Здесь мы демонстрируем новый анализ для изучения холодной ноцицепции у личинок дрозофилы. Этот тест использует пользовательский встроенный Пельтье зонд, способный прикладывать фокусный вредный холодный стимул и приводит к количественному холодных конкретному поведению. Эта методика позволит дальнейшему клеточному и молекулярному рассечение холодной ноцицепции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Новый анализ для холодной ноцицепции в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Как организмы чувствуют и реагируют на вредные температуры до сих пор плохо изучены. Кроме того, механизмы, лежащие в основе сенсибилизации сенсорной техники, такие, как у пациентов, испытывающих периферической невропатии или травмы, вызванной сенсибилизацию, не очень хорошо охарактеризованы. Генетически послушная модель дрозофилы была использована для изучения клетки и генов , необходимую для обнаружения вредного тепла, которая давала несколько консервативных генов, представляющих интерес. Мало что известно, однако, о клетках и рецепторах, важных для вредного холодного зондирования. Хотя, Drosophila не выдерживает длительное воздействие низких температур (≤10 ° C), и позволит избежать прохладно, предпочитая более теплые температуры в поведенческих предпочтений анализов, как они чувствуют , и , возможно , избежать вредных холодных раздражители только недавно были исследованы.
Здесь мы описываем и охарактеризовать первый вредный холод (≤10 ºC) поведенческий анализ вDrosophila. С помощью этого инструмента и анализа, мы покажем, следователь, как качественно, так и количественно оценить холодные ноцицептивных поведения. Это может быть сделано при нормальных / здоровых условий культивирования, или предположительно в контексте заболевания, травмы или сенсибилизации. Кроме того, этот анализ может быть применен к личинкам, выбранному для желательных генотипов, которые могли бы повлиять на thermosensation, боль или ноцицептивную сенсибилизацию. Учитывая, что боль является высоко консервативен процессом, с помощью этого анализа для дальнейшего изучения тепловой ноцицепции, вероятно, почерпнуть важное понимание болевых процессов у других видов, в том числе позвоночных.
Введение
Дрозофилы, оказались весьма полезными для идентификации новых генов сохраняются и нейронных цепей , которые лежат в основе сложного поведения. Мухи обеспечивают сложный генетический инструментарий и упрощенную нервную систему , которая позволяет точно и генетической манипуляции нейрональной 1, 2, 3, 4 рассекать клеточные и молекулярные основы ноцицепции 5, 6, 7. Личинки являются особенно полезными для этих анализов, учитывая , что поведенческие анализы для нежного прикосновения 8, 9, 10, Вредное теплом 11, 12, 13 и механического ощущения вредных раздражителей 4, 11 уже установлены, и прозрачная личиночная кутикула позволяет живому или фиксированное изображение эпидермиса и лежащих в основе сенсорных нейронов. В последнее время анализ на вредный холод также был разработан 7, который мы опишем более подробно здесь.
Использование тонкого, конический наконечником холодного зонда, мы показали , что личинки дрозофил демонстрируют множество холодного специфического реакционноспособного поведения, отличное от поведения , наблюдаемого при нормальной локомоции, после нежного прикосновения, или после жесткой механической или высокой температуры раздражители 7, 8, 11 , Холодное конкретное поведение включает в себя надежное сокращение всего тела (СТ), а 45-90º повышение сегментов задних (PR) и одновременного повышение переднего и задних сегменты в U-образную форму (США). Распространенность такого поведения возрастает с понижением температуры, но каждый с пиками прислегка различные низкие температуры. Последние работы показывают , что ответы CT опосредованы различными периферическими сенсорными нейронами , чем те , которые реагируют на вредное тепло или жесткие механических раздражители 7.
Так же, как позвоночный ноцицепторов, дрозофила множественный дендритный (мД) периферические сенсорные нейроны имеют сложные дендритные структуры , которые ветвятся над эпидермисом 1. MD нейроны присутствуют в каждом сегменте тела личинок, проецируют свои аксоны в брюшной нервной цепочки 14. MD сенсорные нейроны разделяются на четыре различных классов (I-IV) , основанных на дендритной морфологии и имеют различные сенсорные функции 4, 9, 10, 15, 16, 17. В то время как класс IV нейроны необходимы для личиночных ответов рулонных бокового телавоздействию высоких температур или жестких механических раздражителей 4, класс III нейронов необходимы для нежного прикосновения ответов 9, 10 и не активируются только холодным, но и необходимы для холодных-вызванного поведенческих реакций 7. Оба класса III и класса IV нейроны используют дискретные потенциальные каналы переходных рецепторов (ГТО) , чтобы облегчить поведенческие реакции на вредные 7, 11, 18 и безвредными стимулы 9, 10, 17, 19. Кроме того, личиночная ноцицепция сенсибилизирует после травмы, на клеточные 20 и поведенческих уровнях 12, 21.
