Методическая статья

Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55536

⸱

3 июля 2017 г.

 ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

В этой статье

Краткое содержание

Описывается метод качественного и количественного анализа образования гранулятов стенок в клетках млекопитающих после того, как клетки заражены бактериями и рядом различных стрессов. Этот протокол может быть применен для исследования реакции гранулы клеточного стресса в широком диапазоне хост-бактериальных взаимодействий.

Аннотация

Флуоресцентная визуализация клеточных компонентов является эффективным инструментом для исследования взаимодействия хозяев-патогенов. Патогены могут влиять на многие различные особенности инфицированных клеток, включая ультраструктуру органелл, организацию цитоскелетной сети, а также клеточные процессы, такие как образование стресс-гранулы (SG). Характеристика того, как патогенные процессы разрушают хост-процессы, является важной и неотъемлемой частью поля патогенеза. Хотя переменные фенотипы могут быть легко видны, точный анализ качественных и количественных различий в клеточных структурах, вызванных проблемой патогенов, необходим для определения статистически значимых различий между экспериментальными и контрольными образцами. Образование SG является эволюционно консервативным стрессовым ответом, который приводит к антивирусным ответам и уже давно изучается с использованием вирусных инфекций 1 . SG также влияет на сигнальные каскады и может иметь другой, еще неизвестный консек2 . Характеристика этой реакции стресса на патогены, отличные от вирусов, такие как бактериальные патогены, в настоящее время является новой областью исследований 3 . На данный момент количественный и качественный анализ образования СГ еще не используется обычно даже в вирусных системах. Здесь мы опишем простой способ индуцирования и характеризации образования SG в неинфицированных клетках и в клетках, инфицированных цитозольным бактериальным возбудителем, который влияет на образование СГ в ответ на различные экзогенные стрессы. Анализ формирования и состава SG достигается с использованием ряда различных маркеров SG и плагина детектора детектирования ICY, инструмента анализа изображений с открытым исходным кодом.

Введение

Визуализация взаимодействия хозяин-патоген на клеточном уровне является мощным методом получения информации о патогенных стратегиях и идентификации ключевых клеточных путей. Действительно, патогены могут использоваться в качестве инструментов для определения важных клеточных целей или структур, поскольку патогены развились, чтобы разрушить центральные клеточные процессы как стратегию их собственного выживания или распространения. Визуализация клеточных компонентов может быть достигнута путем рекомбинантного экспрессии флуоресцентно-меченых белков-хозяев. Хотя это позволяет проводить анализ в реальном времени, генерация клеточных линий с специфически меченными протеинами хозяина очень трудоемка и может привести к нежелательным побочным эффектам. Более удобным является обнаружение клеточных факторов с использованием специфических антител, поскольку одновременно можно проанализировать несколько факторов хозяина, и один из них не ограничивается конкретным типом клеток. Недостатком является то, что только статический вид может быть захвачен, поскольку анализ иммунофлуоресценции требует фиксации клетки-хозяинаион. Однако важным преимуществом иммунофлюоресцентной визуализации является то, что она легко поддается количественному и качественному анализу. Это, в свою очередь, может быть использовано для получения статистически значимых различий, чтобы дать новое представление о взаимодействиях хозяина-патогена.

Программы анализа флуоресцентного изображения являются мощными аналитическими инструментами для выполнения 3D и 4D-анализа. Однако высокая стоимость программного обеспечения и его обслуживание делают методы, основанные на бесплатном ПО с открытым исходным кодом, более привлекательными. Тщательный анализ изображений с использованием программного обеспечения для биоанализа ценен, поскольку он обосновывает визуальный анализ и при присвоении статистических значений повышает уверенность в правильности данного фенотипа. Ранее SGs анализировались с использованием бесплатного программного обеспечения ImageJ, что требует ручной идентификации отдельных SG 4 . Здесь мы предлагаем протокол для индукции и анализа клеточного SG-образования в контексте bacС использованием бесплатного программного обеспечения для анализа биоизображений с открытым исходным кодом ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Программное обеспечение для анализа биоизображения имеет встроенную программу обнаружения пятен, которая очень подходит для анализа SG. Он позволяет осуществлять точную настройку процесса автоматического обнаружения в определенных регионах интереса (ROI). Это устраняет необходимость в ручном анализе отдельных SG и устраняет смещение выборки.

