Методическая статья

Использование чрезвычайных оптической передачи для количественного определения сердечного биомаркеров в сыворотке крови человека

DOI:

10.3791/55597

⸱

13 декабря 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа описывает метод литография nanoimprinting для изготовления высококачественных зондирования массивы, которые работают на принципе чрезвычайных оптической передачи. Биосенсор недорогой, надежный, легкий в использовании и может обнаружить сердца тропонина I в сыворотке в клинически значимых концентрациях (99й процентили среза ∼10-400 пг/мл, в зависимости от анализа).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для платформы biosensing иметь клиническое значение в настройках точки обслуживания (ПСУ) анализа чувствительности, воспроизводимость и способность надежно контролировать аналитов на фоне сыворотки крови человека имеют решающее значение.

Литография Nanoimprinting (NIL) был использован для изготовления, при низких затратах, зондирования областей, как большой, как 1,5 мм х 1,5 мм. Зондирования поверхности был сделан из высокой верности массивов nanoholes, каждый с площадью около 140 Нм2. Большая повторяемость NIL стало возможным использовать один чип, один измерение стратегии на 12 индивидуально готовых поверхностей, с минимальными отклонениями чип на чипе. Эти чипы резонанс (ЛСПР) поверхностного плазмон nanoimprinted локализованные были тщательно протестированы на их способность надежно измерить bioanalyte в концентрациях, колеблется от 2,5 до 75 нг/мл посреди фоне комплекса биожидкостей в этом случае, человеческой сыворотки. Высококачественный NIL позволяет поколения больших зондирования районов, который в свою очередь исключает потребность для микроскопа, как этот биодатчик может легко взаимодействовать с источником света часто лабораторных. Эти Биодатчики можно обнаружить сердца тропонина в сыворотке с высокой чувствительностью, при пределе обнаружения (LOD) 0,55 нг/мл, который является клинически значимых. Они также показывают низкой дисперсией чип на чипе (из-за высокое качество процесс изготовления). Результаты соизмеримы с широко используемым энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA)-на основе анализов, но этот метод сохраняет преимущества ЛСПР зондирования платформы (то есть, ограниченой миниатюризации и мультиплексирование, что делает его более реальным для приложений POC).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химические датчики, основанные на nanohole массивы были предметом многочисленных исследований, поскольку Эббесен et al. 19981был опубликован первый доклад о чрезвычайных светопропускания (EOT). Когда свет падает на периодические массивы структур nanohole аспектов подпункта волны, расширенной передачи происходит на конкретные длинах волн. Это происходит, когда падающего света пары с поверхности поляритон блох волны (BW-SPP) и/или локализованные поверхностных плазмонов (LSP)2.

Основной физический принцип, эксплуатируемых при простой biosensing с такие периодические массивы. Адсорбция молекул на или вблизи интерфейс металла изменяет диэлектрическая константа среды при соприкосновении с металлом, в свою очередь смены местоположения передачи полос в спектре. Спектр, сама может быть отрегулирован нано Инжиниринг в форму, размер и разделения расстояние3,4,5. Дизайн датчики, основанные на СРВ имеют характерные полосы в их спектры, которые облегчают конкретных заданий6,,78 в ходе расследования молекулярных привязки событий. Это решающее преимущество над коммерчески доступных поверхностного плазмон резонанс (СРП) платформах.

Датчики с помощью СРВ обычно включают источника света, оптически выровнены таким образом, что коллимированном пучке инцидента на поверхности зондирования. Методы для создания больших nanohole поверхности, такие как шаблоны Кополимер и вмешательства и литография наносферы, имеют плохой воспроизводимости9. Из-за этих ограничений в точно изготовить большие поверхности, которые показывают явления EOT оптический микроскоп был обязан правильно позицию источника света и детектора. Чтобы упростить техника, высокое качество nanoimprinting литография работал (NIL)10 . Это позволило производство больших датчик поверхностей11 (Шкала мм), избавляя от необходимости для микроскопа искать зондирования поверхности на чипе. Вместо этого этот датчик может быть легко сопряжена с стандартные волоконно-оптического кабеля.

