Методическая статья

In Vitro визуализации и количественному Таргетинг эффективности наркоконтроля флуоресцентно меченных ГнРГ Аналогов

DOI:

10.3791/55529

⸱

21 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Избирательно меченый флуоресцентной GnRH-I, -II и -III производные являются надежные инструменты для отслеживания и количественной оценки их клеточного поглощения. Эта рукопись представляет эксперименты для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения этих ГнРГ конъюгатов в различных клеточных линиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

аналоги ГнРГ являются эффективными и Целевые фрагменты способны доставить противораковые агенты избирательно в злокачественные опухоли клетки, которые высоко выражают рецепторы ГнРГ. Тем не менее, количественный анализ клеточного поглощения аналогов GnRH 'и исследуемые типы клеток в ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств в настоящее время ограничены. Ранее введены, селективно помечены флуоресцентной ГнРГ I, -II и -III производные обеспечивают высокую выявляемость, и у них есть подходящие химические свойства для воспроизводимых и надежных экспериментов. Мы также обнаружили, что соответствующие методы уточненный с этими мечеными аналогами ГнРГ может предложить новую информацию о ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств. Эта рукопись вводит некоторые простые и быстрые эксперименты относительно клеточному поглощению [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II и [Lys 8 (FITC)] - ГнРГ -III на EBC-1 (легкие), то BxPC-3 (поджелудочная железа) и на Detroit-562- (зева) злокачественная тumor клетки. Параллельно с этим ГнРГ-FITC конъюгатов, уровень поверхности клеток рецепторов GnRH-I также исследовали на этих клеточных линиях до и после лечения ГнРГ с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов количественно оценивали с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток. В этих экспериментах наблюдалось незначительные различия между ГнРГ аналогов и основных различий между типами клеток. Значительные различия между клеточных линий коррелируют с их отчетливым уровнем рецепторов клеточной поверхности, GnRH-I. Введенные эксперименты содержат практические методы для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения ГнРГ-FITC конъюгатов в времени и зависимости от концентрации на различных культур прикрепленных клеток. Эти результаты могут предсказать наркотиков ориентации эффективность ГнРГ конъюгатов по данной культуре клеток, и предлагают хорошую основу для дальнейших экспериментов в изучении ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевые системы доставки лекарственных средств на основе пептидов стали быстро развивающееся и перспективное направление в терапии рака в течение последних нескольких лет 1, 2. Человеческий гонадотропин тип высвобождения гормона рецептор I (ГнРГ-IR) в основном находится в гипофизе , но также присутствует в ряде других тканей , которые ответственны за самовоспроизводства 3. ГнРГ-IR также выражается в ряде раковых тканей, связанные или не связанные с репродуктивной системой 4, 5. Высокая экспрессия GnRH-IR на нескольких злокачественных опухолевых клеток по сравнению со здоровыми тканями дает возможность для целенаправленной терапии 5, 6.

Многие гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) аналоги были разработаны в течение последних нескольких десятилетий, которые могут быть использованы в качестве ориентации фрагментове "> 7, 8, 9. Эти пептиды способны доставить противораковые агенты с высокой селективностью в злокачественные опухолевые клетки , которые сверхэкспрессии GnRH-IR 6. Несколько ГнРГ конъюгированных противоопухолевых препаратов с более высокой селективностью и лучшей эффективностью , чем соответствующий неконъюгированный свободное лекарственное средство было зарегистрировано 7, 8, 9.

Предыдущие публикации о пептидов ГнРГ и их рецепторов сообщили , что ГнРГ-IR может принимать различные конформации , которые имеют различную селективность в отношении GnRH аналогов 10. Сильно варьирует GnRH-IR имеет сложные и различные сигнальные пути , наделены различной активностью в отношении их естественных и искусственных лигандов 11. Эти факты делают исследование систем ГнРГ на основе сложной. С другой стороны, у обладают многообещающим терапевтическим потенциалом. Несколько экспериментов с радиоактивно меченных пептидов ГнРГ ранее сообщалось о 12, 13, 14, 15, но эксперименты , в которых были использованы флуоресцентно меченных аналогов GnRH все еще ограничены. В то время как радиоактивное мечение обладает высокой чувствительностью, флуоресцентное мечение имеет ряд других преимуществ, например, более легкое обращение с ними, а также возможность контрастирующая с различными флуорофоров. Существует три основных аналогов GnRH , которые были успешно использованы для доставки лекарственных средств являются [D-Lys 6] -GnRH-я, [D-Lys 6] -GnRH-II и III-ГнРГ, однако эффективность этих пептидов в качестве целевые фрагменты , является редко по сравнению 16, 17. С другой стороны, результаты отдельных экспериментов, в которых использовались различные раковые клетки и аналоги ГнРГ разнообразен.

ntent "> Исходя из этих соображений, мы сосредоточились на опухоль ориентации и доставки лекарственного потенциала этих ГнРГ пептидов, и , таким образом , синтезированы и охарактеризованы в [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II и в работе [Lys 8 (FITC)] - ГнРГ-III пептидных конъюгатов 18 Эти аналоги селективно меченных FITC на боковой цепи их Lys или D-Lys (отношение пептид-FITC 1: 1 в каждой из них . сопряженная). идея заключалась в том, что селективная флуоресцентная маркировка может предложить новую информацию об этих пептидов, а также позволяет их хорошей отслеживания и надежной количественной оценки. Эти конъюгаты имеют безопасное обращение и надежную выявляемость, которые делают его более легким, чтобы сравнить их эффективность ориентации опухоли, и скрининг многочисленных типов клеток злокачественных опухолей. Мы надеемся, что до-на сегодняшний день экспериментов с этими пептидных конъюгатов могут внести вклад в развитие нового рака ориентации конъюгаты GnRH-наркотиков, а также помочь идентифицировать новые терапевтические смолыполучает также.

Настоящая рукопись демонстрирует некоторые хорошо воспроизводимые и быстрые эксперименты с ГнРГ-FITC конъюгатов. Экспрессия на поверхности клеток GnRH-R является определяющим состояние относительно поглощения ГнРГ, поэтому мы одновременно исследовали уровень клеточной поверхности GnRH-IR на тестируемых клеточных линиях. Мы визуализировали ГнРГ-IR и ГнРГ-FITC конъюгаты с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и количественно оценивали клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение клеточных культур и реактивов

  1. Поддерживать клеточные культуры в рекомендуемой среде изготовителя, с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и антибиотики (так называемый полная среда). Хранить культивирования клеток колбу в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы при температуре 37 ° C. Следуйте пролиферацию и слитности клеток с помощью инвертированного микроскопа (с использованием 10X контрастности цели фазы).
  2. Когда клетки достигают достаточного слитности, удалить среды и промыть культуру с 2-3 мл, стерильный фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Удалите PBS и добавляют 0,5 мл, стерильный 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в культуре клеток и инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяться (примерно 10 мин).
  3. Суспендирования клеток в 3-4 мл стерильной полной среде, чтобы остановить трипсина и передавать их в стерильную пробирку центрифуги. Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 4 мин при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант тщательно и приостановить рellet в 2-3 мл стерильной полной среде.
  4. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и смешать с 100 мкл 0,4% (м / V) трипанового синий раствор, чтобы посрамить мертвые клетки. Нагрузка 10 мкл этой смеси в гемоцитометра и определить количество жизнеспособных клеток с помощью инвертированного микроскопа.
  5. Развести необходимое количество суспензии клеток , приготовленной на стадии 1.3 до 10 мл стерильной полной среде, содержащей 4 х 10 4 штук / мл.
  6. Добавить 250 мкл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (10 4 клеток / лунку) на семь скважин первого стеклянным дном 8-хорошо микроскопический слайд. Используйте этот слайд в методе поглощения ГнРГ.
  7. Добавить 250 мкл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (10 4 клеток / лунку) на пять лунок второй 8-луночного предметное стекло. Этот слайд будет использоваться в способе экспрессии ГнРГ-IR.
  8. Добавить 1 мл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (4 × 10 4 клеток / лунку) в семь достLs из 12-луночного планшета. Эта пластина будет использоваться в способе количественного определения ГнРГ.
  9. Пусть клетки прилипать на двух микроскопических слайдов и пластины. Выдержите их в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 48 ч.
  10. После инкубации проверьте клеток с помощью инвертированного микроскопа (с использованием 10X контрастной цели фазы). Если клетки здоровы и связаны, по-прежнему со следующими шагами.
  11. Готовят 10 мМ ГнРГ-FITC исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) от каждого из трех конъюгатов 18. (Используйте эти концентрации разведения: 16,43 мкг / мкл [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 мкг / мкл [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II и 16,47 мкг / мкл [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Держите эти растворы в темном месте при комнатной температуре и использовать их в течение нескольких недель.
  12. Развести 1,7 мкл каждого из трех 10 мМ маточных растворов ГнРГ-FITC в 1,7 мл полной среды. Встряска эти решения. (Thesе являются 10 мкМ ГнРГ-ФИТЦ обработки носителя.) Развести 150 мкл каждого из трех 10 мкМ ГнРГ-FITC обрабатывающей среды в 1,35 мл полной среды. Встряска эти решения, а также (это 1 мкМ GnRH-FITC обработки среды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все GnRH-FITC, содержащий среду для обработки должны быть защищены от света и использовать в течение нескольких часов.
  13. Предварительно подогревают шесть GnRH-FITC обрабатывающей среды (полученного на стадии 1.12) и 4 мл полной среды до 37 ° С.
  14. Развести 3 мкл 5 мМ раствора флуоресцентного зонда (ядерный контрастное, упомянутых в перечне материалов) в 3 мл PBS до 5 мкм. Это решение должно быть защищено от света, держать его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов.

2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM)

