Лазеры часто используются в исследованиях клеточного ответа на повреждение ДНК. Тем не менее, они генерируют повреждения которых расстояние, частоту и столкновения с вилками репликации редко характеризуются. Здесь мы описываем подход, который позволяет определить эти параметры с лазерными локализованы interstrand сшивок.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одно Молекула Анализ лазерных локализованные псоральны аддукты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Повреждение ДНК реагирование (РДР) было широко охарактеризовано в исследованиях двойных разрывов ДНК (DSBs), индуцированных лазерный микро облучением пучка в живых клетках. DDR, чтобы спираль искажая ковалентные модификации ДНК, в том числе interstrand сшивок ДНК (МКСТ), не так хорошо определены. Мы изучали DDR стимулируются ICL, локализованных с помощью лазерной фотоактивации immunotagged псораленов, в ядрах живых клеток. Для решения фундаментальных вопросов о распределении аддукта и вилка репликации столкновениях, мы совместили локализацию лазера с двумя другими технологиями. ДНК-волокна часто используются для отображения хода вилки репликации с помощью иммунофлуоресценции аналогов нуклеозидов, включенных в течение коротких импульсов. Immunoquantum точка была широко использована для одного изображения молекулы. В новом подходе, ДНК-волокна из клеток, несущих лазерные локализованы ICLS распространяются на предметные стекла микроскопа. В помеченном МКСТЕ отображается immunoquantum точек и йе между поражением расстояние определяется. Репликация вилочные столкновения с ICL, можно визуализировать и различные модели сталкиваются с идентифицированы и количественно.
Введение
ДНК находится под постоянным нападением от экзогенных агентов, таких как облучение ультрафиолетового света,, токсины окружающей среды, продукты сгорания и т.д. Кроме того, он также атакован эндогенными радикальных частицами, полученных путем окислительного метаболизма. Все они имеют потенциал , чтобы химически или физически нарушить целостность ДНК 1. Возмущения в геноме может активировать ДНК Damage Response (DDR), а набор и пост трансляционной модификации каскада с сотнями, если не тысячи, белков и микроРНК, участвующих в репарации повреждений, регуляции клеточного цикла, апоптоза, старении и воспалительных путей 2. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение Dig-TMP
- Смешайте 50 мг (0,18 ммоль) 4'-хлорметил-4,5' , 8-trimethylpsoralen и 590 мг (2,7 ммоль) 4,7,10-триокса-1,13-tridecanedi-амина в сухом 25 - мл круглодонную -bottom колбу в атмосфере азота. Добавляют 10 мл толуола и обратным холодильником в течение 12 ч. Растворитель удаляют на роторном испарителе при пониженном давлении.
- Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле. Элюируют колонку хлороформом, метанолом и 28% -ным раствором аммиака (9: 1: 0,5). Растворитель выпаривают в роторном испарителе при пониженном давлении, и восстанов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Лазерные локализованные Диг-ТМП (Фигура 1А) ICLS могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против DIG-тега , связанного с псорален. Несмотря на то, лазер может быть направлена на удар в зоне любого контура, полосы не являются «естественной» формой в клетках, а также законные сигналы могут быть легко отличить от артефактов из-за неспецифическим связывание с первичными или вторичными антителами. Эта функция полезна при использовании антител менее совершенная сп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Технология лазерной локализации требует использования адгезивных клеток с ядрами, которые видны при ярком микроскопии. Мы попытались прикрепить неадгезированных клетки, такие как первичные лимфоциты, или свободно присоединенные культивируемые клетки, такие как AD293, к стеклянной поверхности с адгезивными клетками препаратов, такими как полилизин или коллаген, или более сложными смеси. Хотя эти процедуры могут связывать клетки к поверхности, мы находим, что они обычно остаются округлыми, что делают его очень трудно соср.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано частично исследовательской программы Intramural НИЗ Национального института по проблемам старения (Z01 AG000746-08) и Фонд исследований Фанкони.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дигоксигенин NHS эфир | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| диаминогликоль | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамин |
| Хлороформ | Acros Organics | 423550040 | |
| метанол | Fisher Scientific | A4524 | |
| Аммиачный раствор | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC пластины | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Стеклянная колонна Flass 24/40, 100 мл | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 вращающийся дисковый конфокальный микроскоп, оснащенный автоматизированным столиком и камерой контроля окружающей среды и держателем пластины | Perkin Elmer | с программным обеспечением Volocity | |
| Micropoint Galvo | Технологии | с азотным импульсным лазером | |
| красильная ячейка | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 краситель | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 мм стеклянные ботоммм пластины 1,5 покровного стекла, диаметр стекла 10 мм, непокрытые слайды | микроскопа Matek | P35G-1,5-10-C | |
| Новый | Часть | поставки # 5070 | Новые силановые слайды |
| Мышь против антитела BrdU (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 из 40 |
| Крыса против антитела BrdU (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 в 200& НБСП; |
| Антитело к кролику | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 из 200 |
| Q-dot 655 козий против кролика IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 из 5,000 |
| AF647- козий против крысы IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 из 100 |
| AF488-козий против мыши IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 из 100 |
| Zeiss эпифлуоресцентный микроскоп A200 | Zeiss | с программным обеспечением Axiovision | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Ссылки
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
