Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Summary

В этой статье описана спектральные цитометрии, новый подход в проточной цитометрии, который использует форму спектров излучения, чтобы отличить флуорохромы. Алгоритм заменяет возмещения и может относиться к автофлуоресценции как независимый параметр. Этот новый подход позволяет для правильного анализа клеток, выделенных из солидных органов.

Abstract

Проточная цитометрия была использована в течение последних 40 лет для определения и анализа фенотипа лимфоидных и других гемопоэтических клеток. Первоначально ограниченный анализом нескольких флуорохромов, в настоящее время существуют десятки различных флуоресцентных красителей, и одновременно можно комбинировать до 14-18 различных красителей. Однако некоторые ограничения все еще ухудшают аналитические возможности. Из-за большого количества флуоресцентных зондов анализ данных становится все более сложным из-за необходимости больших многопараметрических матриц компенсации. Кроме того, появились модели мутантных мышей, несущих флуоресцентные белки для обнаружения и отслеживания конкретных типов клеток в разных тканях, поэтому необходим анализ (с помощью проточной цитометрии) суспензий автофлуоресцентных клеток, полученных из твердых органов. Спектральная проточная цитометрия, которая различает формы спектров излучения в широком диапазоне непрерывных длин волн, решает некоторые из этих проблем. Данные анализируются wIth алгоритма, который заменяет матрицу компенсации и обрабатывает автофлуоресценцию как независимый параметр. Таким образом, спектральная цитометрии потока должна быть способна различать флуорохромы с аналогичными пиками излучения и может обеспечить мульти-параметрический анализ без требований компенсации.

Этот протокол описывает спектральный анализ проточной цитометрии, что позволяет в течение 21-параметра (19) флуоресцентные зондов характеристики и управления авто-флуоресцентный сигнала, обеспечивая высокое разрешение в незначительном обнаружении населения. Результаты, представленные здесь, показывают, что спектральная проточной цитометрии представляет преимущества при анализе клеточных популяций из тканей трудно охарактеризовать в обычной проточной цитометрии, таких как сердце и кишечник. Спектральный проточной цитометрии, таким образом, демонстрирует мульти-параметрический аналитического потенциала высокопроизводительной обычной проточной цитометрии без требования о компенсации и дает возможность управления авто-флуоресценции,

Introduction

В течение последних нескольких десятилетий, проточной цитометрии (FCM) стал широко доступен аналитический метод необходим для изучения клеток фенотипирования. Там было значительное увеличение доступных флуоресцентных красителей, в частности , флюорохромами возбуждаются фиолетового лазера (405 нм) (например, Brilliant Violet и новые Q-точка красителей). Тем не менее, рост доступных флуоресцентных красителей повышает риск перекрывающихся выбросов и требует матрицы компенсации трудоемкой. FCM стал широко использоваться для анализа клеточных суспензий из твердых тканей, но наличие авто-флуоресцентного клеток ограничивает дискриминацию специально обозначенных групп населения.

Основные принципы спектрального FCM представлены подробно в Futamura и соавт. ^{1, 2.} Если коротко, то спектральная ТСМ используется здесь (смотри таблицу материалов) оснащена 405, 488 и 638 нм лазеров. Спектральная ТСМ фиксирует весь испускаемый пluorescence в спектрах в 32-канальный линейный массив РМТ (ПМТ) 32ch на длине волны 500 нм до 800 нм и 2 независимых ФЭУ для 420 нм до 440 нм и 450 нм до 469 нм, соответственно, которые заменяют обычные фильтры полосовые. 488 и лазерные пятна 405/638 нм пространственно разделены, в то время как 405 нм и 638 нм лазерные пятна коллинеарной. Для каждой отдельной частицы, спектральные меры FCM до 66 каналов данных флуоресценции при возбуждении на 405 нм и 488 нм лазеров. Когда клетки возбуждаются нм лазера 638, спектральная ТСМ измеряет 58 каналов данных флуоресценции, так как маска вставлена, чтобы предотвратить 638 нм лазер светит в ПМТ. Спектральный анализ ТСМ полученные полные данные спектра с помощью алгоритма на основе метода взвешенной по методу наименьших квадратов (WLSM), что дает возможность разделения перекрывающихся спектров флуоресцентного. Спектры получены из отдельных окрашенных и неокрашенных образцов признаны в качестве основных эталонных спектров. Мульти-окрашенные образцы математически, подключеный несмешанные, и спектр образца со смешанными флуоресцентными метками разлагаются в совокупность ее состав спектров. Несмешивание, в спектральной технологии ^{3, 4,} заменяет компенсацию , который удаляет сигнал от всех датчиков , кроме одного измерения данного красителя.

