Method Article

Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

DOI:

10.3791/55533

⸱

May 1st, 2017

 , 
1Laboratory of Epidemiology and Population Science, National Institute on Aging, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточное старение, необратимое состояние остановки клеточного цикла, может быть вызвано различными клеточными напряжениями. Здесь мы описываем протоколы для индукции клеточного старения и методов оценки маркеров старения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ответ на клеточный стресс или повреждения, пролиферирующие клетки могут вызвать определенную программу, которая инициирует состояние долгосрочной остановки клеточного цикла, называемую клеточным старение. Накопление стареющих клеток происходит с организменном старения и за счет непрерывного культивирования в пробирке. Стареющие клетки влияют на многие биологические процессы, в том числе эмбрионального развития, ремонта и регенерации тканей, подавление опухоли, и старение. Клейма стареющие клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, увеличилась Старение-ассоциированные β-галактозидазы (SA-бета-гал); р16 Ink4a, p53, p21 и уровней; более высокие уровни повреждений ДНК, в том числе гамма-H2AX; формирование Старение-ассоциированного гетерохроматина очагах (SAHF); и приобретение старении-ассоциированной секреторного фенотипа (SASP), явление, характеризующееся секреции ряда провоспалительных цитокинов и сигнальных молекул. Здесь мы описываем протоколы для обоих репликативной иПовреждения ДНК-индуцированное старение в культивируемых клетках. Кроме того, мы выделим методу для мониторинга стареющего фенотипа с использованием несколько старения-ассоциированными маркеров, включая SA-бету-гала, гамма-H2AX и SAHF окрашивание и количественную оценку уровней белка и мРНК регуляторов клеточного цикла и SASP факторов. Эти методы могут быть применены к оценке старения в различных моделях и тканях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Более полувека назад, Хейфлик и его коллеги описали , как нетрансформированный клетки пролиферируют в культуре, но только в течение ограниченного периода времени 1. Долгосрочное культивирование человеческих фибробластов вызвало клетку, чтобы остановить пролиферирующие; однако, они были метаболически активными, и это называлось клеточное старение. Старение может быть полезным для ингибирования онкогенеза, но она также может быть вредно, так как это , как полагают, способствуют потере регенерационной способности , что происходит со старением 2, 3. Стареющие клетки , как были показаны, накапливается в тканях , как люди возраст 4 и участвуют в ряде биологических процессов, в том числе эмбрионального развития, заживления ран, восстановления тканей, а также связанные с возрастом воспаления 2.

Постоянные пассажи клеток в культуре индуцирует репликативное старение, который был связанна теломер истощение и нестабильность генома. Различные напряжения клеток, в том числе повреждения ДНК и онкогенов, могут также вызвать старение 3. Старение вызвано другими , чем теломер истощение факторов часто называют стрессом-индуцированным или преждевременным старением и , как правило , зависит от р16 Ink4a / Rb пути 5. Несмотря на то, пролиферирующих, нетрансформированные клетки обычно появляются шпиндель в форме, стареющие клетки могут быть идентифицированы как имеющие определенные характеристики, в том числе плоскую, большую морфологию и повышенную старении-ассоциированной β-галактозидазы (SA-β-гал) (фиг.1 и 2). Стареющие клетки также накапливаются маркеры повреждения ДНК, в том числе гамма-H2AX (рисунок 3) 6, и, потенциально, Старение-ассоциированные гетерохроматина очаги (SAHF) (Рисунок 4) 7. Стареющие клетки имеют более высокие уровни регуляторов клеточного цикла, в том числе р 16 (р16 INK4A) и / или р21 и р53 (рисунок 5) 8, 9. Кроме того, недавние данные показали , что стареющие клетки могут иметь неавтономных эффекты, секретирующие ряд про-воспалительных цитокинов и хемокинов называется Старение-ассоциированный секреторной фенотип (SASP) 10. Хотя это явление SASP может варьироваться в зависимости от типа клеток типа клеток, в общем, это свидетельствует увеличение интерлейкина-6 (ИЛ-6), ИЛ-8, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), growth- регулируемый онкогена α (GRO-α), а также GRO-β, среди других (рисунок 6). Частности , стресс или повреждение , которое вызывает старение может также влиять на секреторную фенотип 11, 12, 13. SASP может быть обнаружен путем измерения уровней секретируемых белков с помощью ELISA, или цитокина / белковых массивовs = "Xref"> 10, 14. Хотя пост-транскрипционные механизмы могут регулировать уровни белка SASP 11, 15, 16, 17, изменения в уровне мРНК также могут быть обнаружены во многих случаях. Эти изменения, как правило, более чувствительны и проще, чем для количественного измерения уровня белка. Другие стареющие маркеры также могут быть оценены, включая стойкие повреждения ДНК ядерных очаги, называемые сегменты ДНК с хроматином изменениями армирующих старения (ДНК-Рубцы) 18, а также различных другими маркерами 3, 19, 20.

Здесь мы опишем общие методы для индукции старении в клетках в культуре, а также для измерения нескольких маркеров старения, включая SA-бета-Gal, гамма-H2AX, SAHF, и белок и мРНК стареютсть-ассоциированных молекул.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. побуждающих Репликативного Старение

  1. Оттаивания низкого прохода фибробласты диплоидного человека (например, WI-38 и IMR-90) или другие клеточные линии.
    Примечание: В данном случае были использованы диплоидные фибробласты человека, но эти протоколы могут быть использованы для оценки старении в других типах клеток, таких как эндотелиальные, эпителиальные или мезенхимальные стволовые клетки. Культивирование условие может быть оптимизировано для различных типов клеток, используемых в связи с различными скоростями роста или условиями роста.
    Примечание: Клетки должны быть пролиферирующими и имеет морфологию шпинделя (рисунок 1 для схематического и фиг.2 для примера). В идеале, клетки должны иметь Удвоение Population уровень (PDL) из <30 в начале экспериментов, чтобы избежать возможных репликативные стареющие клетки.
    1. Вычислить PDL клеток с использованием следующего уравнения PDL = Log (N F / N 0) / log2, где N F является окончательным числом клеток и N 0 представляет собой начальное количество посеянных клеток 21.
  2. Культура WI-38 клеток в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% заменимых аминокислот, и 1% пенициллина / стрептомицина.
  3. Рост клеток IMR-90 в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
  4. Grow все клетки при 37 ° С и 5% СО 2. Непрерывно растут клетки и разделить каждую 2 - 4 D , когда клетки достигают ~ 70 - 80% слияния. Монитор клеток слияния с помощью светового микроскопа. Избегайте клетки с более высоким слиянием, так как это может повлиять на рост клеток из-за контактное ингибирование.
  5. Монитор клетки под световым микроскопом для морфологического появления стареющих клеток (см На рисунках 1 и 2) , и для того, когда нет никаких изменений в PDL от одной субкультуры к следующему.

2. Повреждение ДНК-индуцированное Старение

  1. Пластина клетки (например, WI-38, КМС-90, или другой тип клетка) при низкой плотности (т.е. ~ 300000 клеток / 6 см блюда) в подходящем блюде для типа анализа (т.е. в 6 см чашки для белка / маркеры РНК или блюдо 6-луночное для SA-β-гал окрашивания). Использование клетки раннего пассаж, которые являются молодыми и пролиферирующим (<30 PDL) и пластинчатыми их так, чтобы клетки примерно 50 - 60% сливающиеся на следующий день.
  2. Удалите ростовую среду с помощью стеклянной пипетки, соединенной с вакуумом и промыть клетки путем добавления 1x фосфатно-солевого буфер (PBS). Повторите этот шаг в общей сложности двух стирок. Добавьте тонкий слой PBS (~ 750 мкл на чашку диаметром 6 см) как для «ложной» обработанной и ионизирующим излучением (ИК) обработанного состояния.
  3. С помощью гамма-облучатель подвергать клетки к одной дозе 10 Грей (Гр) ИК; это типичная экспозиция для большинства клеточных линий. В капюшоне, удалите PBS и заменить его ростовую среду. В качестве альтернативы, лечить клетки с бleomycin при 20 мкг / мл в течение 2 ч.
  4. Изменение среды на клетки каждые 48 -7 2 ​​ч и разделить клетки, если это необходимо.
  5. Монитор клетки под световым микроскопом для морфологических изменений (рис 1 для схемы и фиг.2 для изображений представительных клеток) и анализа на стареющие маркер 7 - 10 д после обработки ИК.
    Примечание: Этот протокол описывает старение, индуцированное ИК. Старение может также быть вызвано другими стрессами, в том числе блеомицина (см выше условия), H 2 O 2 , 22, 23, 24 химиотерапевтических препаратов, сигаретный дым 25, трансформирующий фактор роста (TGF) -β1 26, 27, и другие методы 21 , 28, 29.