Многие экологические стрессы вызывают образование SG, которые представляют собой фазовые плотные цитозольные, непембранные структуры диаметром от 0,2 до 5 мкм в диаметре 5,6 . Этот клеточный ответ эволюционно сохраняется у дрожжей, растений и млекопитающих и возникает, когда глобальный перенос белка ингибируется. Он включает в себя агрегацию застопоренных комплексов инициации трансляции в SGs, которые считаются местами для трансляционно-неактивных мРНК, позволяя избирательный перевод подмножества клеточных мРНК.При удалении стресса растворы SGs и глобальные показатели синтеза белка возобновляются. SG состоят из факторов инициации трансляции элонгации, белков, участвующих в метаболизме РНК, РНК-связывающих белков, а также белков и факторов леса, участвующих в передаче сигналов хозяина 2 , хотя точная композиция может варьироваться в зависимости от применяемого напряжения. Факторы окружающей среды, которые индуцируют образование SG, включают в себя голодное голодание, ультрафиолетовое облучение, тепловой шок, осмотический шок, стресс эндоплазматического ретикулума, гипоксию и вирусную инфекцию 2 , 7 , 8 . Значительный прогресс был достигнут в понимании того, как вирусы индуцируют, а также разрушают образование SG, в то время как мало известно о том, как другие патогены, такие как бактериальные, грибковые или простейшие патогены, влияют на этот ответ на клеточный стресс 1 , 7 .

ShigeLla flexneri - грамотрицательный факультативный цитозольный патоген человека и возбудитель тяжелой диареи или шигеллеза. Шигеллез является основным бременем общественного здравоохранения и ежегодно приводит к 28 000 смертей среди детей в возрасте до 5 лет 9 , 10 . S. flexneri заражает кишечный эпителий и распространяет клетку-клетку путем захвата цитоскелетных компонентов хозяина 11 , 12 . Инфекция эпителия поддерживает репликацию S. flexneri в цитозоле, но инфицированные макрофаги умирают в результате процесса воспаления клеточной смерти, называемого пироптозом. Инфекция приводит к массивному набору нейтрофилов и сильному воспалению, которое сопровождается теплом, окислительным стрессом и разрушением тканей. Таким образом, в то время как инфицированные клетки подвержены внутренним стрессам, вызванным инфекцией, такими как нарушение Гольджи, генотоксический стресс и перекрестная цитоскелетная перегруппировкаС, инфицированные клетки также подвергаются воздействию окружающей среды из-за воспалительного процесса.

Характеристика влияния инфекции S. flexneri на способность клеток реагировать на стрессы окружающей среды с использованием ряда маркеров SG продемонстрировала, что инфекция приводит к качественным и количественным различиям в составе SG 3 . Однако мало известно о других бактериальных патогенах. Здесь мы опишем методологию заражения клеток-хозяев цитозольным патогеном S. flexneri , стресс клеток с различными воздействиями окружающей среды, маркировку компонентов SG и качественный и количественный анализ формирования и состава SG в контексте инфицированных И неинфицированные клетки. Этот метод широко применим к другим бактериальным патогенам. Кроме того, анализ изображений SG-образования может быть использован для инфицирования вирусами или другими патогенами. Он может использоваться для анализа SGОбразование при инфицировании или влияние инфекции на образование SG в ответ на экзогенные стрессы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка бактерий и клеток-хозяев

  1. Передача стеклянной крышки на 12 или 14 мм соскальзывает в 24-или 12-луночные планшеты, соответственно, стерильным пинцетом, считая одну лунку на экспериментальное состояние. Стерилизовать их путем УФ-обработки в капюшоне для тканевой культуры в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Включите контрольные лунки для бактериального заражения и индукции SG посредством экзогенных стрессов.
  2. Для 24-луночного планшета с покровным стеклом 12 мм высевают 1 × 10 5 клеток млекопитающих ( например, клетки HeLa) на покровные стекла; Надавите покровные стекла стерильным наконечником пипетки. Пусть клетки прилипают в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе с тканевой культурой с 5% СО 2 в культуральной среде, подходящей для каждого типа клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пластинчатые клетки, так что слияние клеток составляет от 40 до 60% на следующий день.
    1. Для клеток HeLa инкубируйте в модифицированной среде Dulbecco с модифицированной орлиной средой (DMEM) с несущественными аминокислотами (NEAA) и 10% разведенной сывороткой плодного теленка (FCS).Декомпозицию FCS путем нагревания в течение 30 минут на водяной бане с температурой 56 ° C, закручивая сыворотку один раз через 15 мин.
  3. Чтобы вымыть бактерии, используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы удалить небольшое количество из бактериального глицерина (20% глицерина), хранящегося в морозильнике -80 ° C, и поместить его на этикетку. Используйте стерильную петлю для распространения бактерий примерно на 10% от пластины. Используйте новую стерильную петлю и протащите ее через мазок, чтобы сделать 3 параллельные линии, половину пластины. Проведите через эти линии, покрывающие остальную часть пластины. Инкубируйте пластину O / N при 37 ° C.
    1. Выберите одну бактериальную колонию ( например, S. flexneri ) из свежесобранной пластины. Избегайте работы с бактериальными колониями старше 1 недели.
    2. Для штамма S. flexneri M90T инокулируют красную колонию из свежесваренной трипсиновой соевой агара-0,1% Конго-красного агара в 8 мл триптического соевого бульона в пробирке объемом 15 мл; Затяните крышку и инкубируйте, встряхивая при 222 об / мин, O / N при 306; С.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не используйте большие белые колонии, поскольку они потеряли плазмиду вирулентности и не являются инфекционными.