В этом исследовании мы объединили и проходят 19 флуорохромов в одном, 21-анализа параметров, которые были характерны основные кроветворные подмножества найдены в селезенке мыши. Кроме того, мы показали, что спектральная цитометрии может управлять авто-флуоресцентный сигнал, тем самым улучшая характеристику кишечника внутри эпителиальных лимфоцитов и эмбрионального сердца. Действительно, в этих тканях, управление автофлуоресценцией позволило для назначения специфической флуоресценции клеток, которые будут исключены из анализа в обычном ТСМЕ.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Пастера Институт Этики Устава и руководящими принципами ЕС и были утверждены Министерством сельского хозяйства Франции.

1. Клеточная суспензия Подготовка от взрослой мыши органов

1. Выделение спленоцитов
   1. Эвтаназии взрослых мышей путем смещения шейных позвонков. Сделайте надрез на животе средней линии и откройте кожу с помощью ножниц. Урожай селезенки с пинцетом.
   2. Измельчите селезенка между 2 предметные стекла микроскопа, чтобы отделить клетки и развести их в 5 мл сбалансированного Соленым раствор Хенкса (HBSS), содержащим 1% фетальной сыворотки теленка (FCS).
   3. Центрифуга в течение 10 мин при 120 мкг и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают.
   4. Ресуспендируют осадок в 5 мл HBSS 1% FCS. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
      Примечание: 80 миллионов клеток должны быть получены из одного взрослого селезенки.
2. Isolatiна клетки из тонкого кишечника
   1. Эвтаназии взрослых мышей путем смещения шейных позвонков. С помощью ножниц, сделать надрез в коже на животе средней линии. Возьмитесь тонкой кишки с щипцами в одной руке и использовать ножницы, чтобы разрезать его на обоих концах: во-первых, сразу же после того, как желудок, а затем в конце тонкой кишки, непосредственно перед толстой кишки. Промыть в тонкую кишку с 1x Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS) с использованием 2 мл шприца с иглой.
   2. Поместите в тонкую кишку на бумажное полотенце и осторожно удалить пятна в бляшках с парой острых ножниц.
   3. Используйте ножницы, чтобы открыть кишечник на длинной стороне, вставив одну ветвь ножниц внутри кишечника. Вырезать открытый кишечник в 1 см части, используя острые ножницы.
   4. Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С при постоянном перемешивании в 30 мл HBSS с 10% FCS.
   5. Поместите суспензию клеток с остальными не-диссоциированных фрагментов в 50 млпластиковая труба и вихревое течение 5 мин при высокой скорости. Примечание: Там нет никакой дальнейшей диссоциации ткани.
   6. Инкубирую в течение 10 мин на лед, чтобы позволить большим, не-диссоциированным фрагменты для осаждения.
   7. Собирают супернатант и концентрируют его центрифугированием в течение 7 мин при 120 х г.
   8. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл HBSS с 1% FCS. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
      Примечание: ~ 60 миллионов интраэпителиальной клетки (IELS) должна быть получена из одного взрослых тонкого кишечника.
3. Стратегия дизайна панели
   1. Подготовка панелей с антителами, непосредственно связанных с флюорохромами.
      Примечание: Все антитела предварительно титрует, чтобы получить оптимальное определение клеточных популяций (титрование может меняться в зависимости от партии антител). Антитела , используемые в 19-цветовой панели для окрашивания спленоцитов, перечислены в таблице 1.