  1. ГнРГ поглощение методом
    1. Возьмите первый микроскопический препарат, полученный на стадии 1.6, и пипеткой из полной среды из каждого из семи скважин. Добавьте 250 мкл предварительно нагретую полного Mediит в первую лунку. Используйте это в качестве отрицательного контроля. Добавьте 250 мкл в предварительно нагретый GnRH-FITC лечащему носитель (от 1.13) к каждому из следующих шести лунок (3 скважины с 1 мкМ и 3 с 10 мкМ). Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 часов.
    2. Пипетировать из среды из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл раствора (фиксирующим 10% нейтральный забуференный формалин) в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Пипетировать из Фиксирующий раствор из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл PBS, содержащего 5 мкМ раствора флуоресцентного зонда, полученного на шаге 1.14 в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. Пипетировать из раствора флуоресцентного зонда из каждой лунки, и промыть клетки дважды 250 мкл PBS осторожно. Добавьте 3-4 капли монтажной среды в каждую лунку, в конце концов. Держите слайд в темноте при комнатной температуре, до получения изображения.
  2. Метод экспрессии GnRH-ИК
    1. Возьмем второй 8-луночного микроскопический препарат, полученный на стадии 1.7, и пипеткой из полной среды из каждой из пяти скважин.
    2. Добавить 250 мкл предварительно разогретой полной среды в первую лунку, использовать это в качестве отрицательного контроля. Добавить 250 мкл предварительно разогретой полной среды во вторую скважину тоже, и использовать эту возможность для изучения экспрессии GnRH-IR до лечения ГнРГ.
    3. Добавьте 250 мкл каждого из трех предварительно нагретый 10 мкМ ГнРГ-FITC лечащих сред в последующие три лунки. Используйте эти скважины для предварительной обработки клеток с ГнРГ-FITC конъюгатов, прежде чем рассматривать выражение GnRH-IR. Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
    4. Пипетировать из обрабатывающей среды из каждой из трех скважин, которые будут использованы для изучения ГнРГ-IR выражение после обработки ГнРГ и мыть эти лунки 250 мкл предварительно нагретую полной среды. Добавить 250мкл предварительно нагретую полной среды в каждой из трех лунок. Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
    5. Пипетировать из среды от каждого из пяти лунок и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл фиксируя раствора в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
    6. Пипетировать из Фиксирующий раствор из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавьте 250 мкл PBS, содержащего 5% сыворотки бычьего альбумина (БСА) блокирующего раствора в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 1 ч.
    7. Развести 10 мкл GnRH-ИК первичного антитела в 1 мл PBS (соотношение 1: 100). Держите его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов.
    8. Пипетировать из блокирующего раствора БСА из каждой лунки, кроме отрицательного контроля (первая скважина). Вымойте клеток с 250 мкл PBS (за исключением отрицательного контроля). Добавить 250 мкл PBS, содержащий GnRH-ИК первичного антитела, полученного на стадии 2.2.7 в EACч хорошо (за исключением отрицательного контроля). Выдержите слайд при комнатной температуре, в течение 1 ч в темном месте.
    9. Развести 2,5 мкл Alexa 546 меченых вторичных антител в 1,25 мл PBS (соотношение 1: 500).
      Примечание: Это решение должно быть защищено от света, держать его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов.
    10. Пипетировать из решения от каждой из пяти лунок и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавьте 250 мкл PBS, содержащих AF 546 меченого вторичного антитела, полученного на стадии 2.2.9 в каждую лунку. Выдержите слайд при комнатной температуре, в течение 1 ч в темноте.
    11. Пипетировать из раствора из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл PBS, содержащего 5 мкМ раствора флуоресцентного зонда, полученного на шаге 1.14 в каждую лунку и инкубировать слайд в течение 10 мин, при комнатной температуре.
    12. Пипетировать из раствора флуоресцентного зонда из каждой лунки и промыть клетки дважды 250 мкл PBS осторожно. Добавьте 3-4 капли монтажными среды в каждую лунку, после этого. Держите слайд в темноне при комнатной температуре до микроскопических изображений.
  3. обработки изображений
    1. Изображение клетки по перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (с использованием 63x цель нефти погружения)
      1. Используйте следующие длины волн возбуждения / излучения. ГнРГ конъюгаты: 488/514 нм, Alexa 546 меченые антитела,: 488/546 нм (использование только для метода экспрессии GnRH-IR), Draq5 флуоресцентного зонда: 633/680 нм.
      2. Настройка параметров изображения с использованием отрицательных клеток контроля. Используйте эти параметры для изображения клеток , обработанных (рисунок 3). Заново отрегулировать параметры изображения на каждом предметное стекло в начале анализа. Тонкая настройка и экспортировать изображения с программным обеспечением, предоставленным производителем, если это необходимо.

3. флуоресценция активированных сортировки клеток (FACS)

