Этот протокол описывает модель мыши с централизованной катетеризацией длительного критического заболевания. Мы сочетаем лигирование слепой кишки и метод пункции для индуцирования сепсиса с использованием центральной венозной линии для введения жидкостей, лекарств и питательных веществ, чтобы имитировать клинические условия у человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование центрального венозного линии для жидкостей, лекарственных средств и питательных веществ управления в мышиной модели критических заболеваний
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает централизованно катетеры модели мыши длительного критического заболевания. Мы объединяем слепую кишку перевязки и метод прокола, чтобы вызвать сепсис с использованием центральной венозной линии для жидкостей, лекарственных препаратов и введения питательных веществ, чтобы имитировать клинические параметры человека. Тяжелобольные пациенты требуют интенсивной медицинской помощи для того, чтобы выжить. В то время как большинство пациентов будет восстанавливаться в течение нескольких дней, около четверти пациентов необходима длительная интенсивной терапии и имеет высокий риск смерти от не-решения полиорганной недостаточности. Кроме того, длительный этап критического заболевания является пронизанной глубокой мышечной слабости и эндокринных и метаболических изменений, из которых патогенез в настоящее время не полностью изучены. Наиболее широко используемых животных модель в критическом исследовании ухода является слепой кишки перевязки и пункции модель, чтобы вызвать сепсис. Это очень воспроизводимая модель, с острыми воспалительными и гемодинамическими изменениями, подобными человеческим сенсестренка, которая предназначена для изучения острой фазы критического заболевания. Тем не менее, эта модель пронизанный высокой летальности, которая отличается от клинической ситуации человека, и не развитом для изучения длительной фазы критического заболевания. Таким образом, мы адаптировали технику, помещая центральный венозный катетер в яремной вене позволяет нам управлять клинический значимой поддерживающей терапией, чтобы лучше имитировать человеческую клиническую ситуацию критической болезни. Эта модель мыши требует обширной хирургической процедуры и ежедневный интенсивный уход за животными, но это приводит к соответствующей модели острой и длительной фазы критического заболевания.
Введение
Критические болезни является болезненное состояние, в котором функция одного или нескольких органов и систем затруднено в той степени, что пациент умрет, если интенсивная медицинская помощь не назначается. В то время как первопричины для поступления в отделение интенсивной терапии (ОИТ) может варьироваться, начиная от травмы, осложненной операции, ожогов, заболевание обострений до сепсиса, все тяжелобольные пациенты страдают от клеточного повреждения, вызванных гипоперфузиями, гипоксией и чрезмерного воспалением среди других , что приводит к полиорганной недостаточности. Большинство пациентов выживают их острый инсульт, но важная часть пациентов не сразу восстановиться и нуждаются в длительной интенсивной терапии. Они имеют высокий риск смерти из-за отказа разрешения полиорганной недостаточности. Кроме того, длительный этап критического заболевания является пронизанным глубокой мышечной слабостью и эндокринным и метаболическими изменениями, из которых патогенез в настоящее время не полностью изучен.
Несколько гОден модели используются в условиях интенсивной исследовательской помощи. Два основном используемые модели являются экзогенное введение липополисахарида (LPS) и слепой кишки перевязки и пункции (CLP). Обе модели разработаны для имитации острой фазы сепсиса, определяемый как угрожающей жизни дисфункции органов , вызванной дизрегуляции ответ хозяина на инфекцию, и одна из основных причин для поступления в отделении интенсивной терапии во всем мире 1, 2. Модель LPS имеет несколько недостатков , как это только скоротечно влияет на высвобождение цитокинов и состояние гемодинамики животного 3. В отличие от людей, грызуны также являются особенно устойчивыми к эндотоксина и использование «» высоких доз эндотоксина необходимо производить гипотензии и смертности, тем самым дальнейшее повышение озабоченности обоснованности этого метода 4, 5. Другая модель, слепой кишки перевязки и пункции модель (CLP)имеет лигирование части слепой кишки с последующим проколом сквозными и сквозным. Эта процедура вызывает полимикробную брюшную инфекцию с повреждением тканей, с последующей транслокацией бактерий в отделение крови. Это вызовет системную воспалительную реакцию и развитие сепсиса. Модель CLP была широко признана в качестве животной модели острой критической болезни , которая воспроизводит основные черты сепсиса: гипервоспаления, вазодилатацию, гипотонии и повышение сердечного выброса 6, 7. Однако эта модель не позволяет изучать не-решения полиорганной недостаточности, гипотрофии мышц и эндокринных и метаболических изменений, характерных для длительной фазы критического заболевания. Кроме того, в последнее время валидность мышиных моделей для критических заболеваний были поставлены под сомнение, поскольку выводы из мышиных моделей не всегда могут быть переведены к установке 8 человек, 9, 10. Возможное объяснение может быть то, что поддерживающая терапия, которая предоставляется тяжелобольными пациентами человека существенно отличается от ухода, который предоставляется тяжелобольной мышей.