3. Окрашивание КвждLs для Старение-ассоциированного -галактозидазы

  1. Перед окрашиванием, исследовать клетки под световым микроскопом, чтобы контролировать морфологические изменения.
    Примечание: стареющие клетки , как правило , увеличены и плоские, в отличие от пролиферирующих клеток, которые имеют морфологию шпинделя (смотрите рисунок 1 для схемы и фиг.2 для репрезентативных результатов). Пролиферирующие клетки могут быть использованы в качестве отрицательного контроля, и клетки, обработанные ИК или другой ДНК-повреждающего агента (смотри раздел 2) может быть использован в качестве положительного контроля.
  2. Количественно SA-β-гал активности с использованием реагентов из коммерческого набора (см Материалы таблицу). Оттепель все реагенты и довести их до комнатной температуры путем нагревания их до 37 ° C.
    1. Рассчитать количество окрашивающего раствора и раствор закрепителя необходимого.
      Примечание: Как правило, 1 мл объема достаточно для одной скважины в 6-луночный планшет. Различные размеры плиты могут быть использованы, но в 6-луночном размере пластины вэйл подходит для выполнения анализа в трех повторах для каждого условия. Эта плотность, как правило, обеспечивает достаточное количество клеток на поле для подсчета без использования избыточного количества клеток.
    2. Разбавляют раствор 1:10 окрашивания дистиллированной водой.
    3. Развести Фиксирующий раствор в соотношении 1:10 дистиллированной водой.
    4. Составьте 20x исходный раствор X-гал (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида) в N, N-диметилформамиде (ДМФ, например, 20 мг X-гал в 1 мл ДМФ). Чтобы максимизировать использование комплекта, отмерить X-гал в количестве, необходимом для каждого анализа, а затем добавить расчетное количество ДМФ до растворения. В качестве альтернативы, хранить исходный раствор при -20 ° С в защищенном от света трубки в течение одного месяца. Используйте только полипропилен (непрозрачные) трубы для разбавления и хранения X-Gal решений.
    5. Подготовьте β-гал окрашивание раствора: 930 мкл 1х окрашивающего раствора, 10 мкл окрашивающего добавки А, 10 мкл окрашивающего добавки B, и 50 мкл 20 мг / мл Х-Gal в ДМФ. Сделать мастер смеси в зависимости от того, сколько скважин должны быть окрашены.
  3. Осторожно удалите среду из клеток с использованием передачи пипетки или эквивалент.
  4. Осторожно промыть клетки сразу с комнатной температурой 1x PBS.
  5. Добавить 1 мл 1x Фиксирующий раствор в каждую лунку и инкубировали в течение 10 - 15 мин при комнатной температуре.
  6. Удалите закрепляющий раствор с пипеткой передачи.
    Примечание: Фиксирующий раствор (1x) содержит 2% формальдегида и 0,2% глутарового альдегида и следует утилизировать как опасные отходы в соответствии с рекомендациями Управления лабораторной безопасности.
  7. Осторожно промыть клетки дважды 1х PBS.
  8. Удалить PBS полностью и добавить 1x окрашивание раствора β-гал в лунки (1 мл / лунку 6-луночного планшета). Закройте планшет полностью с алюминиевой фольгой и инкубируют в течение 24 - 48 ч при 37 ° С инкубатор (предпочтительно в отсутствие СО 2, так как это может привести к снижению рН буфера и влияют на окрашивание).
    1. Проверьте клетки через 24 ч для окрашивания, а если пятно слишком светлый, инкубируют в течение еще 24 ч.
  9. После периода инкубации, удалить раствор β-гал и заменить его на 1x PBS.
    Примечание: Этот шаг удаляет некоторые цвета фона при визуализации, а также предотвращает опасные просыпание решения X-гал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизировать β-гал раствора должным образом, в соответствии с рекомендациями в офисе лаборатории безопасности.
  10. Исследуют клетки на световой микроскоп с подключенной камеры с помощью 10x или выше цели; SA-β-гал-позитивные клетки будут синим. Acquire нужного количества изображений для эксперимента. Если подсчета процентного содержания СА-β-гал-позитивных клеток, приобретают соответствующее число изображений (> 5) для количественного определения на лунку. Убедитесь, что изображения не перекрываются с различных полей зрения в каждую лунку.
  11. Подсчитайте число SA-β-гал-положительной (синий) клеток по сравнению с количеством общего числа клетокдля расчета процента SA-β-гал-позитивных клеток. Count> 100 клеток в состоянии.
    Примечание: Представитель фотография также может быть использована для фигур. Обратите внимание, что ячейка конфлуэнтность имеет решающее значение, если подсчет клеток, так как слишком много клеток, делают его трудно дифференцировать каждую клетку и слишком мало не может дать достаточное количества клеток для количественной оценки и статистики. Картинки для рисунков для публикации в лучшем разрешении, если сохранены как .tiff файлов, хотя .jpeg файлы также подходят. Цветные изображения должны быть 300 точек на дюйм.

