Простую гомогенизацию использовали для получения новых наночастиц с высокой плотностью, имитирующих липопротеин для инкапсуляции фактора роста нервов. В этой статье описываются проблемы, подробные протоколы для подготовки наночастиц, характеристика in vitro и исследования in vivo .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка и характеристика новых HDL-имитирующих наночастиц для инкапсуляции фактора роста нервов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Целью данной статьи является введение методов подготовки и характеризации наночастиц (NP), нагружающих фактор роста нервной (NGF), высокой плотности, липопротеинов (HDL). ЛПВП являются эндогенными НП и изучены в качестве носителей для доставки терапевтических агентов. Разработаны различные методы получения HDL-имитирующих НП. Однако они, как правило, сложны, трудоемки и трудны для промышленного наращивания. В этом исследовании одноступенчатую гомогенизацию использовали для смешивания эксципиентов и образования прототипов NPs. NGF представляет собой водорастворимый белок массой 26 кДа. Для облегчения инкапсулирования NGF в липидную среду HDL-имитирующих NPs протамин USP использовали для образования комплекса ионной пары с NGF для нейтрализации зарядов на поверхности NGF. NGF / протаминовый комплекс затем вводили в прототипы NPs. Наконец, аполипопротеин AI был нанесен на поверхность НП. NGF-HDL-имитирующие NPs показали предпочтительные свойства в терминахС размером частиц, распределением по размерам, эффективностью захвата, высвобождением in vitro , биологической активностью и биораспределением. Благодаря тщательной разработке и исследованию гомогенизации в HD-имитирующих NP, процедура была значительно упрощена, и NP были сделаны масштабируемыми. Кроме того, были преодолены различные проблемы, такие как отделение незагруженного NGF от NP, проведение надежных исследований высвобождения in vitro и измерение биоактивности NP.
Введение
Макромолекулы, такие как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, появились в качестве перспективных препаратов и в последние десятилетия получили значительное внимание 1 , 2 . Благодаря их высокой эффективности и специфическим режимам действия они обладают большим терапевтическим потенциалом для лечения рака, иммунных заболеваний, ВИЧ и связанных с ними состояний 3 , 4 . Однако физико-химические свойства, такие как их большие молекулярные размеры, трехмерная структура, поверхностные заряды и гидрофильная природа, делают in vivo доставку этих ма....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ. Исследования на животных, включенные во все процедуры, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных при университете Северного Техаса.
1. Получение наночастиц, имитирующих NGF HDL
- Растворяют эксципиенты, фосфатидилхолин (ПК), сфингомиелин (SM), фосфатидилсерин (PS), холестерин олеат (CO) и сукцинат D-α-токоферил полиэтиленгликоля (TPGS) в этаноле для приготовления исходных растворов в концентрации 1 мг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Исходные растворы разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° С. Олеат холестерина хранили в темных бутылках. Исходные растворы ПК, SM, PS и CO были стабильными в течение 6, 3, 12 и 12 месяцев соответст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рис. 1 показана техническая схема HDL-имитирующих NPF NP, покрытых α-токоферолом, приготовленных по стратегии ионных пар. Чтобы нейтрализовать поверхностные заряды NGF, протамин USP использовали в качестве агента ионной пары для образования комплекса с NGF. Для защиты биоактивности были спроектированы прототипы NPL, имитирующие HDL, с использованием гомогенизации; Затем NGF / протаминовый комплекс инкапсулировали в прототипы NPs. Гомогенизация обеспечивала достаточную энергию и успешн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании мы продемонстрировали простой метод приготовления HDL-имитирующих NP для инкапсуляции NGF. Были изучены различные системы доставки NP для доставки белков. В настоящее время многие препараты НП включают диализ, осаждение растворителя и гидратацию пленки. Эти процессы, как правило, сложны и сложны при масштабировании. Во время этой разработки NP было определено, что липиды обладают сильной адгезией к стеклянной стенке контейнера, что привело к трудностям в увлажнении тонкой пленки и эффективном перемеш.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH R03 NS087322-01 до Dong, X.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Рекомбинантный человеческий бета-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-фосфатидилхолин (PC) | Avanti | 131601P | 95%, яйцо, куриный |
| сфингомиелин (SM) | Avanti | 860062P | мозг, свиной |
| фосфатидилсерин (PS) | Avanti | 840032P | мозг, свиной |
| холестерилолеат (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-токоферилполиэтиленгликоль сукцинат (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Витамин Е Полиэтиленгликоль Сукцинат |
| Протамина сульфат | Sigma | P3369 | соответствует спецификациям тестирования USP |
| Аполипопротеин A1, Плазма человека | Athens Research & Технология | 16-16-120101 | 1 мг в 671 &; L 10 mM NH4HCO3, pH 7,4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, гель фильтрация хроматография материал для заполнения колонки |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R& D система | DY008 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 средний | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Лошадиная сыворотка | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10082147 | |
| PC12 клетки | ATCC | CRL-1721 | |
| Крысиный хвост коллаген типа I | Sigma | C3867 | |
| Ацетат натрия | Sigma | S2889 | |
| Хлорид натрия | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Фенилметансульфонилфторид (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Бензетония хлорид | Sigma | B8879 | |
| Название | Company< | strong>Номер в каталоге | >Комментарии |
| Оборудование | |||
| Гомогенизатор | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC анализатор частиц | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Аппарат для диализа | Spectrum Laboratories | G235036 | отсечкой молекул 300 кДа |
| Центрифуга | Eppendoff | 5424R | |
| Гомогенизатор | Polytron Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
Ссылки
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