Поэтому, чтобы более близко напоминает человеческую установку и позволить исследование длительной фазы критической болезни, мы разработали модель мыши, которая имитирует острую интенсивную терапию, как указано для человека, например, обширное внутривенного введения жидкости и лечения антибиотиков, и которая позволяет администрировать поддерживающую терапию для того, чтобы пережить длительную фазу критических заболеваний, таких как нутритивной поддержки. Для этой цели мы адаптировали модель мыши CLP-индуцированной сепсисом, являющийся золотым стандартом для сепсиса, и помещают центральную венозную линию, которая позволяет введение жидкостей, питательных веществ и лекарственных средств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол был утвержден университетом совета Левен этической экспертизы для исследования животных.
1. Приготовление венозной линии
- Подготовьте кончик венозного катетера, быстро погружая среднюю часть 60 см microrenathane (MRE) насосно-компрессорных труб в горячем (> 220 ° С) кунжутного масла. Впоследствии растянуть среднюю часть трубки для получения узкого диаметра (наружный диаметр (OD) <0,5 мм), осторожно перемещая концы трубок на расстоянии друг от друга.
- Используйте скальпель лезвие , чтобы разрезать трубу на две части по 30 см каждый (смотри рисунок 1, таблица 1).
- Подключение трубки к MRE полиэтиленовых труб PE10 с помощью соединителя полиэтилена PE50 и подключить эту PE10 трубку к нижней части вертлюга. Подключение верхней части вертлюга к PE10 трубкам и подключить это к заглушке игле Luer с PE50 трубками соединителя в соответствии с фиг.1.
- Нанести сильный быстро ACTiнг адгезивный клей для всех соединений и проверить на наличие утечек катетера путем продувки воздухом. Газ стерилизовать катетер перед использованием.
Рисунок 1: Строительство венозных линий. Венозные линии получают путем растяжения трубки MRE до небольшого диаметра и соединения его с помощью полиэтиленовой трубки с грызунами поворотного устройства. В Таблице 1 для получения инструкций по длине различных частей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| легенда | длина | объем |
| 1) Люэр заглушка игла 22г | ||
| 2) РЕ50 - полиэтилен 0,023" х 0,038" | 5 см | 13 мкл |
| 3) PE10 - полиэтилен 0,011" х 0,024” | 50 см | 30 мкл |
| 4) грызуна Поворотный 20 G | ||
| 5) ПЭ-10 | 15 см | 9 мкл |
| 6) РЕ-50 (разъем) | 5 см | 13 мкл |
| 7) MRE025 Совет растянуты microrenathane 0,025" х 0,012" | 30 см | 27 мкл |
| Общая сумма | 105 см | 92 мкл |
Таблица 1: Строительство венозных линий. В данной таблице приведены пояснения для фиг.1.
2. Анестезия и предоперационного Handling
- Используйте 24-недельный летний мужчина C57BL / 6J (27 - 32 г).
Примечание: Мы используем 24 недель мышам (зрелые взрослые) в этом возрасте лучше соответствует со средним возрастом пациентов интенсивной терапии. Мы используем только самцов мышей, чтобы избежать циклического влияния эстрогенов. Этот метод можно также использовать на молодых животных (проверено в 16-недельным мышам) и самок, если предпочтительнее. - Стерилизовать все хирургические инструменты перед использованием. Промыть стерильный самодельный венозный катетер физиологического раствора, чтобы удалить пузырьки воздуха и испытать на проходимость и потенциальные утечки.
