Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Точный подход к клеточной абляции для моделирования острой почечной недостаточности при развитии рыбок данио

6.1K просмотров

DOI:

10.3791/55606

3 июня 2017 г.

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе представлена ​​новая модель сегментарного повреждения почек in vivo с использованием трансгенного даниофата почки GFP. Модель позволяет индуцировать целенаправленную абляцию эпителиальных клеток почек, чтобы показать клеточные механизмы повреждения и восстановления нефронов.

Аннотация

Острая почечная травма (AKI) является распространенным заболеванием с высокой смертностью. С восстановительными способностями почки можно восстановить адекватную функцию почек после поддерживающего лечения. Тем не менее, лучшее понимание того, как происходит смерть и восстановление клеток нефронов на клеточном уровне, необходимо для минимизации гибели клеток и для улучшения процесса регенерации. Пронефрос рыбок данио является хорошей модельной системой для достижения этой цели, поскольку содержит анатомические сегменты, сходные с нефроном млекопитающих. Раньше наиболее распространенной моделью, используемой для исследования повреждения почек у рыб, была фармакологическая модель гентамицина. Однако эта модель не позволяет обеспечить точное пространственно-временное управление травмой, и, следовательно, трудно исследовать клеточные и молекулярные процессы, связанные с восстановлением почек. Чтобы преодолеть это ограничение, эта работа представляет собой метод, с помощью которого, в отличие от подхода гентамицина, специфический зеленый люминесцентный белок (GFP) -exПрессовый нефронный сегмент может быть фотоизолирован с использованием фиолетового лазерного излучения (405 нм). Эта новая модель AKI дает много преимуществ, которых не хватает другим методам эпителиального повреждения. Его главными преимуществами являются способность «набирать» уровень травмы и точный пространственно-временный контроль в устойчивой модели животного животного in vivo . Этот новый метод может значительно повысить уровень понимания механизмов повреждения почек и восстановления.

Введение

Острая почечная травма (AKI) 1 , 2 , которая также может упоминаться как острая почечная недостаточность, широко определяется как внезапное нарушение функции почек 3 . Хотя уровень понимания этого состояния значительно улучшился за последние годы, показатели заболеваемости и смертности остались высокими 1 , 2 . Текущая обработка этого состояния в основном благоприятна, поскольку результаты нескольких клинических испытаний лекарственной терапии были отрицательными 4 , 5 ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных для остеопатической медицины NYITCOM (NYICCOM IACUC). Все операции и эксперименты in vivo проводились под трикаиновой анестезией, и все усилия были направлены на минимизацию страданий.

1. Получение и поддержание эмбрионов

  1. Получают эмбрионы, пересекая почки GFP люминесцентные данио.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Примеры флюоресцентно меченных трансгенных линий данио представлены в таблице 1 .
  2. <....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обратите внимание, что этот протокол успешно использовался с несколькими трансгенными линиями почки GFP, включая ET (krt8: EGFP) sq1111, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 и Tg (atp1a1a.4: GFP). Примеры, показанные здесь, были получены с использованием линии ET (krt8: EGFP) sq1111.

На рисунке 1 показан пример протокола фотоаблации. Средняя интенсивность GFP контролируется в интересующей области (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Следует отметить, что общая мощность лазера изменяется между системами. Тем не менее, использование процента фотообесцвечивания GFP позволяет считывать полную энергию, подаваемую на флуоресцентную почку, независимо от изменения мощности лазера и компенсируется длительностью воздействия. Имейте в виду, однако, что реакция различных тканей на этот метод фотоабляции меняется. Даже при созревании почек значительно более сложно получить 50% -ное снижение флуоресценции GFP у молодых эмбрионов, чем у зрелых личинок. Эти различ.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Иэна Драммонда и доктора Владимира Коржа за распространение трансгенных линий почки GFP. Мы также хотели бы поблагодарить NYITCOM за предоставление необходимых ресурсов для проведения этой работы. Это исследование частично поддерживалось грантами: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) и пилотным грантом HSCI (AV).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки Петри, 35 x 10 ммGenesee Scientific32-103Процедурное применение: Шаг 2.4, 2.7
Чашки Петри, 100 x 15 ммMidwest Scientific910Процедурное применение: Шаг 1
Дехоринация щипцов - Электронная микроскопия Sciences Dumont Tweezers 5 DumostarFischer Scientific50-241-57Процедурное применение: Шаг 2.1.1
Пластиковый переносной пипеточныйглобус Scientific135030Процедурное применение: Шаг 2.5, 3.6
ТрикаинСигма ОлдричA5040-25GПроцедурное применение: Шаг 2.3, 3.4
АгарозныйFischer ScientificBP165-25Процедурное применение: Шаг 2.3
Вытянутый стеклянный зонд (изготовленный вручную из стеклянных капиллярных трубок)Fischer Scientific21-1640-2CПроцедурное применение: Шаг 2.4
СтереомикроскопNikonSMZ1270Процедурное применение: Шаг 1.5
Световой модуль SOLALumencorSOLA SM-5-LCR-SBПроцедурное использование: Шаг 1.5
Система конфокального микроскопа Eclipse C2 PlusNikon: Шаг 3
1x E3 РешениеИспользуемая рецептура для получения: 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2 , 0,33 мМ MgSO4 Процедурный шаг Использование: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTUSigmaP7629-10GПроцедурный шаг Использование: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
Элементы NIS Программное обеспечениеNikonC2+Процедурное применение: Шаг 3
Лазерная установкаAgilentMLC 400Процедурный шаг 3.11
Propidium Йодид (PI)Sigma AldrichP4170-100MGПрименение процедурного этапа: 4.2
Процедурное использование

Ссылки

  1. Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
  2. Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Inj....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFPpronephros