Парные шарик и магнит массив для литья Microwells с переменной геометрией вогнутый

Summary

Эта рукопись вводит надежный метод изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Использование магнитных сил, стальных шариков и массив через отверстие, несколько сотен microwells были сформированы в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см.

Abstract

Сфероида культура является полезным инструментом для понимания клеточного поведения в том, что он обеспечивает в естественных условиях-как трехмерной среде. Различные методы производства сфероида такие как non клей поверхностей, спиннер колбы, висит капли и microwells были использованы в исследованиях по вопросам взаимодействия в ячейке, иммунной активации, наркотиков скрининг, стволовых дифференцировки клеток и органоид поколения. Среди этих методов microwells с трехмерной геометрии вогнутой завоевали внимание ученых и инженеров, учитывая их преимущества единообразного размера сфероида поколения и легкость, с которой может быть ответы отдельных сфероидов мониторинг. Даже несмотря на то, что были предложены эффективные методы такие, как использование гибких оболочек и льда литографии, эти методы понести серьезные недостатки, такие как сложно контролировать размеры шаблона, достижение высоких пропорций и производство большие области microwells. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы предлагаем надежный метод для изготовления вогнутой microwells без необходимости в дорогостоящих объектов. Этот метод использует массив через отверстие 30 x 30, несколько сотен микрометр порядка стали бусы и магнитные силы для изготовления 900 microwells в подложке полидиметилсилоксан (PDMS) 3 x 3 см. Чтобы продемонстрировать применимость нашего метода ячейку биологических приложений, мы культивировали жировых стволовых клеток для 3 дней и успешно производится с помощью нашей платформы микрорезервуар сфероидов. Кроме того мы провели магнитостатических моделирования для изучения механизма, согласно которому магнитная сила была использована для ловушку стальные шарики через отверстия. Мы считаем, что предлагаемый микрорезервуар изготовление метод может применяться для многих сотовых исследования, основанные на сфероиде таких наркотиков скрининг, регенерации тканей, дифференцировки стволовых клеток и рак метастазы.

Introduction

Клетки, превратилась в форму сфероида больше похожи на реальные ткани в организме, чем двумерной плоскости культуры¹. Учитывая это преимущество, использование сфероидов был принят для улучшения деятельности по изучению взаимодействия в ячейке^2,3, иммунной активации⁴, наркотиков скрининг⁵и⁶дифференциации. Кроме того недавно были применены к organoids (рядом физиологических трехмерные (3D) ткани), которые являются очень полезными для изучения человеческого развития и болезней⁷сфероидов, включающий несколько типов клеток. Некоторые методы были использованы для производства сфероидов. Простейший метод предполагает использование поверхности без клея, таким образом, что клетки агрегировать друг с другом и формы сфероидов. Петри блюдо можно лечить с бычьим сывороточным альбумином, плюрониевого F-127 или гидрофобный полимер (например поли 2-hydroxyethl метакрилат) сделать его поверхности не клей⁸⁹. Спиннер фляжка метод является еще одним известным средством производства большого количества сфероидов^10,11. В этом методе клетки проходят в подвеска, помешивая, чтобы помешать им стать присоединяется к подложке. Вместо этого плавающей клетки агрегат в форме сфероидов. Поверхности метод non клей и паук фляжка метод может производить большое количество сфероидов. Однако они действуют ограничения, включая трудности в контролировать размер сфероида, а также отслеживание и мониторинг каждого сфероида. Как средство для таких проблем, другой метод производства сфероида, а именно, висит падение метод может быть занятых¹². Это включает в себя хранение клеток подвеска капель на внутренней стороне крышки культуры блюдо. Эти капли обычно 15-30 мкл в размерах и содержит около 300 до 3000 клетки¹³. Когда крышка инвертируется, капли проводятся в месте поверхностного натяжения. Условия микрогравитации в каждой капле концентрируется клетки, которые затем образуют единый сфероидов на интерфейсе свободной жидкости воздух. Преимущества висит метод drop являются, что он предлагает хорошо контролируемых размер распределения, хотя это легко отслеживать и контролировать каждый сфероида, по отношению к не клей поверхности и spinner колбу методы. Однако, этот метод создает один недостаток в том, что массовое производство сфероидов и сам процесс производства является чрезмерно труда интенсивный.