- Вырезать металлическую проволоку (диаметр 0,8 мм) длиной 80 см, в два раза его сгибанием и сделать петлю. Свинец 3 жемчужины более удвоенного провода к петле. Прикрепите катетер к металлической проволоке, направляя кончик катетера через 3 жемчуг.
Примечание: Крепление металлической проволоки необходимо для вращения поворотной, к которому подключен катетер. Таким образом, мышь может свободно перемещаться, не блокируя венозную линию. - Обезболить мOuse путем внутрибрюшинного (IP) введения смеси 0,03 мл кетамина (100 мг / кг) и 0,02 мл ксилазина (13 мг / кг). Убедитесь, что обезболивание является адекватным путем проверки на отсутствие рефлексов. Осторожно потяните язычок мыши за щипцами, чтобы избежать удушья при глотании языка.
Примечание: Если после того, как 10 мин, мышь до сих пор попытки вывести его конечности дают дополнительный кетамин в 0,01 мл болюса. - Бритье хирургической области живота, в то числе вентральной стороны шеи (треугольник между подбородком, грудиной и ключицей), а также между лопатками у основания головки).
- Поместите мышь в положении лежа на подогретую грелке, дезинфицирует кожу 70% -ный этанола и нанесите небольшое количество офтальмологических смазок, чтобы защитить глаза от высыхания. Инфильтрат хирургических участков (живот, шеи, спереди и сзади) с 0,2 мл ропивакаина (0,67 мг / кг).
- В то время как мыши все еще находится в положении лежа на животе, сделать небольшой надрез у основания спинной стороныголовы скальпелем или ножницами. Защита задних шейных мышц, и связать мышцы к петле крепления провода с 3,0 нейлоном, ведя 3,0 нейлоновой нити под мышцей.
- Поместите курсор на правой стороне. Сделайте небольшой вертикальный разрез в коже брюшной шеи скальпелем или ножницами. Под визуальным руководством, туннель 18-го калибра иглы подкожно через этот разрез в направлении вентральной разрез на спине сделанного ранее и нити катетер через иглу, чтобы экстериоризоваться его на брюшной стороне.
- Поместите курсор на его спине. Pass 3,0 нейлоновой нити позади верхних резцов мыши и лент его до грелки. Зафиксировать голову в маске для подачи кислорода (2 л / мин). Закрепить мышь в растянутом положении, записывая на пленку вниз хвост и две передние конечности.
Примечание: Если кетамин-ксилазин анестезия сам по себе не является достаточной, при вдыхании изофлуран (0,5 - 1,5%) может быть доставлен во время операции.
- Поместите мышь под рассекает микроскопом. В разрез, сделанный ранее в вентральной шеи, нежно дразнить жировой ткани и желез прочь с пинцетом до яремной вены не могут быть визуализированы.
- Грубо рассекает, чтобы освободить яремную вену из соединительной и подкожной клетчатки выше и вокруг судна, помещая кончик пинцета между веной и соединительной тканью и открытием щипцов многократно параллельно с веной. Таким образом, повреждение вены будет избежать.
- Изолировать яремную вену путем размещения тупых щипцов под веной. Поток три куска 3,0 шелковой нити под веной, положение одной части проксимальный к развилке яремной вены (черепных лигатура) и одной части, близкой к кивательной мышце (хвостовая лигатура). Затянуть черепную лигатуру и хвостовую лигатуру, чтобы растянуть вены и предотвратить чрезмерное кровотечение при размещении катетера. Tт.е. свободная вязь со средней резьбой, чтобы обеспечить легкое закрепление катетера позже.
- Использование микро-ножницы, надрезать вдоль вены между черепными и хвостовыми лигатурами и достаточно большой, чтобы пройти катетер. Возьмите катетер с пинцетом и вставьте катетер 11 мм в вену. Неплотно закрепить катетер, связывая от среднего лигатуры и подтвердить правильное размещение, осторожно промывки стерильного физиологического раствора.
- Безопасный катетер, крепко связывая от средней и хвостовой лигатуры вокруг сосуда и катетера. Наконечник концы хвостового и среднего лигатуры вместе, чтобы надежно закрепить катетер. Убедитесь в том, что узлы не пережать вены, путем промывки катетера после каждого узла сделал. И, наконец, связать каудально и краниально лигатуры. Закрыть разрез с 5,0 шелковыми швами.