4. Окрашивание Клетки для гамма-H2AX

  1. Пластина клеток из разделов 1 или 2 на покровные стекла в 24-луночный планшет.
  2. На следующий день, мыть клетки с 1x PBS. Промыть тщательно, как и стареющие клетки не хорошо придерживаться покровных и могут быть легко удалены во время мытья. В качестве альтернативы, непосредственно зафиксировать клетки без промывки.
  3. Удалить PBS и зафиксировать клетки с свежеприготовленного 3,7% формальдегида в PBS для10 мин при комнатной температуре.
  4. Удалить раствор и клетки проницаемыми с 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин.
  5. Удалить раствор и блок в 5% FBS в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре.
  6. Инкубируйте с анти-фосфо гамма-H2AX (Ser139) и FITC конъюгата в 5% FBS / PBS в течение 2 ч при температуре 37 ° C или O / N при 4 ° С. Защита от света.
  7. Промыть 3 - 6х с PBS при 37 ° С в течение в общей сложности 30 - 60 мин.
  8. Пятно с DAPI (разведенный 1: 15000 в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  9. Вымойте 3x с PBS.
  10. Быстро промыть водой для удаления солей и смонтировать покровное на предметное стекло, используя 3 - 5 мкл antifade реагента. В качестве альтернативы, использовать монтажный раствор, содержащий DAPI.
  11. Дайте ему высохнуть O / N и визуализации окрашенных клеток на флуоресцентном или конфокальной микроскопии с использованием 63X или выше цели.
  12. Количественная γ-H2AX фокусы с помощью одного из двух методов, описанных ниже. Оценка для любого протокола на глаз с использованием флуоресцентного микроскопа. В идеале, намеа конфокальный микроскоп. Возьмем Z-секции и конденсируются в одну плоскость, чтобы визуализировать все обнаруживаемого очаги (представительные изображения для γ-H2AX окрашивания в пролиферирующих и стареющие клетки показаны на рисунке 3). Количество очагов на глаз, используя программное обеспечение обработки изображений; в общем, ~ 100 - 200 ядер являются достаточными для подсчета.
    1. Для того, чтобы количественно оценить процент клеток, которые имеют γ-H2AX-положительных фокусы, подсчитывать каждую ячейку, которая имеет, по меньшей мере, один фокус видимым и разделить на общее число DAPI-окрашенных ядер.
    2. Для того, чтобы количественно определить количество γ-H2AX очагов, подсчитывают γ-H2AX фокусы на клетку.
      Примечание: Уровни гамма-H2AX может варьироваться в зависимости от конкретного стрессора или повреждения, индуцированного старения.

5. Окрашивание Клетки для SAHF маркеров

Примечание: Человеческие стареющие клетки часто имеют ядерные области конденсированной ДНК / хроматина. В стареющих клетках, эти гетерохроматинекак полагает, ингибирует экспрессию пролиферации промотирующего генов, такие как члены семьи E2F. SAHF могут быть визуализированы реорганизации DAPI; наличием гетерохроматиновых-ассоциированных гистонов знаков, включая ди- и три-метилирование Lys9 гистона H3 (H3K9me2 и H3K9me3); и хроматин-реорганизовать белков, в том числе HP1 гетерохроматина белок 1 (HP1), HIRA (гистона репрессор А) и ASF1a (анти-глушителей функция-1a) для хроматина 30. Мы выбрали использовать модель старения онкогена-индуцированный (OIS), а SAHF является более заметным в моделях OIS 30. IDH4 клетки пролиферируют в присутствии дексаметазона из - за наличия SV40 большого Т - антигена , но становятся стареющей после удаления дексаметазона из среды 31. SAHF может быть обнаружен с помощью DAPI окрашивания и окрашивания с антителами против специфических маркеров, перечисленных выше. Здесь мы опишем DAPI и H3K9me2 окрашивания для visualizatион SAHF в клетках 28.