2. Бактериальная проблема клеток-хозяев

  1. Подготовьте бактерии, чтобы максимизировать инфекционный потенциал.
    1. Для S. flexneri , субкультурные бактерии, добавляя 150 мкл O / N культуры к 8 мл триптического соевого агара и инкубации, встряхивая 222 об / мин при 37 ° C до поздней экспоненциальной фазы (~ 2 часа), чтобы индуцировать экспрессию гена вирулентности и усиливать инфекцию.
      1. Когда культура имеет оптическую плотность от 0,6 до 0,9 (измеренную при 600 нм), перенос 1 мл культуры в пробирку объемом 1,5 мл. Бактерии гранул в течение 2 мин при 8000 мкг и ресуспендируют в инфекционной среде (DMEM с NEAA, без FCS) при OD 600 = 1. Таким образом, если OD 600 составляет 0,85, ресуспендируют в 850 мкл.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Для S. flexneri, при OD 600 = 1, будет 8 x 10 8 бактерий на мл, еслиКультивировали в 8 мл среды. Множественность заражения (МВД) 20 подходит. Для других патогенов количество бактерий на мл при OD 600 и соответствующее МВД необходимо определить эмпирически.
    2. Для усиления взаимодействия бактерий-хозяев покрывают бактерии поли-L-лизином (PLL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: PLL-обработка S. flexneri не влияла на динамику SG. Другие патогены необходимо оценить для их пригодности к лечению PLL.
      1. Чтобы покрыть бактерии PLL, центрифугируют 1 мл бактериальной культуры в течение 2 мин при 8000 × g, а затем ресуспендируют гранулу в 10 мкг / мл PLL в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) при OD 600 = 1.
      2. Добавьте бактериальный раствор в маленькую тарелку, такую ​​как лунку в 12-луночный планшет, и инкубируйте при комнатной температуре (~ 20 ° C) в течение 10 минут с осторожным перемешиванием на шейкере.
      3. Бактерии гранул в течение 2 мин при 8000 xg, удалите избыток PLL. Ресуспендируют гранулу в 1 мл PBS иD повторите эту операцию промывки дважды. После окончательной промывки ресуспендируют в инфекционной среде при OD 600 = 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь инфекционная среда для S. flexneri представляет собой среду клеток-хозяев с 20 мМ HEPES без FCS.
  2. Подготовьте клетки для бактериального заражения.
    1. Удалите среду из клеток HeLa млекопитающих с помощью всасывающего насоса. Добавить 500 мкл среды RT HeLa для мытья клеток, завихрения, удаления среды с помощью всасывающего насоса и заменить 500 мкл RT соответствующей инфекционной среды ( например , среду клеток-хозяев с 20 мМ HEPES без FCS).
    2. ПРИМЕЧАНИЕ. Для всех этапов мытья быстро работайте и обрабатывайте только до 4 покровных покрытий за раз, чтобы избежать высыхания клеток.
  3. Вызовы подготовили клетки HeLa с бактериями для инфицирования 20-50% клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Соответствующее время и МВД необходимо определить для каждого вида бактерий. Как правило, хороший старт составляет 30 мин при 37° C с МВД 10.
    1. Для S. flexneri выявить клетки клеток HeLa, используя один из двух методов (шаг 2.3.1.1 или 2.3.1.2).
      1. Спиновые не-PLL-обработанные бактерии (20 мкл OD 600 = 1 / лунка 24-луночного планшета в среде 500 мкл) на клетки в течение 10 минут при 13000 x g.
      2. Добавьте бактерии, покрытые PLL (15 мкл OD 600 = 1 / лунка 24-луночного планшета в среде 500 мкл) в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы бактерии могли оседать на клетки.
    2. Позвольте инфекции произойти, поместив клетки с поселенными бактериями в инкубатор для культивирования ткани 37 ° C в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В течение коротких временных интервалов синхронизируйте инфекцию S. flexneri , помещая пластины в водяную баню с температурой 37 ° C в течение 15 минут, а не в инкубатор для тканевой культуры.
  4. Остановите инфекцию путем мытья клеток.
    1. Чтобы промыть клетки и удалить лишние бактерии, удалите среду с помощью всасывающего насоса, добавьте 1 млСвежую предварительно нагретую (37 ° C) культуральную среду HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA). Переверните среду, удалите и замените свежей средой. Повторите дважды и оставьте свежую среду на ячейках.
      1. Для S. flexneri или других внутриклеточных бактерий, после инфицирования клеток HeLa и моющих средств, замените среду стандартной средой для тканевой культуры, содержащей 50 мкг / мл гентамицина, чтобы убить внеклеточные бактерии и предотвратить дальнейшее вторжение клеток.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Не добавляйте антибиотики в среду для внеклеточных бактерий.
  5. Инкубируйте бактерии с клетками в течение требуемого количества времени в инкубаторе тканевой культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для S. flexneri инфекция может достигать 6 часов в зависимости от типа клетки. Для клеток HeLa пусть инфекция протекает в течение 1,5-2 часов, прежде чем добавлять экзогенные стрессы, чтобы индуцировать образование SG. Для инфекций Caco-2, при которых Shigella распространяется клетка-клетка, инфицируйте в течение 30 мин до 6 ч, прежде чем добавлять экзогенный стресс. CeLls могут быть зафиксированы в этой точке без добавления экзогенных стрессов для оценки образования SGs в результате бактериальной инфекции (в этом случае перейдите к разделу 4).