Анализ, описанный здесь, позволяет quantificatioп либо нормальные, или потенциально изменены поведенческие реакции низких температур в диапазоне от вредного холодного (≤ 10 ° С), безвредным прохладным (11-17 ° C), до температуры окружающей среды (18-22 ° C). Холодные температуры , используемые в данном анализе способны непосредственно активации класса III сенсорных нейронов, вызывая надежное и воспроизводимое увеличение кальция и холодное вызывало поведенческие реакции, которые могут быть качественно и количественно анализировало 7. Этот анализ может быть применен к личинкам практически любому генотипа, а также личинки подвергается воздействию различных условий окружающей среды (измененном питания, травмы, фармакологические агенты), чтобы определить, как генетические и экологические факторы, которые влияют на холодные ноцицепции, ноцицептивную сенсибилизацию или ноцицептивную пластичность. Принимая во внимание, что thermosensation повсеместно во многих видах, этот анализ представляет собой ценный инструмент для исследования ноцицепции и может раскрыть новые цели генов или нервные взаимодействия, которые улучшатнаше понимание позвоночной ноцицепции.
На заказ встроенные холодный зонд (см холодного зонда, таблица материалов) использует замкнутую петлю температуру контролируемой Пельтие устройство, которое охлаждает алюминиевый вал и конический конец через теплопроводность. Термистор встроен внутри наконечника конического алюминия сообщает температуру в режиме реального времени на блоке управления. Радиатор и вентилятор прикреплены к термоэлектрическим модулем для регулирования может быть достигнут эффект Пельтье в тепловой нагрузки (Qc) , так что желаемый температурный диапазон (22-0 ° C) (см Тепловой блок управления, таблицу материалов). Вредный холодный стимул холодного наконечника зонда наносится вручную к средней линии спины, чтобы сегмент (ы) , равноудаленной от переднего и заднего концов (примерно сегмента А4, см Фигура 1А) личинки. В ответ на холодные раздражители, личинки обычно производят один из трех холоднокатаных вызванного поведения в течение 10 с отсечки: полное телосокращение (КГ), 45-90º подъем передних и задних сегментов в U-образную форму (США), или повышение сегментов задних (PR) (описанных в результатах). Ни один из этих поведений не выполняются во время нормальной перистальтической локомоции или нагула поведения. Такое поведение также отличается от нежных сенсорных реакций и аверсивной прокатки ответа на высокую температуру или вредные механические стимулы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка Личинки
- Повысить акции или генетических кресты в инкубаторе 25 ºC.
- Если культивирование креста, использовать 20-25 девственные самка и 15-20 самцов в пузырек, содержащий регулярные кукурузной мука летучих СМИ. Разрешить самки откладывают яйца в течение приблизительно 48 часов до передачи их в новый флакон пищи.
- 4-5 дней после того, как йценоскости, собирать 3 - й возрастной стадии личинки желаемого генотипа, осторожно впрыскивая поток воды в кашицеобразную пищу и личинка, и вылить содержимое в среднем размере, чистую чашке Петри (60 мм х 15 мм).
- Затем, аккуратно сортировать личинка по размеру с помощью щипцов или кисти , чтобы предотвратить большую «блуждающую 3 - й возрастную стадию» или небольшие болезненные личинка из испытываются. Отклон личинки, содержащие какие-либо нежелательные генетические маркеры или балансиры.
- Есть собрату блюда этикетки членов лаборатории или контейнеры, где сортируются личинки будут размещены так, что экспериментатор может быть «слепым» эксриментально состояние или генотип личинок, если это применимо. Экспериментатор может применить декодированные этикетки для собранных данных после эксперимента с использованием ключа, сгенерированного с помощью лабораторного члена.
- Использование Кулинарной лопатки, передавать копейки размера количества свежих продуктов в (35 мм х 10 мм или 60 мм х 15 мм) чистый, меченный чашке Петри заполнен на полпути с водой комнатной температуры.
- Аккуратно переместите отсортированные личинка на пищу (для предотвращения голода или высушивания, если тестирование, как ожидается, займет более 20 минут) с помощью щипцов или кисточку.
2. Холодный зонд анализа
- Включите устройство холодного зонда, позволяющее несколько минут для того, чтобы охладить до нужной температуры. Если установка до более низких температур, конденсации, вероятно, образуют вдоль зонда.
- Вытрите лишнюю влагу с лабораторией протереть перед нанесением на личинку. Когда не в непосредственном использовании, место изолирующего колпачка на зонд, чтобы как изолировать и держать наконечник чистым и предотвратить повреждение.