Так как вершины передачи для этого массива nanohole, содержатся в видимую область ближней ИК-области спектра (NIR), это идеально подходит для зондирования события привязки для биомолекул в водной среде. Моделировалась ожидаемое поведение оптических nanohole массива. Результат был затем проверяется путем исследования с жидкостями стандартных преломления (РИ). Этот массив затем был использован для измерения концентрации сердечной тропонина I (cTnI) в сложных фоне человеческой сыворотки. cTnI является клинической золотым стандартом для диагностики острого инфаркта миокарда.

Используя этот датчик, это возможно для выявления и количественной оценки cTnI в сыворотке крови человека при пределе обнаружения (LOD) 0,55 нг/мл, который является клинически значимых. Обнаружение гораздо быстрее, чем наиболее часто используемые технологии в этой области, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). Кроме того, зондирования поверхности могут легко быть регенерировано и поэтому повторно. Таким образом эта работа показывает обещание nanohole массивы как жизнеспособного точки обслуживания (POC) технология для biosensing в сложных biofluids.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление датчика и приобретение данных

  1. Подготовка формы никель
    1. Слой 220 Нм толстый слой отрицательных электроннолучевые устоять на 600 мкм толщиной 4-в кремниевой пластины. Разработан nanohole массив напишите на этой пластины с помощью системы литографии пучка электронов.
      1. Для ускорения e луч писать, писать узоры с низкой dotmap (N) 20k для каждого размера поля 300 мкм (A) (то есть, там являются 0,4 млрд точек сопоставления по каждой области2 300 мкм, и каждая точка либо будут подвергаться e-луч, или нет в зависимости от шаблона дизайна). Установите дозы облучения электронным пучком сопротивляться для сопротивляться до 110 см µC−2 и писать на ток (I) 800 ПА.
        Примечание: В письменной форме электронным пучком, дозы облучения (D) контролируется время экспозиции для каждой точки (точкаТ), рассчитывается по figure-protocol-1 . Для дозы облучения в 110 см µC−2e луч жилище на каждом подвергаются точка время 0.5 µs12. Поскольку массив захватывает площадью 1,8 мм2, есть в общей сложности 36 патчи 300 µm2 поля областей сшили один большой, золото nanohole массив.
    2. Разработка сопротивляться, погружая 4 дюймовый кремниевой пластины в решении разработчик для 10 s и позволяя вафельные высушить на воздухе.
    3. Хранение семян слой металла, таких как никель, медь или алюминий, на кремниевой пластины.
    4. Гальваническим вафля в систему покрытия в ванну Фтороборат никеля. Осуществляют гальваники в два этапа. На первом шаге, прочного 95 мин, используйте плотность тока 0,7 A dm−2; Это полностью заполняет nanopatterns никеля. На втором шаге, 125 мин, используйте 12 A dm−2 до 300 мкм, как плесень толщина окончательного никеля (20 Нм). Убедитесь, что значение рН на 3,5-3,8 и что температура составляет 52-54 ° c.
    5. Отделите никель плесень от кремниевой подложке путем применения нежный механической силы. Замочите плесень никеля в около 100 mL реагента позитивного фоторезиста удаления ночь чтобы смыть остатки от e луч сопротивляться.
    6. Кормить плесень никеля в духовке и сухой на 100 ° C в течение 3 ч. очистить его в плазме травления системы с O2 газ на 10 sccm и 100 Вт на 3 мин.
  2. Изготовление золотой наноструктур
    1. Пальто 150 мкл трихлорсилана гептадекафтор-1,1,2,2-tetrahydrodecyl (FDTS) на никель плесень в самостоятельной сборки монослоя (SAM) покрытие машины на 80 ° C.
      Примечание: Это будет формируют антиадгезионными слой, который позволит отделение формы от фоторезиста («распалубки») после завершения шага nanoimprinting. Испарения время должно быть 180 s и время реакции должно быть 900 s.
    2. Выходные nanopatterns на 4 - в стеклянных пластин, что были покрыты слоем 300 Нм толстые фото отверждаемыми NIL противостоять с помощью нано надпечатки на давление до 10 бар и температуре 40 ° C на 10 мин.
    3. Плесень, фоторезист и стеклянных пластин передавать свет УФ отверждения системы и photocure с 75 МВт см-2 УФ облучения для 30 s.
      Примечание: Если все действия выполнялись правильно, никель плесень должен легко быть demolded из фоторезиста.
    4. В реактивного ионного травления (РИ) системы, выполняют пустой etch фоторезиста на стеклянной подложке, с потоком газа2 O 10 sccm, 50 Вт для 2 s подвергать стекла на отступы районы.
    5. Депозит 5 Нм толстый слой хрома (Cr) для металлических адгезии и 100-nm покрытие из золота (Au) для плазмонных датчика на пластины стекла в машине электронно лучевые осаждения. Использовать скорость осаждения 1 Å s−1 для Cr и 2 Å s−1 для АС.
    6. Выполните старт фоторезиста O2 плазменного травления на 3 мин, последовал шаг 15-s озвучивания в ацетоне.
    7. Кости образца в 5 × 5 мм фишки. Nanohole массив будет занимать Центральной 2 мм × 2 мм чипа.
  3. Приобретение данных
    1. Установите вверх аппарат, чтобы сделать оптических измерений, что луч белого света, выхода до конца волокна оптический передатчик является коллимированного и инцидент на поверхности датчика (nanohole массив) под углом 90°.
      Примечание: Свет передается через весь nanohole массива.
    2. Собирать передаваемого сигнала с приемника оптического волокна и записать его с УФ видимые спектрометр, работающих в диапазоне от 300 до 1000 Нм.
    3. Установите время приобретения для каждого кадра 20 г-жа средняя 100 кадров для получения окончательного спектра для снижения шума в измерениях.
    4. Использование печати программное обеспечение для анализа данных, основанные на ранее выявленных передачи пиков (с помощью метода, основанного на Лоренца).