3. Индуцирование образования гранулятов путем добавления экзогенных стрессоров

  1. Удалите среду из инфицированных и неинфицированных клеток HeLa с помощью всасывающего насоса, замените среду на 500 мкл соответствующей среды с или без стрессора и инкубируйте.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Условия, вызывающие стресс, включают следующее (см. Ниже). Для дополнительных обработок см. Kedersha et al . 13 .
    1. Для обработки теплового шока используйте обычную среду, содержащую 20 мМ HEPES, и поместите пластину на водяную баню 44 ° C в течение 30 минут.
    2. Для лечения клотримазола (индуцирует митохондриальный стресс) используйте обычную среду без FCS с 20 мкМ клотримазолом и инкубируйте в инкубаторе для тканевой культуры в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните одноразовые аликвоты 20 мM клотримазола в диметилсульфоксиде (ДМСО) при -20 ° С в течение 4 месяцев. Используйте автомобиль DMSO для контрольных ячеек.
    3. Для лечения арсенита (индуцирует окислительный стресс) используйте обычную среду с 0,5 мкМ арсенита и инкубируйте в инкубаторе тканевой культуры в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните одноразовые аликвоты в количестве 0,5 мМ арсенита при -20 ° C в течение 6 месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Клотримазол и арсенит вредны и опасны для окружающей среды и должны быть утилизированы соответствующим образом.
    4. Для лечения Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -патеамина (ингибирует инициацию трансляции эукариот) используют обычную среду с 50 - 200 нМ DMDA-патеамина и инкубируют в инкубаторе с тканевой культурой в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните DMDA-патеамин при -80 ° C. Храните реагенты в виде небольших аликвот, чтобы избежать замораживания оттаивания.

4. Фиксация и анализ иммунофлуоресценции образования гранулята

ПРИМЕЧАНИЕ. Обработайте контроль иЭкспериментальные покровные стекла в то же время, чтобы избежать различий окрашивания, которые могут повлиять на анализ изображений на последующих этапах. Контрольные образцы не включают инфекции и без SG-индуцирующей терапии, а также инфицированные образцы с и без SG-индуцирующего лечения.