4. слепой кишки Лигирование и прокол
- Сделать 1 см срединный разрез через кожу в нижней половине живота с скальпелем или ножницами;быть осторожным, чтобы не проникнуть в брюшную полость.
- Определение белой линии брюшной мускулатуры и сделать разрез межмышечного, чтобы получить вход в брюшную полость. Найдите слепую кишку, а также использовать тупые анатомические щипцы, чтобы изолировать слепую кишку и экстериоризоваться его.
- Лигирования слепой кишки на 50% от его длины с 3,0 шелковыми швами. Убедитесь в том, чтобы не перевязывать илеоцекального клапана так, что непрерывность кишечной сохраняется.
- Перфорируйте слепую кишку с 18-го калибра иглой с помощью одного сквозной и сквозной пункционного на полпути между лигированием и кончиком слепой кишки. После удаления иглы, выдавить небольшое количество фекалий от отверстия, чтобы обеспечить проходимость.
- Переставьте кишечник в брюшной полости, и закройте брюшины и кожу с 5,0 шелковыми швами.
Примечание: В среднем, новый стажер требует от 10 до 15 животных, чтобы иметь возможность поместить плавно венозный катетер и выполнять CLP в течение 45 мин. После периода обучения, анестезия / хирургия РелаTed смертность 10% можно ожидать.
5. Послеоперационное лечение и жидкости реанимация
- Поместите мышь в положении лежа на спине и закрепить катетер для крепления провода с лентой. Перемещение мыши в отдельную клетку. Используйте подставку с регулируемым зажимом для хранения поворотного устройства 25 см над мышью и прочно заклеивание свободной части крепления металлической проволоки к вращающемуся точке вертлюга.
- Приложить шприц, содержащий смесь сбалансированных коллоидов и кристаллоидов (1: 4) в венозную линию, чтобы начать инфузионную терапию.
- Поместите клетку в контролируемой температуре (27 ° C) для животных шкафа с 12 ч светлыми и темными циклами и начать внутривенную инфузионную терапию (10 мл / кг / ч) с помощью точного шприца с приводом инфузионного насоса. Обеспечить обогащение клетки, такие как гнездовой материал и деревянный брусок.
6. Отделение интенсивной терапии
- Через 6 ч после операции, подкожно вводят боль medicatioп и антибиотики (0,3 мл бупренорфин (0,15 мг / кг) и 0,2 мл имипенем (16.67mg / кг)). Примечание: После стандартной медицинской практике лабораторных животных, первая доза болеутоляющих дается до первоначального хирургического разреза, а затем по указанию ветеринарной политики учреждения. Подкожные инъекции следует тщательно вводили в подкожное пространство.
- Через 20 - 24 ч после инфузионной терапии, заменить Кристаллоиды / коллоиды от общего парентерального питания (6,67 мл / кг / ч).
Примечание: Полное парентеральное питание вводит (5,8 ккал / 24 ч) занимает около 40% суточной потребности в калориях мышея, похожего на раннюю калорийность пациентов в отделении интенсивной терапии. - Подкожно вводить обезболивающие и антибиотики (0,6 мл бупренорфин (0,3 мг / кг) и 0,2 мл имипенемы (16,67 мг / кг) каждые 12 ч в течение всего периода критической болезни.
- Проверьте животных по крайней мере каждые 3 ч в течение дня. Оценка страдания, давая больоценка на основе проверенных мышей гримасы масштаба 11. Активизировать мониторинг для животных с высоким болевым.
7. Конец эксперимента
Примечание: Об утверждении и рекомендации по уровню серьезности модели и руководящих принципов и политики для человека конечных точек следует искать из совета местного Institutional этической экспертизы для исследования животных.
Примечание: В случае нефункционального венозной линии, такие как блокированный катетер, делокализации катетера, проблемы с шприцевой насос, животное исключали из исследования и эвтаназии.
- В конце экспериментального периода, глубоко анестезию мыши с использованием смеси 0,03 мл кетамина (100 мг / кг) и 0,02 мл (13 мг / кг) ксилазина. Эвтаназии мыши, выведя кровь пункции сердца. Магазин оснастки образцы замороженной ткани, представляющие интерес при -80 ° С.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
C57BL / 6 мышей были сделаны в критическом состоянии, как описано выше. Мы проводили два эксперимента не для оценки выживаемости после CLP до двух временных точек: выживание до 5 дней (п = 15) и выживаемость до 7-я дня (п = 22) после CLP. Кривые выживаемости этих двух экспериментов существенно не отличались (не в сравнении до 5-й день), что указывает на воспроизводимость экспериментальной установки. Номера выжившие животных были найдены смерть или эвтаназия из-за идущим человеком конечны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы разработали более клинический значимыми мышиную модель критических заболеваний, путем объединения слепой кишки перевязки и пункционный метода, чтобы вызвать сепсис с использованием центральной венозной линии для жидкостей, лекарственных препаратов и введения питательных веществ. Это экспериментальная установка является воспроизводимым, позволяет исследовать длительную фазу критических заболеваний и приводит к стабильной смертности, тем самым имитируя человеческую клиническую ситуацию 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
GVdB, через Лёвенский университет (KU Leuven), получает долгосрочную поддержку структурных исследований от программы Methusalem, финансируемой фламандским правительством (METH08/07), и имеет грант Европейского исследовательского совета AdvG-2012-321670 от программы идей седьмой рамочной программы Европейского Союза. SET получил стипендию научного ассистента Исследовательского фонда Фландрии (FWO).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бупренорфин | Экуфар | Ветергезик 0,3 мг/мл | |
| C57BL/6 | Коллоиды Janvier labs | C57BL/6JRj | |
| Fresenius Kabi | Volulyte 6% | ||
| кристаллоидов | Baxter | Plasmalyte a viaflo | |
| Ethilon 3.0 | Ethicon | F3211 | |
| Imipenem | MSD | Tienam 500 мг порошок для инъекционной жидкости | |
| Изофлуран | Евровет | Изо-вет | |
| Кетамин | Евровет | Ниматек 100 мг/мл | |
| LocTite Супер клей3 все пластики | Rectavit | 119818 | |
| Mersilk 3.0 | Ethicon | L192 | |
| Mersilk 5.0 | Ethicon | F682 | |
| Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D. | Bioseb | MRE-025 | |
| olimel N7E | Baxter | ||
| PE10 - Полиэтилен .011" x .024" | Instech Solomon | BTPE-10 | |
| PE-50 трубка .023" x.038" | Instech Solomon | BTPE-50 | |
| Грызун вертлюг 20 г | Bioseb | RS-20G | |
| Ropivacaï ne | Astrazenica | Naropin 2 мг/мл | |
| Ксилазин | VMD | Ксилазина гидрохлорид 2% |
Ссылки
- Angus, D. C., van der Poll, T. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. R. Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis: lipopolysaccharide vs. cecal ligation and puncture. Shock. 13 (2), 110-116 (2000).
- Copeland, S., et al. Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (1), 60-67 (2005).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat Protoc. 4 (1), 31-36 (2009).
- Zolfaghari, P. S., Pinto, B. B., Dyson, A., Singer, M. The metabolic phenotype of rodent sepsis: cause for concern. Intensive Care Med Exp. 1 (1), 25(2013).
- Radermacher, P., Haouzi, P. A mouse is not a rat is not a man: species-specific metabolic responses to sepsis - a nail in the coffin of murine models for critical care research. Intensive Care Med Exp. 1 (1), 26(2013).
- Dyson, A., Singer, M. Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting. Crit Care Med. 37 (1 Suppl), S30-S37 (2009).
- Osuchowski, M. F., et al. Abandon the mouse research ship? Not just yet. Shock. 41 (6), 463-475 (2014).
- Langford DJ1, B. A., Chanda, M. L., Clarke, S. E., Drummond, T. E., Echols, S., Glick, S., Ingrao, J., Klassen-Ross, T., Lacroix-Fralish, M. L., Matsumiya, L., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wong, D., van den Maagdenberg, A. M., Ferrari, M. D., Craig, K. D., Mogil, J. S. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, (2010).
- Hollenberg, S. M., et al. Characterization of a hyperdynamic murine model of resuscitated sepsis using echocardiography. Am J Respir Crit Care Med. 164 (5), 891-895 (2001).
- Heuer, J. G., et al. Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness. J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).
- Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