  1. Grow IDH4 клеток в DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 1 мкг / мл дексаметазона. Для того, чтобы вызвать старение, удалить дексаметазон и изменить среду таким образом, что она содержит уголь-раздели FBS; после роста в течение ~ 10 дней в этой новой среде, IDH4 клетка становится стареющей 31.
  2. IDH4 клетки пластины или клетки из разделов 1 или 2, описанные выше, на покровные стекла в 24-луночный планшет.
  3. На следующий день, мыть клетки с 1x PBS. Промыть тщательно, как и стареющие клетки не хорошо придерживаться покровных и могут быть легко удалены во время мытья. В качестве альтернативы, непосредственно исправить клетки без промывки.
  4. Удалить PBS и зафиксировать клетки с свежеприготовленного 3,7% формальдегида в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте клетки 3 раза 1x PBS.
  6. Удалить раствор и клетки проницаемыми с 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин.
  7. Вымойте клетки с 1хPBS. Удалить PBS и блокируют покровные добавлением блокирующего буфера, содержащего 3% BSA (вес / объем) в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Всегда фильтровать растворы, содержащие БСА перед использованием, чтобы удалить твердые частицы.
  8. Удалить блокирующий буфер и инкубировать клетки с первичными антителами против SAHF маркеров , таких как анти-H3KMe2 антител (рис 4, см таблицы Материалов для деталей). Развести антитела в блокирующем буфере и инкубируют в течение 1 - 2 ч при комнатной температуре.
  9. Удалить раствор первичного антитела и мыть покровные 3 раза с 1% (об / об) Тритона X-100 в PBS.
  10. Развести вторичные антитела в блокирующем буфере (Материалы таблицы) и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Защита от света.
  11. Вымойте клетки дважды с 1x PBS. Пятно с DAPI (разведенного 1: 15000 в PBS; см Материалы таблицу) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  12. Вымойте покровные 3 раза 1х PBS.
    1. Быстро промыть водой для удаления солейй монтировать каждый покровный на предметное стекло, используя 3 - 5 мкл antifade реагента. В качестве альтернативы, использовать монтажный раствор, содержащий DAPI.
    2. Дайте высохнуть O / N и визуализации окрашенных клеток на флуоресцентном или конфокальной микроскопии с использованием 63X или выше цели (см Представитель Результаты показаны на рисунке 4). Количественная SAHF, как описано в разделе 4.
      Примечание: первичные антитела изотипа контроля или отсутствие первичного антитела (т.е. вторичные одна) следует использовать в качестве отрицательного контроля для иммунофлуоресцентного окрашивания.

6. Анализ Старение белков, ассоциированных с помощью иммуноблоттинга

Примечание: дряхлеющая фенотип характеризуется усилением активности регуляторов клеточного цикла, в том числе р16, р21 Ink4a и р53. Этот протокол будет описывать количественное определение уровней этих белков в клеточных лизатов. Эти методы могут быть использованы для оценки старения индуцированных с использованием различногоМетоды 21, 28, 29.