   2. Построить мульти-Coloг панель для цитометрии. Как это может быть сложной задачей, используйте следующие рекомендации для оптимизации панелей:
      1. Проверьте спектральную конфигурацию и флуоресцентные красители, которые могут быть использованы на приборе.
      2. Использовать информацию о яркости Index / Индекс Окрашивание, предоставляемая производителем.
         Примечание: Яркость Индекс / Индекс Окрашивания является относительным показателем интенсивности флуоресценции по сравнению с фоном для каждого флуорохрома.
      3. Выберите антитела следующих правил ниже:
         1. Выберите самые яркие флуорохромии для белков, которые слабо выражены и тусклые флуорохромии для более высокого уровня экспрессии белков.
            Примечание: Например, CD45, CD4, CD8 и имеют высокий уровень экспрессии и могут быть использованы с тусклыми флюорохромами.
         2. Начало проектирования панели при первом выборе антител с наименьшим количеством флуоресцентных возможностей красителя.
         3. Если это возможно, выбирать флуоресцентные красители с наименьшим перекрытием спектров излучения Fили маркеры экспрессируются на одних и тех же типов клеток.
            Примечание: тандемы (например, PE-Cy5, PE-Cy7 и PerCP-Cy5.5) следует использовать с осторожностью, так как они более восприимчивы к деградации освещенности.
4. Окрашивание клеток для анализа цитометрии
   1. Подготовьте 5 мл пробирку с 1 × 10 ⁶ спленоцитов и один 5 мл пробирку с 1 × 10 ⁶ клеток кишечника и держать их неокрашенными для использования в качестве отрицательного контроля.
   2. Подготовка и маркировать один 5 мл пробирку на образец и на панели в соответствии с таблицей 1. Готовят смесь антител, в соответствии с таблицей 1, в HBSS 1% FCS.
   3. Передача 1 × 10 ⁶ клеток - либо спленоциты или кишечных клеток - в каждую 5 мл пробирку. Добавить 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 4 ° С и 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл смеси антител.
   4. Этикетка секplenocytes в 2 этапа. Во-первых, использовать 50 мкл смеси, содержащей антитела, меченные РЕ-цианиновыми 5, PerCP-цианиновыми 5,5, и PerCP (с блокированием рецептора Fc) в 5 мл трубки. Через 20 мин инкубации в темноте при 4 ° С, добавляют 50 мкл смеси, содержащей все другие антитела к 5 мл трубки.
      Примечание: Эта стратегия ограничивает пространственное затруднение.
   5. Инкубируют в течение 20 мин в темноте при 4 ° С.
   6. Добавить 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 4 ° С и 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл HBSS 1% FCS с 0,5 мкг / мл иодида пропидия (PI).

2. Получение единого окрашивания для каждого Флуорохром на коммерческих компенсации бисера микросфер (например, UltraComp eBeads), далее именуемые как бисер

1. Подготовка и маркировать как можно больше 5 мл пробирки, как количество антител, которые используются в панелях. Поместите 1 каплю шариков в каждой пробирке и добавить 1 & #181, L антитела на пробирку.
   Примечание: Шарики, используемые здесь (смотрите таблицу материалов) содержит окрашенные (положительное) и неокрашенный (отрицательный) бисер. Антитела помещают в избытке на шариках, чтобы обеспечить яркий сигнал и, таким образом, четкие спектральные подписи для каждого красителя. Это требуется программное обеспечение, чтобы иметь возможность сделать точное расслоение.
2. Инкубируют в течение 20 мин в темноте при 4 ° С.
3. Добавляют 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл HBSS 1% FCS.