2. Датчик массового чувствительности тест

  1. Депозит стандартной жидкости ри в жидком клетку, с ри варьируется от 1,31 до 1,39.
  2. Погружать датчик чип в стандартной жидкости Ри и привести его в соответствие с луч белого света. Получение спектра передачи.
  3. Очистите датчик чип после каждого измерения с поверхностно-активными очистки реагента и высушить его с газом азота.

3. датчик модификация поверхности

  1. До любых химических изменений очистите обломоки датчика путем последовательного погружения в изопропиловый спирт, ацетон и деионизированную воду. Сухой при комнатной температуре в потоке газа сухим азотом.
  2. Инкубируйте обломоки датчика в спиртовой раствор 0,4 мм 1,6 мм и 10-карбоксильную-1-decanethiol 1-octanethiol за 12 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Это форма Амин реактивной самосборки монослоя (SAM).
  3. Использование этанола в тщательно промойте и просушите при комнатной температуре.
  4. Сделайте смесь 75 мм сульфогруппу N-оксисукцинимидного (сульфогруппу NHS) и 15 мм 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды (EDC). Погружайте фишки в этой смеси на 15 мин.
    Примечание: Это будет активировать карбоксильные группы SAM.
  5. Месте 50 мкл раствора 200 мкг/мл антитела анти тропонина в буфер рН 4.5 ацетата на поверхности датчика и Инкубируйте 30 мин.
  6. Деактивируйте непрореагировавшего эфиры, погружая микросхема датчика в растворе этаноламина HCl 1 M на 15 мин.
  7. Промойте чип деионизированной водой и высушить в потоке газа сухим азотом при комнатной температуре.

4. cTnI Assay

  1. Заблокируйте любой неспецифичный привязки, кровянистые выделения 100 мкл бычьим сывороточным альбумином (БСА) 1% раствора на поверхность.
Инкубируйте 15 мин.
  • Промывайте обломоки датчика три раза в фосфат амортизированное физраствора (PBS). Вставьте чип в ячейку измерения для записи передачи спектра.
    Примечание: Это ссылка спектра.
  • Месте 50 мкл cTnI стандарта на поверхности чипа и инкубировать в влажной среде для 30 мин.
  • Промойте обломоки датчика три раза в растворе PBS и вставьте его в ячейку измерения для записи передачи спектра.
    Примечание: Это после привязки спектра.
  • Опускайте фишки в 50 мм глицин HCl (рН 2) за 1 мин, а затем промыть в растворе PBS три раза для регенерации поверхности чипа. Измеряйте спектры пропускания в PBS для проверки успеха этапа регенерации.