  1. Индуцирует клеточное старение , как описано в разделах 1 и 2 , или с использованием другого способа 21, 28, 29. Для анализа маркеров клеточного старения, пластины клеток в 6-см чашки и анализируют как белок и РНК одновременно (см раздел 7 Инструкции по изоляции РНК).
  2. Удалите клеточную культуральную среду. Поместите клетки на подносе льда.
    1. Промыть клетки 2 раза холодной PBS 1x. Наклоните блюдо, чтобы гарантировать, что все PBS отсасывают таким образом, чтобы быть точным с точки зрения объемов, используемых для этой процедуры.
    2. После аспирационных последнего мыть PBS, добавляют 200 мкл холодного PBS (1x для 6 см чашку) к тарелке. Скрип клеток с использованием клеточного скребка.
    3. Пипетировать клеточную / PBS смесь в РНКазы свободной трубки для выделения РНК. Возьмите примерно 150 &# 181; л этой смеси и пипеткой его в новую пробирку. Эта аликвоты будет использоваться для анализа белков, поэтому обязательно пипетки одинакового количества от каждой трубки.
  3. Лизиса клеток путем добавления 75 - 100 мкл модифицированного буфера для образцов 2x Лэммли (60 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 12,5% глицерина, 2% SDS, 5% β-меркаптоэтанола (BME), и бромфеноловый синий, могут быть составлены в виде большой партии, аликвоты и хранили при -20 ° С до использования) или эквивалентного буфера для образца.
    1. В качестве альтернативы, лизиса клеток в 75 - 100 мкл буфера для лизиса и центрифуге при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток. Удалить супернатант и пипеткой в ​​чистую пробирку. Анализ на белка Брэдфорда или эквивалентный анализ протеина может быть использован на лизаты для обеспечения одинаковой нагрузки белка.
      Примечание: Белковые анализы не могут быть выполнены на образцах лизируют в буфере для образцов.
    2. Вынуть ~ 25 мкл лизата и добавить его в 15 мкл 2х буфера для образцов. Пипетировать и сделатьшп в буфере для образца, чтобы лизировать клетки.
      Примечание: Объемы буфера для лизиса или буфера для образцов можно регулировать в зависимости от клеточного слияния. Если образец «липкий» из-за ядерного лизису, добавить больше образца буфера или PBS разбавить. Образцы могут храниться при температуре от -20 ° С до использования.
  4. Кипение образцы в течение 5 мин при 95 ° С на нагревательном блоке (или эквивалентного оборудования) и нагрузки ~ 40 мкл лизированных образца в буфере для образцов на 18% Трис-Глицин геля.
    Примечание: градиент гель (4-15%) или 14% Трисы-Глицин гель также достаточно для обнаружения низкомолекулярных белков. Различные типы гелей акриламида также могут быть использованы, но гарантировать, что гели и системы являются достаточными для обнаружения низкомолекулярных белков.
    1. Запуск с помощью 1x рабочего буфера при постоянной 100 В в течение 20 мин (через гель укладки) и ~ 60 мин при 180 В. Монитор гель, так что передняя краситель просто убегает или в нижней части геля, так что низкомолекулярный вес белки не гип от геля.
  5. Передача гель акриламида на PVDF мембрану (предварительно пропитанные 100% -ным метанолом для активации). Если делать влажную передачу, только 1 ч необходима для передачи (по сравнению с нормальным ~ 1,75 ч). Отрегулировать соответствующим образом для соответствующей системы передачи; с использованием маркеров предварительно окрашенными молекулярного веса, может помочь в оценке эффективности переноса.
  6. Промойте мембрану в воде. Используйте пятно пунцового для контроля за равную загрузку образцов. Промыть пунцовый водой.
    1. Блок мембраны в 5% обезжиренном сухом молоке в TBST (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl и 0,1% Твин-20) в течение 1 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С при перемешивании.
  7. Промывочный блот один раз TBST и инкубировать с первичным антителом , разведенным в 5% молока TBST (смотри таблицу Материалы для разведений и рекомендации антител) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Выполните два быстрых промывок TBST и затем промыть дважды на шейкере в течение в общей сложности ~ 30 мин (~ 15 мин каждый былчас).
  9. Инкубируйте с вторичными антителами в течение 40 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 6,10.
  10. Инкубируйте с свежеприготовленный Вестерн-блот-субстрат и развитие фильм или прочитать его на читателя хемилюминесценции.
  11. Зонд иммуноблот с р16 Ink4a антител первых (рисунок 5). Газа мембраны путем инкубации в течение 15 мин с водой, 15 мин с 0,2 N NaOH и 15 мин с водой. Продолжить с шагом 6.9 с использованием анти-p21 антитела.
  12. Газа мембрану с использованием 62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8 и 2% SDS с 300 мкл свежей добавленной BME в 50 мл десорбирующий раствор.
  13. Инкубируют при 50 ° С в течение 30 мин и мыть экстенсивно с TBS и затем TBST. Зонд с анти-актина или GAPDH анти-антител для контроля белок-погрузочных (5 показаны репрезентативные результаты).
    Примечание: Уровни p53 также могут быть оценены на один и те же мембраны. Однако, так как р53 является более высокой молекулярной массой, он лучше решен на нижнем процентный геле (например,     10% Трисы-Глицин или градиентный гель (4-15%)). Уровни протеина других маркеров стареющих также может быть оценена с помощью иммуноблоттинга лизатов, в том числе гамма-H2AX и маркеры SAHF.

7. Анализ уровней мРНК старении маркеров

Примечание: При выделении РНК, гарантировать, что рабочие поверхности очищают с растворами удаления РНКазы или эквивалент, и что эти материалы все РНКазы.