В микрорезервуар массив является плоской пластины с многих микро размера скважин, каждый диаметром от 100 до 1000 мкм. Принцип производства сфероида при использовании microwells похож на поверхности метода non клей. Преимущества включают в себя тот факт, что microwells обеспечивают пробелы между microwells для разделения клетки или сфероидов, таким образом, что это легко контролировать размер сфероида, а также делает его легко контролировать каждый один сфероида. С большое количество microwells также возможна сфероида высок объём производства. Еще одним преимуществом microwells является возможность формы колодцы различной формы (шестигранные, цилиндрические, тригональная призматических) в зависимости от уникальных экспериментальных целей пользователей. Как правило однако, трехмерные (3D) вогнутые (полусферической) фигуру или рассматривается как наиболее подходящие для производства единообразного размера одного сфероидов. Таким образом, полезность вогнутые microwells было сообщено для многих исследований биологии клетки таких изучения cardiomyocyte дифференциация¹⁴эмбриональных стволовых клеток, секрецию инсулин островковых клеток кластеров¹⁵, Ферментативная активность гепатоцитов¹⁶и резистентности опухоли сфероидов¹⁷.

К сожалению изготовление microwells часто требует специализированных micropatterning услуги; обычные методы на основе фотолитографии требуют облучения и развивающихся объектов, в то время как реактивного ионного травления-методы, основанные нуждаются плазмы и ионно лучевого оборудования. Такое оборудование является дорогостоящим, вместе с процессом изготовления сложных представляет высокий барьер для вступления для биологов, которые не имеют доступа к микротехнологии. Для преодоления этих проблем, другие эффективные методы такие, как лед литографии¹⁸ (с использованием замороженных водных капель) и гибкой мембраны метод¹⁴ (с помощью мембраны, через отверстие субстрата и вакуума) было предложено. Однако эти методы также понести серьезные недостатки, такие как трудно контролировать размеры шаблона, достижение высокой пропорции и производство большей площади microwells.

Для преодоления вышеуказанных вопросов, мы предлагаем метод изготовления Роман вогнутой микрорезервуар использованием подложке через отверстие, стальные шарики и массив магнит. С помощью этого метода, сотни вогнутой сферических microwells могут быть изготовлены, используя механизм магнитной силы оказали помощь самоблокирующихся металлические бусины (рис. 1). Процесс изготовления предполагает использование очень мало дорогих и сложных объектов и не требует многих передовых навыков. Таким образом даже неквалифицированных лиц можно легко провести этот метод изготовления. Для демонстрации использования предложенного метода, человека жировой производные стволовые клетки были культивировали в вогнутые microwells производить сфероидов.

Protocol

1. Подготовка через отверстие массив алюминиевые пластины и магнит массива

1. Подготовить два 50 мм x 50 мм (или более) алюминиевых пластин. Толщина каждого листа был 300 мкм, что составляет половину диаметра шарика.
2. Формируют массив через отверстие 30 x 30 на одном из алюминиевых пластин с помощью CNC вращающихся гравер с Φ550-мкм микро сверло с 30 мм/сек скорость окунуться и 8000 об/мин, скорость вращения шпинделя. Расстояние между каждой дыры (центр) был 1 мм (рис. 1a и 2a рисунок, я).
3. Формируют массив 30 х 30 мкм Φ750 через отверстия на алюминиевой пластине, используя ту же процедуру, что и описанные в 1.2 (рис. 1a и 2a рисунок, ii).
4. Приложите две пластины друг друга с помощью клейкой ленты и образуют Φ3 мм выравнивание отверстий на каждом из четырех углов двух алюминиевых пластин.
5. Замочите алюминиевых пластин в 15% серной кислоты для 12 h для очистки их поверхностей. Так как тонкий слой оксида алюминия на поверхности алюминия делают коррозии, диаметр отверстия и Толщина пластины этой кислоты лечения не изменяются.
6. Формируют массив 30 × 30 1 x 1 x 1 мм неодимовые магниты (с магнитной силой 0,363 N). Убедитесь, что каждый магнит противоположной полярности для своего соседа. Для предотвращения взлома или рассеяния магнит массива, прикрепите алюминиевой пластины 30 x 30 мм в нижней части магнита массива с помощью двухсторонней ленты (рис. 2a, iii и врезные в Рисунок 2).

2. шарик процесс треппинга

1. Выравнивание и укладывают два алюминиевых пластин (Топ пластины: плита 750-мкм отверстие, Нижняя пластина: 550-мкм отверстие пластины) с использованием подготовленных выравнивание отверстий в четырех углах каждой пластины (рисунок 1b).
2. Блокировки две пластины вместе, вставив м3 болты в отверстия выравнивание, а затем закрепите болты с гайками (рис. 1b).
3. Стек алюминиевой пластины Ассамблеи на массиве подготовленный магнит (рис. 1b, 2bи 2 c). Совместите массив магнитов и массив через отверстия в алюминиевых пластин во время процесса укладки. Затем используйте Скотч исправить положение магнита массива.
4. Место достаточное количество Φ600 мм SUJ2 стали бисер на собрании пластины и манипулировать бисер с помощью акрила (или неметаллические) пластины такой шарик будет поглощенной в каждое отверстие (рис. 1 c, 1 dи 1e) при одновременно Удаление избыточного бусы, которые не подали в отверстия.
5. Осторожно снимите верхнюю крышку во избежание нежелательных рассеяния и вывих захваченных бусы (Рисунок 1f).