  1. Удалите среду полностью с помощью всасывающего насоса и зафиксируйте образцы, добавив 0,5 мл RT 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PFA вредно для обработчика и окружающей среды. Соблюдайте надлежащую меру для защиты обработчика и утилизации химических отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, зафиксируйте в течение 15 минут, а затем замените метанолом -20 ° C с предварительной обработкой в ​​течение 10 минут, чтобы сохранить большую цитоплазматическую локализацию маркеров SG 13 .
  2. Удалите PFA с помощью пипетки и утилизируйте жидкость в соответствующем контейнере для отходов. Промывают покровное стекло 1 мл трис-буферного солевого раствора (TBS: 25 мМ Трис, pH 7,3, 15 мМ NaCl). Инкубируйте покровное масло в течение 2 мин с осторожным встряхиваниемНа шейкере во время стирки.
  3. Полностью удалите TBS с помощью всасывающего насоса и добавьте 500 мкл 0,3% Triton-X100 в TBS в течение 10 минут для проницаемости клеток.
  4. Удалите пермеабилизирующий раствор с помощью всасывающего насоса. Замените 1 мл TBS, осторожно закрутите пластину, удалите TBS путем всасывания и добавьте 1 мл блокирующего раствора (5% FCS в TBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  5. Подготовьте первичный раствор антител (разведение 1: 300) в 5% FCS в TBS. Рассчитайте 50 мкл на 12 мм покровное стекло и сделайте достаточно для всех покровных в одной партии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Общие первичные антитела, которые используются, предназначены для целевых G3BP1, eIF3b и TIA1.
  6. Пятно 50 мкл первичной смеси антител на пластиковую парафиновую пленку (парафильм) прочно наклеивают на скамью или в камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Список канонических SG-маркеров приведен в Таблице материалов , но состав SG может зависеть от применяемого напряжения. Другие маркеры SG перечислены в Kedersha et al. 13 Ожидаемые результаты для ряда маркеров SG для инфекции S. flexneri приведены в таблице 1 .
  7. Возьмите покровное с помощью пинцета, нанесите край покровного на ткань, коротко отпустите пинцет, чтобы удалить лишнюю жидкость, и аккуратно положите лицо вниз на каплю. Инкубируйте покровные вещества в течение 1,5 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С во влажной камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы подготовить влажную камеру, поместите предварительно уложенные ткани по краям плотно закрытой камеры, облицованной пластиковым парафилом.
  8. Перенесите каждое покровное стекло пинцетом в лунку новой 24-луночной планшеты, заполненной 1 мл TBS; Инкубировать с осторожным встряхиванием на шейкере в течение 5 мин. Всасывание TBS в каждой лунке с использованием всасывающего насоса, замените 1 мл TBS и положите обратно на шейкер на 5 минут. Повторите промывку еще раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Повторное использование парафильма путем удаления избыточной жидкости с помощью ткани и промывки поверхности водой. Убедитесь, что парафиновая пленка полностью сухая перед введениемГ для последующего окрашивания.
  9. Подготовьте раствор вторичных антител в TBS (разведение 1: 500-1: 2000). Чтобы окрасить ядро ​​и бактерии, добавьте 2 мкг / мл DAPI в смесь. Чтобы окрасить актин, добавьте флуоресцентный фаллоидин. Внесите 50 мкл вторичного антитела на пластиковую парафиновую пленку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Использование высокоочищенных перекрестно абсорбированных ослиновых вторичных антител рекомендуется для исследований с коалокализацией различных маркеров SG, когда используется G3BP1 (козьи антитела). Выбирайте флуоресцентно меченные вторичные антитела с неперекрывающимися спектрами. EIF3b явно окрашивает цитоплазму клеток и поэтому является хорошим маркером для определения клеток. Пятна актина дополнительно помогают очерчивать клетки в местах контакта клеток с клетками и в областях бактериального входа.
  10. Возьмите покровное с помощью пинцета, нанесите край покровного на ткань, коротко отпустите пинцет, чтобы удалить лишнюю жидкость. Осторожно положите покровное лицо на каплю и инкубируйте покровные стеклаВ темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
  11. Используйте пинцет, чтобы поместить покровное в 24-луночные планшеты, наполненные свежей 1 мл PBS. Убедитесь, что покровное покрытие полностью покрыто PBS. Промыть клетки 3 раза мягким встряхиванием в течение 5 минут каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Храните пластину во время промывки под крышкой для защиты от света, поскольку флуорофоры вторичного антитела чувствительны к свету.
  12. Кратко окуните покровное в деионизированную воду, чтобы удалить соль, нанесите сухую краю на ткань и установите покровное стекло на 5 мкл флюоресцентной монтажной среды на стеклянном слайде. Запечатайте покровное стекло до получения изображений с помощью лака для ногтей. Храните слайды при температуре 4 ° C в течение короткого времени (неделя) или при -20 ° C для хранения в течение длительного времени (месяца).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте пузырьков воздуха при герметизации, так как это может повредить качеству изображения.

5. Флуоресцентная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптимизации настройки обратитесь к руководству пользователя микроскопа.