  1. Использование клеток / PBS смесь со стадии 4.2, добавляют 1 мл экстракционного раствора РНК и вихря в течение 30 с (не должно быть никаких видимых комков или остатков клеток).
  2. Добавляют 200 мкл хлороформа и энергично встряхивают в течение 15 с.
  3. Центрифуга на максимальной скорости (> 15000 Xg) в течение 15 мин при 4 ° С.
  4. Удалить ~ 400 мкл верхней РНК водного слоя и пипеткой его в новую микроцентрифужную пробирку.
  5. Добавьте 400 мкл изопропанола (1: 1 с общим объемом водного слоя пипеткой на предыдущей стадии) и 4 мкл прecipitant к РНК слоя.
  6. Центрифуга в течение 15-30 мин при максимальной скорости (> 15000 Xg) и 4 ° С для осаждения РНК.
  7. Удалить супернатант и добавить 1 мл 75% охлажденного на льду этанола.
  8. Центрифуга в течение 1 мин при максимальной скорости (> 15000 Xg) и 4 ° С.
  9. Удалить супернатант и центрифуги в течение 1 мин при максимальной скорости (> 15000 Xg) и 4 ° С.
  10. Пипетировать, как много жидкости, как это возможно, и сушат на воздухе в течение 2 мин.
  11. Повторное приостановить в 10 мкл 10 - кратного буфера ДНКазы, 85 мкл H 2 O, и 5 мкл ДНКазы 1.
  12. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
  13. Добавляют 200 мкл буфера NT2 (50 мМ Трис-HCl , рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2, и 0,05% Нонидет P-40) и добавьте 300 мкл нижнего слоя кислоты фенол-CHCl 2.
  14. Вихревой течение 1 мин и центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 мин при максимальной скорости (> 15000 мкг).
  15. Собрать 250 мкл верхнего слоя РНК (2 х 125 мкл), добавляют 25мкл 3 М ацетата натрия рН 5,2, 625 мкл 100% ледяной этанола и 5 мкл осадителя. Хорошо перемешать и осадить O / N при -20 ° С.
  16. На следующий день, перемешать и спина при максимальной скорости (> 15000 Xg) и 4 ° С в течение 30 мин и отбросить супернатант.
  17. Повторите шаги 6.8-6.11.
  18. Повторное приостановить осадок в 12 мкл нуклеазы без воды и хранят при -80 ° С до использования.
    Примечание: Другие процедуры выделения РНК и наборы могут быть использованы.
  19. Выполнение обратной транскрипции со случайными гексамерами и SSII обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя.
    Примечание: Учитывая низкое количество РНК, выделенной из стареющих клеток, то лучше использовать все РНК (12 мкл) для обратной транскрипции синтеза. Альтернативно, РНК может быть определена количественно с помощью спектрофотометра, и равные количества РНК могут быть использованы для обратной транскрипции.
  20. Анализ уровней мРНК с использованием в режиме реального времени количественного КПЦР (RT-КПЦР) amplificция и SYBR-зеленый Master Mix ПЦР с использованием праймеров, специфических генов.
    1. Как и в обычной реакции РТ-КПЦР, разбавить кДНК 1:30 (в РНКазы / ДНКазы без воды) и добавляют 3 мкл в режиме реального времени 96-луночный планшет для повышения точности пипетирования. Подготовьте мастер реакционную смесь гена-специфического пр мого и обратного праймеров (концентрации 2,5 мкМ, добавляют 5 мкл / реакция), SYBR-зеленый ПЦР смесь (6,25 мкл / реакцию, использование менее чем рекомендации производителя), и 5,75 мкл РНКазы / ДНКазы, свободной воды для конечного объема реакции 20 мкл (17 мкл праймеров / SYBR-зеленый / воды и 3 мкл кДНК).
    2. Выполните RT-КПЦР амплификации с использованием в режиме реального времени PCR машину; следовать протоколу производителя.
      Примечание: Список проверенных человека в прямом и обратном режиме реального времени праймеров можно найти в таблице 1. Эти гены включают SASP белки и другие старение-ассоциированные маркера и / или гены. Типичные результаты ИК-индуцированное старение показаны в Рисунок 6.