3. вогнутые микрорезервуар изготовление

1. Переместите вогнутой микрорезервуар плесень, производимых в шагах 2.1-2.5, выше, в чашке Петри.
2. Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) мономера и отвердителя согласно инструкции производителя¹⁹ с мономером PDMS: лечить агента в соотношении 10:1.
3. Де газ PDMS смесь с помощью эксикаторе и вакуумный насос удалить любые пузыри в ловушку в смеси PDMS.
4. Вылейте смесь PDMS в вогнутое микрорезервуар плесень и де газ снова, используя ту же процедуру, что описано в 3,3 (Рисунок 1f).
5. Выпекать PDMS смесь на конфорку при 80 ° C 2 h сформировать шарик встроенный PDMS субстрата (рис. 1 g).
6. Удаление вылечить PDMS субстрат из формы (рис. 1 g). В процессе удаления спрей метанола с помощью стиральные бутылки для отсоединения PDMS субстрата от плесени.
7. С помощью Φ15 мм х 2 мм магнит, удалите захваченных стальные шарики из PDMS субстрата (рис. 1 h). Для этого процесса может использоваться любой магнит, который является достаточно сильным, чтобы извлечь бусы из субстрата PDMS.

4. сфероида культура

1. Вырежьте вогнутой микрорезервуар узорные PDMS субстрат с помощью удар биопсия Φ14 мм для установки в 24-ну пластины в этом исследовании.
2. Стерилизация полученный субстрат PDMS мм Φ14 в стерилизатор-автоклав при 121 ° C и 15 psi.
3. Место стерилизованные PDMS субстрата в 24 хорошо плиту.
4. Покройте весь субстрат PDMS раствором 4% (w/v) плюрониевого F-127 на ночь для предотвращения клетки привязанность к поверхности микрорезервуар. Во время процесса покрытия удалите все пузырьки воздуха, захваченного в вогнутые microwells закупорить или с помощью ультразвуковой очистки.
5. Очистить решение F-127 три раза с помощью фосфат амортизированное saline (PBS).
6. 1 мл раствора клеток средний (Дульбекко изменение орел средняя) (которая содержит 2 х 10⁶ клеток) на подложке PDMS семян. Обратите внимание, что плотность посева может быть изменена согласно целевой сфероида размер и/или целевой тип ячейки. Здесь были использованы жировой производные стволовые клетки (ASC).
7. Аспирационная 1 мл среды, используя 1000 мкл пипетки для удаления любой избыток клетки, которые не попали в microwells (рис. 3).
8. Инкубировать клетки на 36,5 ° C, влажность > 95% и 5% CO₂ состояния. В случае ИСС, используемые в нашем исследовании клетки совокупные на сфероиде в 48 ч.

Results

Выпуклая форма и шаблон микрорезервуар успешно были сфабрикованы, выполните шаги 2.1 до 3,7. (Рис. 4). Коммерческие стальных бусины попали в массиве 30 x 30 через отверстие. Бусины были проведены плотно без каких-либо пробелов между бусины и соответствующие сквозные отверстия (рис. 4a). Формы изготовлены вогнутой микрорезервуар является вогнутой полусферической, с диаметром 600 мкм, который является таким же, как из стальной шари...

Discussion

Основная задача этого метода изготовления был безопасной фиксации бусины в массиве через отверстие в алюминиевой пластине. Для решения этой задачи, исправить бисер надежно, как показано на рисунках 6 и 7был использован магнитная сила в виде массива магнит 30 x 30. Магнитная индукция магнит массива, который имеет противоположной полярности, сильных в центре каждой поверхности магнита. Потому что сила магнитной силы зависит от плотности потока, бисер руководствовались в центр верхней повер...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Роторный гравер с ЧПУ	Roland DGA	EGX-350
Микросверло	HAM Prä zision	30-1301 TA	Φ 0,55 и 0,75 мм
Серная кислота 98%	Daejung	7683-4100	Для очистки алюминиевой пластины.<бр/> Разбавить дистиллированной водой с 15% раствором
Неодимовый магнит	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 мм
Шарик подшипника	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μ m стальной шарик
Полидиметилсилоксан (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Разбавить фосфатным солевым буфером до 4% (w/v)
раствора модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM)	ATCC	30-2002
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (D-PBS)	ATCC	30-2200
Фетальная бычья сыворотка	ATCC	30-2020
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой	ATCC	ATCC PCS-500-011