Мы опишем простой способ выделения промытых тромбоцитов из человеческой крови с последующим агонист-индуцированной агрегацией тромбоцитов измерений по турбидиметрии. В качестве примера можно применить этот метод для изучения реакции агрегации тромбоцитов человека к коллагену после предварительной инкубации с ингибитором канала Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Турбидиметрия на человеке промытых тромбоциты: Влияние Pannexin1-ингибитор Brilliant Blue FCF на индуцированный коллаген агрегации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Турбидиметрия является лабораторная методика, которая применяется для измерения агрегацию тромбоцитов, взвешенных в плазме (либо обогащенной тромбоцитами плазмы, PRP) или в буфере (промытых тромбоцитов), с использованием одного или комбинации агонистов. Использование промытых тромбоцитов, выделенные из плазмы их среды и в отсутствии антикоагулянтов позволяет изучать внутренние свойства тромбоцитов. Среди большой панели агонистов, арахидоновых кислот (АА), аденозин-ди-фосфат (АДФ), тромбин и коллаген является наиболее часто используемым. Реакция агрегации количественно путем измерения относительной оптической плотности (OD) с течением времени суспензии тромбоцитов при непрерывном перемешивании. Тромбоциты в гомогенной суспензии ограничивают прохождение света после добавления агониста, тромбоциты происходит изменение формы производить небольшое преходящее увеличение OD. После этой начальной стадии активации, тромбоциты сгустки образуют постепенно, позволяя прохождение света через суспензию в качестве Резаии уменьшенного OD. Процесс агрегации, в конечном счете, выраженное в процентах, по сравнению с наружным диаметром обедненной тромбоцитами плазмы или буфера. Строгие калибровки Таким образом, важны в начале каждого эксперимента. Как общее правило: калибровка до 0% устанавливается путем измерения ОП не-стимулированных суспензии тромбоцитов при измерении оптической плотности суспензии среде, не содержащей тромбоциты представляет значение 100%. агрегации тромбоцитов, как правило, визуализируются в виде кривой агрегации в режиме реального времени. Турбидиметрия является одним из наиболее часто используемых лабораторных методов для исследования функции тромбоцитов и рассматриваются как исторический золотой стандарт и используются для разработки новых фармацевтических средств, направленных на ингибировании агрегации тромбоцитов. Здесь мы описываем подробные протоколы для 1) подготовки человека промывают тромбоциты и 2) турбидиметрический анализ индуцированного коллагена агрегации тромбоцитов человека промытого предварительно обработанные с пищевым красителем Brilliant Blue FCF, который был недавно IDENtified в качестве ингибитора (Panx1) каналов Pannexin1.
Введение
Тромбоциты являются важнейшими компонентами крови и их основной функции тусовки с коагуляцией факторами, чтобы остановить кровотечение после травмы кровеносных сосудов. Тромбоциты представляют собой небольшие фрагменты (2-3 мкм) безьядерные , полученные из мегакариоцитов костного мозга 1. Тромбоциты циркулируют в неактивированном состоянии, в течение которого они появляются в виде линзовидных структур. После перерыва в эндотелии, тромбоциты собираются в месте повреждения кровеносного сосуда, чтобы заткнуть дыру, процесс, называемый первичный гемостаз. Первоначально, тромбоциты прикрепляются к югу от эндотелиальной молекул, таких как коллаген и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Пять неродственных здоровых добровольцев были набраны для забора крови для выделения тромбоцитов и агрегации тестов. Письменное информированное согласие было получено, и протокол был утвержден Центральный комитет по этике из Женевского университета Больницы мимо. Все добровольцы сертифицирован, чтобы быть здоровыми и не принимали никаких пластинчатых мешая препараты в течение по крайней мере 10 дней, предшествующих эксперименты.
1. Буфер Подготовка к коллекции крови человека и Промывают тромбоциты Изоляция
- Приготовьте водный раствор 100 мл кислоты-цитрат-декстроза (ACD) путем растворения моногидрата 1,4 г лимонной кислоты (С
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Программное обеспечение агрегометра автоматически производит кривые агрегации и дает значение для максимальной агрегации в процентах. Значения могут быть скопированы на программное обеспечение для анализа данных для выполнения статистического анализа и визуализации максимальных значений агрегации в виде гистограммы. По желанию, каждая отдельная точка кривых агрегации может быть экспортирована последовательно в программное обеспечение электронной таблицы , а затем статистическое программн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует большой интерес к поиску новых препаратов, способных модулировать функцию тромбоцитов, чтобы предотвратить тромбоз не увеличивая риск кровотечения. Для этой цели в пробирке лабораторные тесты , которые могут надежно и воспроизводимо контролировать реакцию агрегации в тромбоцитах человека абсолютно необходимы. Турбидиметрический агрегометрия является простым методом для выполнения. Тем не менее, некоторые меры предосторожности необходимо иметь в виду. Измерения должны быть выполнены при непрерывном пе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Швейцарского Национального научного фонда (310030_162579 / 1 к Бренда Рената Квак и 320030_144150 Пирр Фонтана), а также за счет гранта Швейцарского фонда сердца.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| моногидрат лимонной кислоты (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | опасность повреждения/раздражения глаз |
| дигидрат тритритри>цитрата дигидрат (NaC6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804-D | |
| (+)-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270-Sodium | |
| хлорид (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-Potassium | |
| chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-Бикарбонат | |
| натрия (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Моногидрат дигидрогенофосфата натрия (2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638-Магния | |
| хлорид гексагидрат (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272-Кальция | |
| хлорид гексагидрат (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | опасности повреждения/раздражения глаз |
| N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630-сывороточный | |
| альбумин человека | CSL Behring | 00257/374-соляная | |
| кислота | Sigma-Aldrich | 320331 | едкое и раздражающее для дыхательной системы. Может вызвать серьезные повреждения кожи и глаз. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| гепарин | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| простациклин I2 (PGI2) | Cayman | 18220-апираза | |
| из картофеля | Sigma-Aldrich | A6535-фибриноген | |
| (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS | |
| 73466011-тромбо-агрегатометр SD-Medical | SD-Innovation | TA8V-Brilliant | |
| blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Вреден для водной флоры и фауны с длительными эффектами (Избегайте выброса в окружающую среду) |
| коллаген | Horm, Никомед-арахидоновая | ||
| кислота | Bio/Data Corporation | C/N | |
| 101297-клеточный счетчик Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056-стеклянные | |
| кюветы | SD-Innovation | THCV1000-магнитные | |
| мешалки | SD-Innovation | THA100 | - |
Ссылки
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