  1. Приобретайте изображения, используя конфокальный микроскоп, используя либо масляный иммерсионный объектив 40 или 63X. Выберите желаемые флуоресцентные каналы для получения изображения. При использовании нескольких флуоресцентных каналов выберите режим последовательного сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Начните с экспериментальных образцов, где SGs были вызваны наиболее сильными, чтобы избежать чрезмерного воздействия на последующие образцы. Удостоверьтесь, что не были переэкспонированы SG на всей глубине ячейки.
    1. Установите размер бит 12 или выше в настройках микроскопа, чтобы обеспечить точность анализа изображения.
    2. Установите стеки изображений, чтобы покрыть всю глубину ячейки. Проверьте различные каналы и различные маркеры SG, чтобы убедиться, что весь диапазон включен. Установите начало стека в основании ячеек и верхнюю часть стеков на высоте в верхней части ячеек, где не наблюдаются более сильные метки.
    3. Приобретите стек. Держите высоту стека одинаковой для всех изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ.Изменить настройки сбора данных между контрольными и экспериментальными образцами, которые будут использоваться для последующего сравнения.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь описывается анализ SG на свернутых пакетах с использованием бесплатного ICY. Анализ изображений 3D-реконструкций также может быть выполнен с использованием другого специализированного программного обеспечения. Обнаружение SG может выполняться посредством полностью автоматизированного рабочего процесса, установленного для этого протокола (см. Http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Чтобы использовать этот протокол, ядра должны быть окрашены пятнами ДНК для программного обеспечения, чтобы найти центр каждой ячейки, и кромки клеток должны быть отмечены либо цитоплазматическим маркером (таким как eIF3b), либо актиновым пятном для программного обеспечения Для идентификации границ ячеек. Автоматический рабочий процесс может использоваться для проверки результатов, полученных вручную, или непосредственно для анализа, когда границы ячейки обнаруживаются с высокой степенью уверенности, что будетЗависит от плотности клеток и маркера, используемого для обнаружения границ клеток.