3. Cell Подвеска Подготовка от эмбриональной Мыши Сердца

1. Вскрытия эмбрионов
   1. Планирует получить тайм-беременные самка заранее скрещивание 2 самки с одним самцом (всегда в клетке самца) в конце дня (между 17 и 19 ч). На следующее утро, женщины с вагинальными пробками считаются на 0,5 дней после коитуса.
   2. Эвтаназии E17.5 беременной FemalДисплазией шейки матки. Убедитесь, что животное не реагирует на нажатие на лапу мыши (рефлекс на носок). Мокрый живот с 70% этанола стерилизовать и, чтобы предотвратить распространение меха мыши.
   3. Сделайте разрез на коже в середине живота, используя ножницы, и разведите пальцами кожу.
   4. Откройте брюшную полость, потянув и делая надрезы в брюшной мышце от центра к двум сторонам живота, используя грубые щипцы и ножницы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны, чтобы не повредить тонкую кишку, которая находится непосредственно ниже перитонеальной мышцы.
   5. Соберите рог матки (с эмбрионами), разрезая оба на уровне тела матки и яичников. Впитайте их в чашку Петри 90 х 15 мм ² с 50 мл DPBS.
   6. Изолируйте каждый зародыш путем разрезания между каждым децидуа, а затем матки и мышечной стенки висцерального желточного мешка с помощью тонких щипцов и ножниц. Вытяните эмбрионы intакт. Наконец, перерезать пуповину.
   7. Вырезать Возглавляет E17.5 эмбрионов с ножницами (обезглавливание) перед началом рассечение.
2. Коллекция сердец
   1. Замачивание обезглавленных эмбрионов в 90 х 15 мм ² чашки Петри , содержащую влажную бумажное полотенце постельные принадлежности в нижней части тарелки и 50 мл HBSS с 1% FCS.
   2. Под стереомикроскопом, удерживая каждый эмбрион с грубыми щипцами, так что брюшная сторона обращена вверх.
   3. Осторожно откройте грудную сетку резания правой стороны груди с помощью ножниц, чтобы предотвратить повреждение сердца.
   4. Expose сердца, удерживая грудную клетку с грубыми щипцами.
   5. Растащить сердце (еще собранное с легкими и тимуса), держа большие сосуды (содержащие большие сосуды в- или из потока сердца) и поместите их в 35 х 15 мм ² чашки Петри с 2 мл HBSS 1% с FCS.
   6. Изолировать сердце от окружающих органов иСоединительная ткань с тонкими щипцами и скальпелем.
   7. Вымойте сердца в новой чашке Петри 35 x 15 мм с 2 мл HBSS 1% FCS и держите их на льду в течение 20 минут, чтобы сердце могло выкачать кровь из камер.
3. Приготовление суспензий клеток сердца
   1. Предварительно нагревают коллагеназу 200 мкг / мл в HBSS + / + (далее называемый ферментативным раствором) до 37 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разбавьте коллагеназу в HBSS + / + (с катионами Ca ²⁺ и Mg ²⁺ ), чтобы максимизировать активность фермента; Активность коллагеназы стабильна между партиями.
   2. Замените промывочный раствор, впитывающий сердца (HBSS 1% FCS), 1 мл предварительно нагретого ферментативного раствора.
   3. Под стереомикроскоп, фарш сердца в 1 мм ³ штуки с использованием тонких щипцов и скальпелем. Добавьте еще 1 мл предварительно нагретого ферментативного раствора и перенесите измельченную ткань в 5 мл пробирку с крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптимального пищеварения поместитемаксимум 5 E17.5 сердца в 2 мл ферментного раствора. Если больше сердец перевариваются в то же самое время, разделить их на разные 5 мл пробирки.
