мкл сыворотки уменьшенные носителя в стерильной микроцентрифужных трубки. Осторожно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
    2. Добавьте смесь трансфекции в клетки по каплям.
    3. После трансфекции клетки инкубируют в течение 24 - 48 ч при 37 ° С и 5% CO 2, перед запуском каких - либо экспериментов.

4. Культура клеток на покровных стеклах

  1. репереместить ростовую среду из культуры 6-луночного планшета.
  2. Промыть монослой клеток с 1 мл PBS без кальция и магния.
  3. Добавить 0,5 мл трипсин-ЭДТА. Вихревой блюдо тщательно и аспирата от трипсин-ЭДТА. Инкубируйте культуры пластины в течение 3 мин при 37 ° С и 5% CO 2. Фактическое время инкубации изменяется в зависимости от клеточной линии, используемой.
    Примечание: В течение этого периода, подготовить новую пластину 12-луночного и добавить диаметр 15 мм стерильной крышкой скользит в каждую лунку. Покровные стекла с покрытием лизина, ламининым, коллагеном или могут улучшить прикрепление клеток для клеток НЕК293, которые легко отделяются.
  4. Когда клетки отделяют, добавляют 1 мл подогретого полной среды роста в каждую лунку. Смешайте с помощью пипетки и немедленно передать необходимое количество клеток на 12-луночный планшет с покровных стеклах. Добавить свежую полную ростовую среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1 мл
  5. Инкубируйте клетки в течение 16 - 24 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    Примечание: После того, как 30 -60 мин, большинство клеток будут приклеены к стерильным покровным стеклам.

5. Обнаружение конфокальной микроскопии

  1. Клеточная локализация
    1. Через 16 - 24 ч, когда клетки выросли почти до слияния на стерильных покровных стеклах в 12-луночный планшет, добавьте мембранный зонд, DII, в каждую лунку, давая конечную концентрацию 5 мкМ. Разрешить клетки инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С и 5% CO 2.
    2. Через 30 мин, удалить уравновешенную ростовую среду и промыть клетки дважды в холодном PBS (2 - 8 ° C).
    3. Закрепить клеток путем добавления 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно перемешивать в течение 15 мин.
      Внимание: параформальдегид умеренно токсичен при контакте с кожей или ингаляции, и обозначен как вероятный человеческий канцероген. Химикаты вытяжных шкафов, вентилируемые шкафы баланса или другие защитные меры должны использоваться во время взвешивания и обработки параформальдегида.
    4. Вымойте фиксированные клетки дважды в PBS. Добавить 200-300 мкл DAPI (4' , 6-диамидино-2-фенилиндола) в растворе (0,5 мкг / мл) в каждую лунку и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Вымойте клетки дважды с PBS. Осторожно снимите крышку ускользает из пластины и фитиль излишки PBS. Инверсия на предметные стекла микроскопа с грузом одной каплей монтажа среды (50% об / об глицерин / вода). Удалите излишки монтажной среды из слайдов.
  2. Клеточная интернализации
    1. Через 16 - 24 ч, когда клетки выросли почти до слияния на стерильных покровных стеклах в 12-луночный планшет, удалить уравновешенную среду для роста и добавить свежий, нагревают среду DMEM (37 ° C). Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
    2. Treat клеток с различными концентрациями (0, 10 -12, 10 -9 и 10 -6 М) лиганда в течение 30 мин и относиться к ним с 10 -6 М лиганда в течение различного времени (0,10, 30 и 60 мин).
    3. Промывают клетки дважды в холодном PBS (2 - 8 ° C). Закрепить клеток путем добавления 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно перемешивать в течение 15 мин.
    4. Вымойте клетки дважды в PBS. Осторожно снимите крышку ускользает из пластины и фитиль лишнюю PBS. Инверсия на предметные стекла микроскопа с грузом одной каплей монтажа среды (50% об / об глицерин / вода). Удалите излишки монтажной среды из слайдов.
  3. конфокальной микроскопии
    1. Включите на оборудовании конфокальной микроскопии, в том числе мощности ртутной лампы, PC микроскоп, сканер, и лазер. Вход в личный кабинет операционной системы, запустите программу, проверьте конфигурацию и выбрать лазер. Включите различные единица конфокальной микроскопии системы в порядке, в соответствии с инструкциями.
    2. Поместите подготовленные слайды на столике микроскопа. Поместите образец над линзой объектива, используя контроллер стадии. Добавьте одну каплю кедрового масла начтобы покровные при выборе масла погружения линзы. Поместите крышку скользит на салазках, стоящих перед объективом.
    3. Найти клетки, представляющие интерес при люминесцентной микроскопии.
    4. Переключение в режим сканирования. Выберите мощность лазера и спектральный диапазон флуорофоры излучения. Захват высокого качества конфокального изображения от интенсивности настройки лазерного излучения и других параметров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан пример конфокальной системы микроскопа. На рисунке 2 представлена экспрессия pEGFP-N1 в клетках НЕК293. Сигнал GFP, был обнаружен в цитоплазме и ядре. Рисунок 3 показывает внутриклеточную локализацию GnRHR из S. арошса в клетках НЕК293, в соответствии с ранее опубликованными результатами 15. Слитый белок с тегом EGFP на С-конце Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) появился зелен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций выраженного гибридного белка GPCR в клетках НЕК293. Методика может быть легко адаптирована для многих различных генов и типов клеток, таких как для клеточной локализации и интернализации рецепторов corazonin от тутового шелкопряда в НЕК293 и BMN клеток 16.

Успешное применение этого мощного анализа зависит от неск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы этой статьи хотели бы поблагодарить профессора Цзяянь Се за техническую помощь и использование оборудования. Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (41406137).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточная линия HEK293 
DMEM/Гиклон с высоким содержанием глюкозыSH30022,01Высокий уровень глюкозы 4,0 мМ L-глютамин
Фетальная сыворотка бычьего скота (FBS)PuFei1101-100
Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)ГеномGNM10010
пенициллин-стрептомицинГеномGNM15140
0,25% трипсин и 0,02% геномЭДТА
Opti-MEM (1x)GIBCO, от Life Technologies31985-062восстановленные сывороточные среды
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекцииИнвитроген11668027Реагент
1 X-tremeGENE HP ДНК Реагент для трансфекцииRoche6366236001Реагент 2
DAPI Раствор для окрашиванияBeyotimeC1006
DiIBeyotimeC1036
Антивыцветающая монтажная средаBeyotimeP0126
ПараформальдегидSinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)80096618
100 мм клеточная культураCORNING430167
6-луночный планшет ExCell BioCS016-0092
12-луночный планшет ExCell BioCS016-0093
Покровное стеклоNEST801007
предметные стекла микроскопаCitoglas10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 ИнкубаторThermo3111
TCS SP5II лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeica 
GNM252005100001311

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
  4. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
  5. Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
  6. Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
  7. von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
  8. Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
  9. Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
  10. Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
  11. Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
  12. Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
  13. Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
  14. Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
  15. Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
  16. Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
  17. Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GPCRHEK293

Похожие статьи