    • 5. поверхностного плазмон резонанс (СРП) измерение

    1. Запустите мультиплексированных микросхема датчика СРП на системе СРП с PBS-T буфера.
      Примечание: Состав буфера PBS-T является 20мм Na фосфат, 150 мм NaCl и 0,05% 20 анимации. PH-7,4.
    2. Использование стандарта cTnI и антитела, как описано в шаге 4.
    3. Активируйте 3 из 6 доступных каналов с смесь EDC (0,2 М) и сульфогруппу NHS (0,05 М) для 5 минут выполнения инъекций 5 min 50 мкг/мл антитела 560 и 5-мин инъекционного раствора этаноламина HCl 1 M.
    4. Поворот на 90° микросхема датчика и придать cTnI стандартов в различных концентрациях (75, 30, 7.5 и 2,5 нг/мл).
    5. Наблюдать за спряжение для антител в точках взаимодействия на чип в реальном времени через индикация СРП.
    6. Регенерировать чип путем инъекций 50 мм глицин HCl (рН 2) за 1 мин.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Оптическая для измерений показана на рисунке 1A. Изображения фактической nanohole массива приводится на рисунке 1B. Чтобы понять физику движения зондирования процесс, программное обеспечение моделирования COMSOL был использован для моделирования распространения плазмонных поля в водной среде. Результаты моделирования затем были связаны с фактической измерения. Ранее опубликованные исследования содержит подробное описание допущени...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Моделирование взаимодействия падающего света и наноструктур делает возможным определить соответствующие пик (в спектре передачи), чьи сдвига может быть записано как функция концентрации аналита. Важно отметить, что локализация полос относительно структуры датчика имеет решающее значение для выбора права группы, чьи сдвиг может отслеживаться в смысле аналита. Визуализация может быть достигнуто путем моделирования. Это также важно для разработки оптимальной структуры, которая позволяет biosensing аналитов. Как видно здесь,...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы имеют без финансовых интересов.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    AP признает поддержку проф T Venkatesan, директор, NUS нанонауки и нанотехнологии инициативы и Канцелярии заместителя президента (национальный университет Сингапура) (R-398-000-084-646). ХЗЛ признает поддержку из Сингапура министерства от здравоохранения Национальный совет медицинских исследований под его врач ученый схемы финансирования, NMRC/CSA/035/2012 и в национальном университете Сингапура. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Установка электронно-лучевой литографииElionix ELS 700
    o-XyleneSigmaAldrich 95662
    EB резистSumitomoNEB-22A2
    Проявитель реагентаShipley CompanyMicroposit MF 321
    Гальваническая машинаTechnotrans AG RD 50
    Фоторезист для стриппера Электронные материалы Rohm and Haas  ООО«Микропозит Ремувер 1165
    Система травленияТрион Фантом
    Гептадекафтор-1,1,2,2-тетрагидродецил)трихлорсилан»Gelest (Пенсильвания, США)78560-44-8
    Коатер SAM Сорона Инк.AVC 150M
    Фотоотверждаемая технология микросопротивления NILGmbHmr-UVCur21-300nm
    Система светоотвержденияDymax Модель 2000 Flood
    E-beam Bench Disposition DentonExplorer
    UV-видимый спектрометр Ocean optic HR2000+ (Данидин, Флорида, США)
    Жидкости со стандартным показателем преломления Cargill Inc (Сидар Гроув, США)18032
    Программное обеспечение для построения графиковOriginOrigin Pro 9
    10-карбокси-1-деканэтиол Dojindo Laboratories (Япония)C385-10
    1-октанэтиолSigma-Aldrich, MO, США 471386
    сульфо-N-гидроксисукцинимид и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид BioRad (CA, США)1762410
    Антитропониновое антитело 560Hytest (Финляндия)4T21
    Раствор этаноламина-HClBioRad (CA, США)1762450
    Установка поверхностного плазмонного резонансаBioRad XPR36 (Хайфа, Израиль)
    Мультиплексный чип SPRBioRadGLC
    Human cTnI стандартPhoenix ФармацевтикаЭК-311-05
    Глицин-HClBioRad (CA, США)1762221

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10 (3), 0120974(2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи