Липидные капли являются важными органеллы для репликации нескольких патогенных микроорганизмов, в том числе вируса гепатита С (HCV). Мы опишем метод, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков; он может быть использован при различных условиях, например, вирусной инфекции, экологический стресс, или лекарственной терапии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Липидные капельки имеют важное значение для репликации множества различных патогенов, наиболее заметно вирусом гепатита С (HCV), как предполагаемый сайт вириона морфогенеза. Количественный анализ протеых липидов капель может быть использован для идентификации белков, которые локализуют или смещены из липидных капель в условиях, такие как вирусные инфекции. Здесь мы опишем протокол, который был успешно использован для характеристики изменений в протеоме липидных капельного следующие инфекций HCV. Мы используем стабильные изотопы Этикетировочные с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) и, таким образом маркировать полную протеые одной популяции клеток с «тяжелыми» аминокислотами для количественного определения белков с помощью масс-спектрометрии. Для выделения липидов капли, две клеточных популяций (то есть HCV-инфицированные / «легкая» аминокислота и неинфицированная контрольная / «тяжелая» аминокислота) смешивает 1: 1 и лизируют механически гипотонический буфер. После удаления ядер и клеток Debris низкоскоростного центрифугирования, липидные капли белки, ассоциированные обогащены два последующих стадий ультрацентрифугирования с последующих тремя стадиями промывки в изотоническом буфере. Чистота фракций капель липидов анализируют с помощью вестерн-блоттинга с антителами, распознающих различные субклеточные отсеки. Липидные капельные-ассоциированные белки затем разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием Кумасси. После расщепления трипсина, пептиды количественно с помощью жидкостной хроматографии-ионизации электрораспыления-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-МС / МС). С помощью этого метода, мы идентифицировали белки набраны в липидных капель при инфекции HCV, которые могут представлять про- или противовирусных факторов хозяина. Наш метод может быть применен к различным различных клеток и условий культивирования, таких как инфекции с патогенами, экологический стресс, или лекарственной терапии.
Введение
Липидные капли имеют высокие динамические цитоплазматические (и ядерные) органеллы клеток , состоящие из сердцевины нейтральных липидов (триглицериды (ТГ) и холестерин эфир (С)) приложен монослоем фосфолипидов со встроенными белками 1. Все типы клеток производят липидные капли, но они различаются по размеру, составу липидов и белков украшения. Липидные капли выполняют различные функции, в том числе, выступающие в качестве энергии и предшественников мембраны резервуаров или в виде белковых отложений. Кроме того, через поглощение липидов, они защищают клетки от Липотоксичности, липиды высвобождения в качестве сигнальных молекул, и участвую....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка носителей для стабильного изотопа маркировки с аминокислотами в культуре клеток (SILAC)
Примечание: В данном случае Количественного комплекта SILAC белок - DMEM , дополненный 50 мг 13 С 6 L-аргинин-HCl использовали для маркировки SILAC. Диализовали фетальной телячьей сыворотки (FCS), снабжен Количественное Kit SILAC белка.
- Удалить 50 мл из каждой бутылки DMEM среды и добавляют 50 мл диализованной FCS.
- Растворяют 50 мг 13 C 6 L-лизин-2HCl и 50 мг 13 C 6 L-аргинин-HCl в 1 мл среды. Тщательно перемешать и добавить аминокислоты в среде DMEM + ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
липидные капли имеют жизненно важное значение для инфекции HCV, как предполагаемых участков сборки вириона, но молекулярные механизмы морфогенеза и выхода вирионов в значительной степени неизвестны. Для выявления новых факторов хозяина зависимостей , вовлеченных в этот процесс, мы провели количественный анализ липидов капель протеома HCV-инфицированных клеток 21 (Фигура 1А). Мы установили протокол для очистки капель липидов и обычно обнаруживаемся.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем протокол для выделения липидных капель для количественного анализа липидов капель протеома, чтобы сравнить обогащение и истощение белков, ассоциированных с каплями липидов при различных условиях культивирования, таких как вирусные инфекции. В качестве альтернативного метода, анализ протеома может быть выполнен с количественными этикетками, свободными в расчете на полных интенсивностях пиков. Этот метод не имеет динамическое ограничение диапазона и избегает метаболических проблем. Преимущество SILAC подхо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Р. Bartenschlager (Университет Гейдельберга) для конструкций Jc1, CM Райс (Rockefeller University) для клеток Huh7.5, J Мак-Лошлен (Medical Research Council вирусологии Unit) для JFH1 строительства, T Уэйкита (Национальный институт Инфекционные заболевания, Япония) для JFH1 и B Уэбстер и Ук Грин (Гладстон Институт вирусологии и иммунологии) для репортер конструкций HCVcc. Эта работа была поддержана за счет средств от DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, и INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Pette Институт Heinrich, Лейбниц Институт экспериментальной вирусологии поддерживается Вольного и Ганзейского города Гамбурга и Федеральным министерством здравоохр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для количественного определения белка SILAC - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-аргинин-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x Концентрат | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-Tris-Glycine - Buffer | Geyer Th. GmbH & Ко.KG | А1415,0250 | |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 | |
| Пенициллин/стрептомицин раствор для клеточных культур | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Фосфатно-солевой буферный раствор Dulbecco's | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| Трипсин-ЭДТА | Сигма-Олдрич Хеми ГмбХ | Т3924-100МЛ | |
| Хлорид натрия BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы 5 мл | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Сахароза BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| Соляная кислота (HCl) 37% чистоты Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| Анализ белка DC | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 | |
| Глицерин | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| Бромфенол синий | AppliChem GmbH | A2331 | |
| &бета;-Меркаптоэтанол | AppliChem GmbH | A4338 | |
| Бластицидин | Инвивоген | ant-bl-1 | |
| Хлорид калия | AppliChem GmbH | A1039 | |
| Фенилметансульфонилфторид | AppliChem GmbH | A0999 | |
| Фосфат калия одноосновной | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | ||
| Дикалий гидрогенфосфат | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Обезжиренное сухое молоко | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 &микро; g | abcam | ab47639 | |
| Кальретикулин, pAb 200 &; g | Энцо Лайф Сайенс ГмбХ | ADI-SPA-600-F | |
| Анти-&бета;-тубулин | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Т6074 200&микро; l | |
| Абсолютный этанол (EtOH) | Geyer Th. GmbH & Ко.KG | A3678,0250 | |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 | |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 | |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 | |
| Люми-Лайт Вестерн Блоттинг Субстрат | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | ||
| 96-луночный планшет для культивирования клеток | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 | |
| Шприц Terumo 1 мл | Terumo | SS-01T | |
| Filtropur BT 50, 500 мл, 0,45 &; М | SARSTEDT | 83.1823.100 | |
| Сборные гели Mini-PROTEAN TGX, любой разрешающий гель | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6-луночный планшет для культивирования клеток | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| Посуда Нунклон 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 - 168381 | |
| Скребок для клеток | neoLab Migge GmbH | С-8120 | |
| Тюбик, 50 мл | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal Tube РНКаза не содержит РНКазы; | SARSTEDT | 72.706.400 | |
| Ультрапрозрачные центрифужные пробирки 11 x 60 мм | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| Аспирационные иглы | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere fil. Совет 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 | |
| Biosphere Fil. Чаевые 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| Biosphere Fil. Совет 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Измельчитель тканей | Dounce Fisher Scientific GmbH | ||
| Пестики для цельностеклянных измельчителей салфеток Dounce | Fisher Scientific GmbH | ||
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Термомиксер комфорт, с термоблоком 1,5 мл | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Мини-ПРОТЕЙНЫЙ Tetra Cell, мини-модуль Trans-Blot и базовый источник питания PowerPac, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 Многоразливочная камера | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC Источник питания | BioRad | 164-5052 | |
| Центрифуга | Центрифуга Eppendorf | 5424R | |
| Eppendorf | 5424 | ||
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti Ротор | Beckman Coulter GmbH | ||
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
Ссылки
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