   4. Инкубируйте фарш сердца в течение 15 мин при 37 ° С.
      Примечание: сложить 5 мл пробирки (закрытые) надлежащим образом в инкубаторе для распространения ткани вдоль раствора.
      1. В конце инкубации, гомогенизация ткани в том же ферментативном растворе с помощью пипетки вверх и вниз примерно в 20 раз с P1000 пипеткой. Поместите по 5 мл трубки в вертикальном положении, и пусть оставшийся фрагмент ткани осадок (приблизительно 3 мин).
      2. Собирает супернатант (содержащий переваренные клетки в суспензии) в трубке 50 мл, добавляют 2 мл HBSS 10% FCS (такой же объем, как и объем ферментного раствора добавляет к фрагментам ткани), и держать их на льде, продолжая переваривание процесс.
         Примечание: HBSS, 10% -ный раствор FCS, и лед играют важную роль в неактивное действие фермента в то время как остальные тканипереваривание.
      3. Добавить 2 мл подогретого ферментативного раствора в пробирки по 5 мл с остальными фрагментами ткани и продолжить пищеварение повторяя шаг 3.3.4, пока не наблюдается более ткани.
         Примечание: Около 4 циклов пищеварения достаточно, чтобы полностью отделить ткань сердца (5 E17.5 сердца в 2 мл ферментного раствора).
   5. Центрифуга пробирки на 50 мл с клетками в суспензии в течение 10 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
   6. Ресуспендируют осадок клеток, добавляют 1 мл HBSS - / - 1% FCS, и фильтровать суспензии клеток, хотя нейлоновое сито 70 мкм. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
      Примечание: Ресуспендируют клетки с HBSS - агрегации клеток (без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ катионов) , чтобы свести к минимуму - /. Между 800000 и 1000000 клетки получают из одного E17.5 сердца.
4. Окрашивание сердечных клеток с флуоресцентными антителами
   Примечание: Все Antibodх годов предварительно титруют , чтобы получить оптимальное определение клеточных популяций (титрование может меняться в зависимости от партии антител) .The антитела , используемые в панели сердца , перечисленных в таблице 1.
   1. Распределить сердечные клетки в суспензии через 96-луночный планшет с круглым дном (). Распределить их равномерно во всех необходимых скважин (200 мкл на лунку), короткого спина центрифуги 96-луночный планшет в течение 1 мин при 480 мкг, и отбросить супернатант.
      Примечание: Все лунки 96-луночного планшета с круглым дном () могут быть использованы.
   2. Ресуспендируют осадок и инкубировать сердечные клетки в течение 20 мин в темноте при 4 ° С со 100 мкл коктейля антител (то есть, CD45-PE, Ter119-PE, CD31-Alexa 647, и Sca-1-PE-Cyanine5 ) разводили в HBSS - / - 1% FCS.
   3. Промывают сердечные клетки от избытка антител путем добавления 200 мкл HBSS - / - 1% FCS, и короткое спина центрифугирование клеток в течение 1 мин при 480 х г.
   4. Жидкость над осадком сливают и повторкороткого спинового центрифугирования (этап 3.4.3).
   5. Ресуспендируют клеток в 200 мкл HBSS - / - 1% FCS и передавать их в 5 мл пробирку, уже содержащую 200 мкл HBSS - / - 1% FCS.
   6. Перед приобретением, добавьте 400 мкл HBSS - / - 1% FCS с 0,5 мкг / мл PI и фильтрации суспензии клеток, хотя нейлоновое сито 70 мкм.