8. Количественная SASP Белковые уровни

  1. Индуцирует с помощью старения Разделов 1 или 2 или с помощью другого метода. Пластина клеток на 6 или 10 см пластинах, как было описано выше (~ 250000 клеток / см пластины 6 или ~ 650,000 / 10 см пластины).
  2. Либо с ячейками 10 г после ИК лечения или с репликативными стареющими клетками (и соответствующими контрольными клетками), промыть клетки три раза 1x PBS и добавить бессывороточную среду с антибиотиками в небольшом объеме (2,5 мл на 6 см или 5 мл на 10 см).
  3. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С и 5% CO 2 в инкубаторе тканевых культур. На следующий день, собрать среду и положить его в коническую пробирку на льду.
  4. Промыть клетки 2 раза PBS и затем добавляют 1 мл трипсина (для 6 см чашки). Граф клеток с использованием гемоцитометра позже регулировки концентрации в зависимости от количества клеток.
  5. Центрифуга среда в течение 5 мин при 300 х г.
  6. Filtэр среда с помощью шприца фильтр 0,45 мкм.
  7. не Алигота среды и заморозить при -80 ° С до использования или анализа ELISA с использованием непосредственно или эквивалентные анализов.
  8. Подсчитайте число клеток / мл концентрации, принимая общее число клеток / объем среды, собранный.
  9. Выполните соответствующий иммуноферментный анализ (ELISA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Смотрите таблицу рекомендуемых материалов для наборов ELISA для анализа на IL-6, IL-8, GROα и других цитокинов / хемокинов (фиг.6В).
  10. Для того, чтобы гарантировать, что факторы, которые измеряются в пределах линейного диапазона набора ELISA, чтобы разведения клеточной среды стареющей по сравнению с пролиферирующими клетками среды. Счет для этих разведений и объема при расчете количества IL-6. Для того, чтобы получить количество IL-6, секретируемых на клетку в день, вычислить значение IL-6, полученный из комплекта (в пг) в разбавленной концентрации клеток на мл (фршаг 7,8 Ом).
    Примечание: Другие методы, такие, как цитокин массивы, могут быть использованы для обнаружения уровня белка SASP и могут быть пригодны для скрининга большого количества SASP факторов. Уровни протеина SASP факторов могут меняться в зависимости от времени после увядания индукции, типа клеток или типа старения индуцированных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунках 2 - 6 показывают репрезентативные результаты от SA-β-гал окрашивания; окрашивания для гамма-H2AX и SAHF; оценка уровней белка р16, р21 Ink4a и р53; и мРНК и уровни белка стареющих-ассоциированных молекул. Увеличение SA-β-гал окрашивание происходит с репликативным и повреждением ДНК-индуцированным старением. Кроме того, необходимо соблюдать морфологические изменения, которые происходят с старением. Клетки увеличиваются и плоские по сравнению с внешн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описали способы репликативной и ДНК-повреждений, вызванных старением с использованием диплоидных фибробластов человека. Кроме того, методы для количественного определения белка и уровни мРНК различных стареющих-ассоциированных белков включены, а также для окрашивания SA-бета-гал и для повреждения ДНК маркера гамма-H2AX. Эти протоколы могут быть широко использованы для оценки стареющих фенотипов как в пробирке и в естественных условиях, хотя многие предостережения существуют для характеристики ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано исследовательской программой Intramural Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт по проблемам старения. Авторы хотели бы поблагодарить Мириам Горосп и Котб Абдельмохсен за полезные дискуссии о старении и Котб Абдельмохсна для также критически чтения рукописи. Мы также благодарим наших лабораторных членов, особенно Дуглас Длузен для критически чтении рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% гели трис-глицинаInvitrogenXP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 козье антитело против мышейInvitrogenA110311:300 разведение
Cell liftersCorning Inc.3008Cell scraper
ECL anti mouse HRP linked антителоAmershamNA931V
ECL Plus Western Blotting SubstratePierce32132ECL
DAPIМолекулярные зондыMP01306запас 5 мг/мл в dH2O
антитело GAPDHSanta Cruzsc-322331:1,000 - 5,000 разведение
GlycoBlueAmbionAM9515
Histone H3 диметилK9 моноклональное антителоAbcam12201:500 разведение
человеческого IL-6 Quantikine ELISA анализR& D systemsD6050
Human IL-8 Quantikine ELISA анализR& D системыD8000C
Человеческий GROa Quantikine ELISA анализR& D системыDRG00
N-N-диметилформамид SigmaD4551DMF
p16 моноклональное антителоBD Biosciences51-1325гр1:500 разведение
p21 моноклональное антителоMillipore05-3451:750 разведение
p53 моноклональное антителоSanta Cruzsc-1261:500 разведение клон DO-1
фосфо-H2AX (Ser139) FITC конъюгированное антителоCell Signaling97191:2,000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix Прикладные биосистемы4367659
предварительно окрашенные молекулярные маркерыBiorad161-0374
ProLong Gold Antifade Мембрана InvitrogenP36930
PVDF Thermo Scientific88518
Набор для окрашивания β-галактозидазыCell Signaling9860
TRIzolAmbion/Life Tech 10296028

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
  4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
  5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
  7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
  9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
  10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
  12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
  13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
  14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
  15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
  16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
  17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
  18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
  19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
  20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  21. Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
  22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
  23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
  24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
  26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
  28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
  29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
  30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
  31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
  32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
  33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
  34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
  35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
  39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
  40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
  41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
  42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
  45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
  46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cellular SenescenceSenescence InductionSA gal StainingGamma IrradiationDNA DamageSASP QuantificationRT qPCR AnalysisELISA DetectionSenescence MarkersCell Cycle Arrest

Related Articles