  1. Метод количественного определения ГнРГ
    1. Возьмите тарелку, полученного на стадии 1.8 и пипеткой из полной среды от еач из семи скважин. Добавить 1 мл предварительно разогретой полной среды в первую лунку. Используйте это в качестве отрицательного контроля. Добавить 1 мл каждого из шести предварительно нагретую обработки медиа (3 скважины с 1 мкМ и 3-х скважин с 10 мкМ) в течение следующих шести скважин. Инкубируйте планшет в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 часов.
    2. Пипетировать из среды из каждой лунки. Промыть клетки дважды с 2 мл PBS тщательно. Добавьте 500 мкл раствора трипсин-ЭДТА в каждый лунки. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяться (примерно 10 мин).
    3. Добавляют 1 мл полной среды в каждую лунку, чтобы остановить трипсина. Встряхнуть тарелку. Суспендирования клеток осторожно пипеткой, и передать приостановку из каждой лунки в FACS труб. Центрифуга трубки при 150 х г в течение 4 мин, при температуре 4 ° С.
    4. Вылейте супернатанты осторожно, одним движением. Добавить 500 мкл охлажденного льдом PBS в каждую пробирку FACS и осторожно повторно приостанавливать клетки. Хранить трубы на льду до концаПостановка эксперимента.
  2. Анализ и расчет
    1. Анализ клеток методом проточной цитометрии. Для возбуждения используют 488 нм аргонового лазера и длину волны для обнаружения используют 530 нм. Настройка параметров потока цитометра, запустив отрицательные контрольные клетки. Используйте эти параметры для анализа обработанных клеток (рис 4а). Оценка данных с помощью программного обеспечения производителя, определить средний показатель интенсивности флуоресценции значений (MFI), и вычислить относительные значения MFI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) предлагают захватывающую информацию о поглощении GnRH-FITC конъюгатов на данной клеточной культуре в то время и в зависимости от концентрации. Параллельно с этим ГнРГ-ФИТЦ конъюгаты, присутствие GnRH-IR на поверхности клеток также перепроверить эксперимента CLSM. Кроме того, при использовании дальнего красного окрашивания ДНК флуоресцентного зонда, можно контрастное ядрах клеток, к тому же ГнРГ и GnRH-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты, описанные здесь используют селективно меченых аналогов ГнРГ для скрининга приверженца культуры клеток в пробирке. Конфокальной микроскопией и проточной цитометрии методы пригодны для отслеживания и количественной оценки клеточное поглощение этих ГнРГ-ФИТЦ конъюгаты в то время, и зависимым от концентрации образом. Эти эксперименты имеют следующие важные шаги: 1) поддерживать стерильную, здоровую клеточную культуру; 2) ГнРГ пептиды должны быть высокого качества; 3) разумные концентрации и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проект поддержан Национальным исследовательским фондом ОТКА (К 104045).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EBC-1JCRB Cell BankJCRB0820плоскоклеточный рак легкого
человека BxPC-3ATCCCRL-1687Аденокарцинома поджелудочной железы человека
Detroit-562ATCCCCL-138Карцинома глотки человека
RPMI-1640 Среда с L-глутаминомLonzaBE12-702FПитательная среда для клеток BxPC-3
Eagle's Minimum Essential СредаLonzaBE12-611FПитательная среда для клеток EBC-1, дополненная 0,1% пируватом натрия для клеток Detroit-562
Фетальная бычья сывороткаEuro CloneECS0180LДополняет питательную среду
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012Дополняет питательную среду (антибиотики)
Стандартные колбы для клеточных культурVWR10062-872Обеспечивают стабильную, стерильную среду для роста клеток
Смесь трипсина-ЭДТА LonzaBE17-161EУдалить прикрепленные клетки
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)LonzaBE17-516FРастворитель
диметилсульфоксидSigma-AldrichD8418-100MLрастворитель
трипана синего цвета, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Используется для подсчета клеток
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-Iсделано нами- Чистота и ге; 98% (ВЭЖХ)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-IIпроизводстваus-Purity ≥ 98% (ВЭЖХ)
[Lys8(FITC)]-GnRH-IIIпроизводстваus-Purity ≥ 98% (ВЭЖХ)
стеклянное дно 8-луночный микроскопический предметный стекалIbidi80826Использование в эксперименте CLSM
Планшет для культивирования клеток Corning Costar, 12 лунокSigma-AldrichCLS3513-50EAИспользование в эксперименте FACS
Фиксирующий раствор (10% нейтральный буферизованный формалин)Bio-Optica01V60PФикс адгезивных клеток
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA7906-10GПредотвратить неспецифическое связывание антител
GnRHR AntibodyProteintech19950-1-APИммуноцитохимический реагент, связывающийся с рецепторами ГнРГ типа I человека
Вторичное антитело, конъюгат Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA11035, связываться с первичным антителом
Раствор флуоресцентного зонда (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254Противоокрашенные ядра
Флюоромонт Водный монтажный медиумSigma-AldrichF4680-25MLИспользование в эксперименте CLSM, сохранение флуоресценции
Инвертированный микроскопЭлектро-Оптика ООО Alpha XDS-2TПроверка фенотипа и слияния клеточных культур
Инвертированный конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissLSM-710Использование в эксперименте
CLSM Проточный цитометрBD BiosciencesBD FACSCaliburИспользование в эксперименте FACS
Иммуноцитохимический реагент

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

Похожие статьи