4. Получение меченых селезеночные, кишечная и сердечные клетки со спектральным проточным цитометром

1. До получения данных, автоматически калибровать спектральные цитометрии в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполнение ежедневного и ежемесячных процедур контроля качества каждый день эксперимента.
2. Когда цитометра готова, начать просмотр образцов, содержащих клеточные суспензии, меченные все антитела.
   Примечание: Не приобретать.
3. Убедитесь, что все лазеры на по мере необходимости. Отрегулируйте усиление FSC таким образом, что все клетки видны в соответствующемучастки. Ворота популяция клеток и применить эти ворота к двум спектральных участков, соответствующих 488 нм и на 638/405 нм лазеров.
   Примечание: Когда флуорохромы возбуждаются 638-нм лазера (т.е. когда 638-нм лазер включен), есть маска , что экраны свет от 617-662 нм , чтобы предотвратить 638 нм лазер светит в ПМТ. Это вызывает потерю части спектра и, следовательно, вызывает более низкое разделение близких красителей, излучающие в этих длинах волн. Тем не менее, весь сигнал может быть собран путем выключения 638-нм лазер, если это не требуется для приобретения.
4. Настройка 32-канальный фотоумножительную (ПМТ) напряжение (%) таким образом, что все флуорохромы находятся в пределах диапазона интенсивности , отображаемой в у-осей (1-10) ⁶ в двух различных спектральных участках , где отображается 488 нма и 405/638 нм возбуждения.
   Примечание: Требуется обучение распознавать спектры всех люминофоры используются.
5. Начинают приобретать образцы. Нажмите на "; Предварительный просмотр» , чтобы визуализировать клетки на экране , а затем нажмите на„Приобретать“ , чтобы записать образец Сэкономьте до 2 х 10 ⁶ событий из каждого образца..
6. После получения окрашенных образцов, приобретают образец окрашивали витальным красителем, а затем компенсационные бусинами индивидуально окрашивали антителами всех используемых. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», чтобы визуализировать клетки на экране, а затем на «захватит» для записи образцов.
   Примечание: Держите одинаковое напряжение ФЭУ для всех образцов и контролей (то есть, бусин и неокрашенных образцов); 5000 событий в основном достаточно.
7. И, наконец, получают данные из неокрашенных клеточных суспензий. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», чтобы визуализировать клетки на экране, а затем на «захватит» для записи образцов.
   Примечание: Получение неокрашенных образцов в конце эксперимента сводит к минимуму уноса флуоресцирующих клеток.
8. Очистите цитометр следующих инструкций апа производителяd закрыть эксперимент в папке сбора.
   Примечание: Только после закрытия эксперимента она будет сохранена и доступна для анализа.

5. Анализ данных с помощью спектрального ТСМ Software

1. В окне «Цветовая палитра» на вкладке «Анализ», регистрировать все параметры, присутствующие в панели, добавляя каждый флуорохром, используемый и соответствующий маркер (выбрать из списка доступных или добавить новый параметр). Кроме того, включают в себя авто-флуоресценции и жизнеспособность параметры; все выбранные параметры будут отображаться в окне «расслоение».
2. Выберите первый сингл окрашенную образца (сделано с компенсацией бус) в окне «Управление» под «Список труб» этого эксперимента на вкладке «Анализ». На листе, нажмите на «дизайн многоугольника инструмента» и создать ворота на населении бисерного в FSC / SSC участке. Дважды щелкните на верхней части ворот , чтобы открыть спектральный или точечный участоквизуализировать стробированные бусины в дочернем участке.
   1. Дизайн одних ворот для положительного и одних ворот для отрицательных бусин либо на спектре или на точечном участке. Проверьте все спектры, соответствующие два лазерных наборов для каждой положительной и отрицательной фракции и устранить выбросы путем последовательного стробирования и нажав на воротах, чтобы проверить дочь населения. Введите отрицательные и положительные ворота в окне «расслоение».
   2. Повторите шаг 5.2 для каждого отдельного окрашенных образца.
      Примечание: Имейте в виду, что положительная и отрицательная стратегия стробирования соответствует образцу, который в настоящее время анализируется, хотя программа позволяет ему быть размещены в любом образце. Вместо того, чтобы определить отрицательную часть для каждого отдельного окрашенных образца, использовать неокрашенной образец шарика, чтобы установить универсальный негатив.
3. Выберите неокрашенный образец ячейки в «Списке труб» и дизайн вороте для autofluorescent и для не autofluorescent клеток.
4. Когда все отрицательные и положительные ворота для всех параметров, в том числе автофлуоресценции и жизнеспособности, выбираются в окне «расслоение», нажмите на кнопку «Рассчитать». Примените расслоение к образцам для анализа.
5. Анализ данных по проектированию ворота и создания графиков двух параметров.
   1. Во-первых, создать ворота для SSC против ФСБ и затем удаляют омертвевшие клетки, за исключением всех клеток, меченных жизнеспособность маркера (PI против CD45). На остальной части клетки, дизайн ворот для всех групп населения , представляющих интерес следующих стратегий , описанные для каждой клеточной суспензии (фиг.1-3).
      Примечание: При необходимости, отрегулируйте компенсацию в «опорный регулятор спектра.» Это инструмент, который может быть использован после того, как расслоение перенастраивать медиану положительных популяций для каждого флуорохрома, если алгоритм не мог сделать это прекрасно.