- Поместите середину 3 - й возрастной стадию личинки на тонкий кусок темного подвижного винила (обычно, использует небольшой кусок вырезать из ноутбука связующего) при ярком поле микроскопа. Черные виниловые средства в контрастной визуализации и в подвижном личинку, не касаясь его, чтобы выровнять его должным образом с помощью зонда.
- Настройка микроскопа (см таблицу материалов) и световой блок (см таблицу материалов) к средней яркости (50-75% яркости макс) , чтобы обеспечить контраст и предотвратить личинку от высыхания слишком быстро.
- Уничтожьте все личинка, которые не первым экспонировать нормальную перистальтическую локомоцию, как они могли бы посрамить результаты. Личинка должна быть влажной от чашки Петри воды в противном случае личинка будет прилипать к винилу, ингибирующего нормальное передвижение. Вода не должна лужа вокруг личинки.
- Предварительный зонд руки по направлению к личинке при 90º угла к оси переднезадней тела, используя винил, чтобы переместить личинку в корПрямоугольник положение (см рисунок 1А).
- Восточный кончик зонда, чтобы аккуратно лежал поперек середины дорсальной поверхности личинки с зондом при приблизительно 45 ° угла на столик микроскопа.
- При контакте зонда, начать лабораторный таймер. Нанести достаточное понижательное давление слегка отступа поверхность личиночной кутикулы в то же время позволяя вперед или назад движение.
- Удерживая зонд в месте до 10 с или до наблюдаются холодная вызванным поведенческая реакция - наступит первым. Затем снимите зонд.
- Записывают наблюдаемую поведенческую реакцию и задержку ответа. Личинки, которые не отвечают в течение 10 секунд считаются «невосприимчивыми». Задержка может быть также записана для ответчиков и используется для измерения изменений в ответ робастности / амплитуде.
- Откажитесь личинку и подготовить следующий.
- Повторите шаги 2.3-2.11, пока нужное количество тестовых личинок не будет достигнут (три набора п = 20-40 личинок UСЭД здесь).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дрозофилы личинки двигаются с помощью перистальтического движения , которое включает в себя случайные паузы, повороты головы, и изменения в направлении 22. В ответ на фокальное применение вредного холодного раздражителя однако, личинки демонстрируют набор уникальных поведения, в отличии от аверсивного бокового валка к вредному теплу и механическим стимулам. Такое поведение также отличается от ответов на нежное прикосновение 8,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ, описанный здесь, может быть использован для качественно и количественно оценить ноцицепции или ноцицептивную сенсибилизацию у личинок различных генетических фонов, воздействий окружающей среды, и / или повреждений индуцированных условий. Так как этот анализ позволяет фокальное применение холодного раздражителя, с помощью этого инструмента можно оценить функцию подмножества периферических сенсорных нейронов, в частности, в ответ на низкие температуры. Интересно, что это холоднокатаное вызывали поведение , кажется...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Патентная заявка США (CL) находится на рассмотрении в конструкции холодного зонда. будет предоставлена дополнительная информация о деталях номера деталей холодного зонда и строительства, а также дополнительные консультации по дизайну инструмента по запросу.
Благодарности
Мы благодарим Сару В и Камил Грейам для разработки ранних этапов анализа холодного зонда, в Блумингтоне дрозофила фондового центра для акций мух и членов лаборатории Галько~d для критически чтения рукописи. Эта работа была поддержана NIH НРС (NIH F31NS083306) в HNT, и NIH R01NS069828, R21NS087360 и Техасский университет MD Anderson Clark Fellowship в фундаментальных исследованиях до MJG.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Холодный зонд | Pro-Dev Engineering | Изготовлен по индивидуальному заказу | Номера деталей и детали конструкции могут быть предоставлены по запросу |
| Блок терморегулирования | TE Technology | Изготовленный по индивидуальному заказу корпус | Номера деталей и детали конструкции могут быть предоставлены по запросу |
| Микроскоп Zeiss Stemi 2000 | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 Осветитель | высокой интенсивностиДолан-Дженнер Индастриз. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23-дюймовый волоконно-оптический световод | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Щипцы | FST | FS-1670 | Используются для сортировки и обработки личинок. Обязательно слегка разгладьте и затупите кончики щипцов, чтобы снизить риск случайного прокола или травмирования личинок |
| Кисть | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Используется для сортировки и обработки личинок. Это полезно, если кисть влажная во время использования. |
| 35 мм x 10 мм Полистирольная чашка | Петри Falcon | 351008 | |
| 60 мм x 10 мм Полистирольная чашка | Петри Falcon | 351007 | |
| Кусок черного винила (не менее 2 дюймов x 2 дюймов) | Используется для обеспечения контраста и ориентации личинок на холодный щуп | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Используется для перемещения продуктов питания |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Используется для сушки личинок и холодного зонда при наличии избытка влаги |
Ссылки
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837(2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343(2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39(2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735(2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