  1. Используя ImageJ или Fiji, сверните стеки изображений (Изображение> Стеки> Проецирование Z) и сохраните как .tiff файлы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Создайте новую папку для каждого изображения, поскольку программное обеспечение для анализа изображения свяжет свои результаты с сайтом исходного изображения.
  2. Загрузите контрольное и экспериментальное изображение .tiff на платформу анализа изображений (File> Open). Войдите в окно Sequence. Прокрутите вниз в «Таблице поиска» до параметров канала.
  3. Деактивируйте все каналы, установив флажок для всех вкладок каналов. Нажмите на канал 0, а затем выберите предпочтительный цвет, нажав на панель цветов выше. Увеличьте интенсивность канала по мере необходимости, чтобы увидеть все структуры, щелкнув и двигая линию в поле интенсивности. Повторите это для всех каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Деактивируйте каналы, которые не требуются для заданной задачи, чтобы свести к минимуму смещение в анализе выборки.
  4. манускриптИ на вкладке Canvas увеличьте примерно до 10 ячеек на поле, отрегулировав вкладку масштабирования.
  5. Используйте инструменты функций многоугольника (в верхней панели), чтобы очертить границы ячеек на изображении. Используйте пятно актина или цитозольный маркер для определения границы ячейки ( например, eIF3b).
    1. Нажмите кнопку «Многоугольник» в инструментах «Файл и ROI». Начните разграничение, щелкнув по ячейке, а затем продолжите линию, сделав якоря через повторный щелчок по границе ячейки. Чтобы завершить ROI, щелкните еще раз на функции многоугольника в инструментах «Файл и ROI».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Определите подгруппы зараженных зараженных клеток. Образец состоит из смеси зараженных и неинфицированных клеток. Для идентификации бактерий используйте окрашивание DAPI или флуоресцентные бактерии (такие как GFP-экспрессирующие бактерии). Увеличьте интенсивность, чтобы убедиться, что все бактерии видны.
    2. Чтобы назвать ROI, перейдите в окно ROI справа и cliCk в интересующей ячейке изображения. Это отобразит соответствующий ROI на вкладке ROI. Дважды щелкните по имени ROI и измените имя ( например, зараженную ячейку # 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если одно изображение используется для анализа как зараженных, так и неинфицированных ячеек, проще сохранить изображение в двух отдельных папках и разделить зараженные и неинфицированные ячейки отдельно, создавая две разные электронные таблицы, что облегчит анализ позже.
  6. Откройте приложение детектора пятна на вкладке «Обнаружение и отслеживание» (верхняя панель). На вкладке «Ввод» будет выбрано текущее изображение. Ничего не меняйте. На вкладке «Предварительная обработка» выберите канал для анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В любой момент времени можно анализировать только один канал. Пакетный анализ можно выбрать здесь, если вы используете полностью автоматизированную последовательность анализа, параметры которой были проверены, чтобы дать удовлетворительные результаты.
    1. На вкладке «Детектор» выберите «DeTect яркие пятна на темном фоне ", затем выберите подходящую шкалу и чувствительность. Сделайте это, проверив различные настройки и перекрестное обнаружение пятна как в контрольном, так и в экспериментальном образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для изображения с разрешением 2048 x 2,048 и размером пикселя 0,12 мкм 2 порог уровня 2 с чувствительностью 25-100, как правило, подходит, но каждый маркер SG должен испытываться эмпирически. Настройте обнаружение пятна так, чтобы в необработанном контрольном образце пятна не были обнаружены, а в экспериментальной выборке с SGs учитывались все малые и большие SG.
    2. На вкладке ROI выберите предлагаемый ROI из последовательности. На вкладке «Фильтрация» выберите «Нет фильтрации». На вкладке «Вывод» выберите соответствующий выход.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор параметра Включить конкретный файл полезен для сохранения различных условий обнаружения или разных каналов. Выбор для экспорта двоичного изображения и исходного изображения с ROI и обнаружение - это helДля анализа контроля качества.
    3. Выберите «Удалить предыдущие точки, отображаемые как ROI». Выберите папку для сохранения файла, нажав кнопку «no file selected». На вкладке «Экран» выберите нужные параметры. Нажмите «Начать обнаружение».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Будет создана папка с именем и выбранным местоположением, которая содержит экспортированные параметры обработки изображений. Эти изображения будут перезаписаны для каждого тестируемого нового состояния. Чтобы сохранить изображения, переименуйте папку, чтобы создать новую папку или перенести изображения из папки сохранения в новую папку. Для контроля качества изображений полезно выбрать метку обнаружения дисплея, номер обнаружения ROI и номер ROI и имя.
  7. Консолидируйте и сохраните данные для разных параметров, используя созданную электронную таблицу для каждого тестируемого изображения или условия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры для анализа включают количество SG на ROI, площади поверхности SG и максимум SGImum, средняя и минимальная интенсивности.
  8. Перенесите данные и проанализируйте с помощью программы анализа, способной анализировать, отображать и определять статистическую значимость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы объяснить и продемонстрировать протокол, описанный в этой рукописи, мы охарактеризовали изображение индуцированных клотримазолом SGs в клетках HeLa, инфицированных или не имеющих цитозольного патогена S. flexneri . Схема схемы представлена ​​на рисунке 1 и включает вирулентные и авирулентные S. flexneri, просеянные на планшетах Конго, приготовление бактерий, инфекцию, добавление экологического стресса, фиксацию образца и окрашивание, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол описывает индукцию, локализацию и анализ СГ в неинфицированных клетках и клетках, инфицированных цитозольным патогеном S. flexneri, в присутствии или отсутствии экзогенного стресса. Используя бесплатное программное обеспечение для обработки изображений, протоколы позволяют точно определить качественный и количественный анализ формирования SG для выявления и статистического устранения различий в данных фенотипах.

В протоколе есть несколько критических шагов д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