Results

21-параметр спектральной ТСМ панели для анализа спленоцитов

На рисунке 1 показаны результаты , полученные с 19-флуоресцентной-антителом панели , приложенной к селезеночным клеткам , содержащих различные антитела , распознающие подмножества T, B, NK, дендритные, и миелоидным клеток, в то время как CD45 этикеток всех кроветворным клеток ядросодержащих. Панель также включает в себя жизнеспособность красителя (PI), а...

Discussion

Обычный ТСМ основан на обнаружении фотонов, излученных после возбуждения флуоресцентных зондов. Излучения флуоресценции одного флуорохрома обнаруженного в детекторе, предназначенный для измерения сигнала от другого флуорохрома вызывает физическое перекрытие. Это перелив среди спектров излучения должно быть исправлен путем компенсации.

Спектральный ТСМ и обработки данных с помощью алгоритма несмешивания деконволюции позволяют комбинацию флюорохромов с близкими пиками эмиссии без дополнительно...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Мыши	Janvier Labs	CD45.2	Источник клеток
Этанол 70%	VWR	83801.36	Стерилизация
DPBS (Ca2+, Mg2+)	GIBCO ThermoFisher	14040-174	Embryos collection
Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)GIBCO	Life ThermoFisher	14025092	Растворы для диссоциации, разложения и окрашивания
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO	Life ThermoFisher	14175095	Растворы для диссоциации, разложения и окрашивания
Фетальная сыворотка теленка (FCS)		EUROBIO CVFSVF00-0U	Растворы для диссоциации, разложения и окрашивания
Коллагеназа	Sigma	C2139	Ферментативный раствор
90 x 15 мм, <бр/> пластиковой культуры тканей чашки Петри.	TPP	T93100	Коллекция эмбрионов и сердец
35 x 15 мм, <бр/> пластиковая культура тканей в чашках Петри.	TPP	T9340	Коллекция сердец
Ножницы для тонкой радужной оболочки	глаза Инструменты для тонкой науки	14090-09	Инструменты для препарирования
Щипцы грубые (щипцы узкого узора, изогнутые 12 см)	Инструменты для	11003-12	Инструменты для пресечения
Тонкие щипцы (щипцы Dumont No. 7)	Инструменты для пресечения	11272-30	Инструменты для препарирования
Скальпель	VWR	21909-668	Инструменты для препарирования
LEICA MZ6 Микроскоп для рассечения	LEICA	MZ6 10445111	Отбор проб; Окулярный W-Pl10x/23
Источник холодной лампы	SCHOTT VWR	KL1500 компактная	выборка; Два волокна гусиной шеи адаптированные
трубки FACS	VWR	60819-310	Пищеварительные клетки
96 луночная пластина (круглое дно)	VWR	10861-564	Окрашивающие ячейки
Нейлоновая сетка для болтовых болтов стерилизованная ткань, < бр/> 50/50 мм штук.	СЕФАР НИТЕКС	СЕФАР НИТЕКС	Клеточная фильтрация
UltrasComp eBeads
Флуоресцентно меченые антитела	Biolegend	Каталожный номер см. таблицу ниже	Окрашивание клеток