PS является получателем гранта Гран-при Билла и Мелинды Гейтс OPP1141322. PV был поддержан стипендией Швейцарского национального научного фонда «Early postdoc Mobility» и постдокторской стипендией Ру-Кантарини. PJS поддерживается грантом HHMI и ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Primary Антитела
eIF3b (N20), происхождение козы Santa Cruzsc-16377Надежный и широко используемый маркер SG. Цитозольное окрашивание позволяет провести разграничение клеток. Разведение 1:300
eIF3b (A20), происхождение козы Santa Cruzsc-16378Та же мишень, что и eIF3b (N20) и в наших руках была идентична eIF3b (N20). Разведение 1:300
eIF3A (D51F4), происхождение кролика (MC: моноклональный)Cell Signaling3411Входит в состав мультибелкового комплекса eIF3 с eIF3b. Разведение 1:800
eIF4AI, происхождение козы Santa Cruzsc-14211Рекомендовано (Ref # 13). Разведение 1:200
eIF4B, происхождение кроликаAbcamab186856Хороший маркер гранул стресса в наших руках. Разведение 1:300
eIF4B, происхождение кроличьихклеток Signaling3592Рекомендовано Ref # 13. Разведение 1:100
eIF4G, происхождение кроликаSanta Cruzsc-11373Широко используемый маркер SG. (Ссылка # 13): может не работать хорошо в клеточных линиях мыши. Разведение 1:300
G3BP1, происхождение кролика (MC: моноклональный)BD Biosciences611126широко используемый маркер SG. Разведение 1:300
тиа-1, происхождение козы Santa Cruzsc-1751Широко используемый маркер SG. Также может быть найден в телах P при наличии SG (Ref # 13). Разбавление 1:300
Alexa-конъюгированные вторичные антитела
A488 anti-goat, происхождение осликThermo FisherA-11055Cross абсорбированный. Разведение 1:500
А568 антикозлятник, происхождение осликТермо ФишерА-11057Кросс абсорбированный. Разведение 1:500
A488 анти-мышь, происхождение ослицаThermo FisherA-21202Разведение 1:500
A568 анти-мышь, происхождение ослицаThermo FisherA10037Разведение 1:500
A647 анти-мышь, происхождение ослицаThermo FisherA31571Разведение 1:500
A488 анти-кролик, происхождение ослица ThermoFisherA-21206Разведение 1:500
A568 антикроличий, происхождение оселThermo FisherA10042Разведение 1:500
<сильный>Другие Реагенты
Shigella flexneriДоступен в различных лабораториях по запросу
Триптон Казеин Соя (TCS) бульонBD Biosciences211825Стандартная питательная среда для Shigella, применение - бактериальный рост
TCS агарBD Biosciences236950Стандартный ростовой агар для шигеллы, применение - рост бактерий
Congo redSERVA Electrophoresis GmbH27215.01Инструмент для удаления шигеллов, потерявших вирулентность плазмида, применение - рост бактерий
Poly-L-лизин (PLL)Sigma-AldrichP1274Полезно для покрытия бактерий для усиления инфекции, применение - инфекция
ГентамицинSigma-AldrichG1397Селективное уничтожение внеклеточных, но не цитозольных бактерий, применение - инфекция
HEPESLife Technologies15630-056PH буфер полезен при инкубации клеток при РТ, применение - клеточная культура
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies31885Стандартная питательная среда для клеток HeLa, применение - клеточная культура
Фетальная телячья сыворотка (FCS)BiowestS1810-1005% добавка для среды для культивирования клеток HeLa, применение - клеточная культура
Заменимые аминокислоты (NEAA)Life Technologies11140разведение 1:100 для среды для культивирования клеток HeLa, применение - клеточная культура
DMSOSigma-AldrichD2650Разбавитель реагента, применение - клеточная культура
АрсенитнатрияSigma-AldrichS7400Мощный индуктор гранул напряжения (Примечание: высокотоксичный, требуется специальное обращение и утилизация), применение - индуктор
напряжения КлотримазолSigma-AldrichC6019Мощный индуктор гранул напряжения (Примечание: опасность для здоровья, требуется специальное обращение и утилизация), применение - индуктор напряжения
Параформальдегид (PFAElectron Microscopy Scences157144% PFA используется для стандартной фиксации клеток, применение - фиксация
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Используется при 0,03% для пермеабилизации клеток хозяина перед иммунофлуоресцентным окрашиванием, применение - пермеабилизация
A647-фаллоидинаThermo FisherA22287Разведение происходит в 1:40, лучше всего добавляется во время вторичного окрашивания антителами, применение - окрашивание
DAPISigma-AldrichD9542Окрашивание нуклеидной кислотой используется для визуализации как ядра хозяина, так и бактерий, применение - окрашивание
парапленкиSigma-AldrichBR701501Парафиновой пленки подходит для иммунофлуоресцентного окрашивания покровных стекол, применение - окрашивание
Prolong GoldThermo Fisher36930Прочная монтажная среда, которая хорошо подходит для большинства флуорофоров, применение - монтаж
MowiolSigma-Aldrich81381Дешевая и надежная монтажная среда, которая хорошо подходит для большинства флуорофоров, применение - монтаж
24-луночный планшет для клеточных культурSigma-AldrichCLS3527стандартные планшеты для тканевых культур, применение - клеточная культура
12 мм  стеклянные покровные стеклаNeuVitro1001/12Поддержка клеточных культур для иммунофлуоресцентных применений, применение - клеточная поддержка
щипцамиSigma-Aldrich81381Дешевый и надежный монтажный материал, который хорошо подходит для большинства флуорофоров, применение - монтаж<
strong>Программы и оборудование
PrismGraphPad Программное обеспечениедля анализа данных и построения графиков с надежными возможностями статистического тестирования, применение - анализ данных
Leica SP5Leica MicrosystemsConfocal microsope, применение - изображение приобретение
ImarisBitplaneПрофессиональная программа анализа изображений, приложение - анализ данных
ExcelMicrosoftПрограмма анализа данных и построения графиков, приложение - анализ данных

Ссылки

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788(2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

G3BP1EIF3BHeLaShigella flexneri

Похожие статьи