Методическая статья

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55610

⸱

20 апреля 2017 г.

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Баддинги дрожжей является выгодной моделью для изучения динамики микротрубочек в естественных условиях из - за свою мощную генетику и простоту его микротрубочки цитоскелета. Следующий протокол описывает, как преобразовать и культуру дрожжевых клеток, приобретают конфокальной микроскопии изображений и количественного анализа динамики микротрубочек в живых дрожжевых клеток.

Аннотация

Динамические микротрубочки являются основой для многих клеточных процессов, а также точные измерения динамики микротрубочек могут дать представление о том, как клетки регулируют эти процессы и как генетические мутации регулирования воздействия. Количественные динамики микротрубочек в многоклеточных моделях имеют целый ряд связанные с этим проблемами, в том числе с высокой плотностью микротрубочек и ограничения на генетических манипуляциях. В отличие от этого, начинающая модель дрожжей обеспечивает преимущества, которые позволяют преодолеть эти трудности. Этот протокол описывает метод измерения динамики одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток. Клетки, экспрессирующие флуоресцентно меченый тубулин приклеивают к собранным камерам скольжения, что позволяет для стабильного получения изображения в заданном промежутке времени. Подробное руководство для высокоскоростных, приобретение четырехмерного изображения также обеспечивается, а также в качестве протокола для количественной оценки свойств динамических микротрубочек в конфокальной стеке изображения. Этот метод, в сочетании с обычной дрожжевой генетикой, прыIDES подход, который уникально подходит для количественного оценки влияния регуляторов микротрубочек или мутаций, которые изменяют активность тубулина субъединиц.

Введение

Микротрубочки цитоскелета полимеры, изготовленные из ар-тубулина белковых субъединиц и используются в самых разнообразных клеточных контекстах, в том числе внутриклеточного транспорта, деление клеток, морфогенез и моторики. Для построения микротрубочек сетей для этих разнообразных ролей, клетки должны тщательно регулировать, где и когда микротрубочки формы. Это регулирование осуществляется путем регулирования реакции, которые либо собрать ар-тубулин микротрубочек субъединиц в полимеры или разбирать микротрубочки в свободные субъединицы; это известно как динамики микротрубочек.

Основная цель поля микротрубочек является выяснение молекулярных механизмов, которые регулируют динамику микротрубочек, в том числе исследования в ае-тубулина подразделений и внешних регуляторов, которые связываются с тубулина и / или микротрубочек. Хорошо установленный экспериментальный подход является воссоздать эту систему в пробирке с использованием очищенного тубулина-аром белка, часто в комание с очищенными внешними регуляторами. Несмотря на то, что это полезный подход, очевидно, что динамика микротрубочек в реконструированных системах сильно отличается от наблюдаемой в живых клетках. Например, микротрубочки растут быстрее и медленнее сокращаться в естественных условиях , чем в пробирке. Эти различия могут быть отнесены к доступности известных внешних регуляторов 1, а также пока-неопределенных факторов в клетках. Поэтому крайне важно, чтобы определить деятельность регуляторов микротрубочек и мутантов, которые нарушают динамику нативную сотовой связи.

Хотя многоклеточных модели оказались преобладающими системами для исследования функции микротрубочек и организаций высшего порядка, несколько практических проблем серьезно ограничивают полезность этих моделей для точного измерения динамики микротрубочек. Во-первых, большое число микротрубочек, начиная от десятков до тысяч на клетку, затрудняет уверенноотслеживать отдельные микротрубочки в течение долгого времени. Во многих исследованиях решить эту проблему с помощью визуализации белков, которые селективно локализовать с микротрубочками концов, такие как белки в семействе конечного связывания (EB). Тем не менее, эти белки , как известно, только локализовать на концах растущих микротрубочек в многоклеточных 2. Таким образом, полезность этих белков ограничивается непосредственным измерением темпов роста, в то время как только косвенно измерения других аспектов динамики, такие как частота катастрофы. Во-вторых, несмотря на успехи в редактирования генома технологии, создание клеток, которые стабильно экспрессируют флуоресцентно меченого тубулина или введения мутации избирательно манипулировать тубулина микротрубочек или регуляторов остается серьезной проблемой. Кроме того, наличие многих тубулина изотипов в многоклеточных путает исследование того, как мутации влияют на отдельные гены тубулина.

Почкованием система дрожжей обеспечивает несколько важных преимуществ для измерения в естественных условиях microtubuДинамика ля. Дрожжи имеет упрощенные микротрубочки сеть, которая позволяет визуализировать отдельные микротрубочки. В дрожжах, микротрубочки исходят из организации центров , известные как веретена полюсных тел (SPBS), которые встроены в ядерной оболочке 3. В SPBS служит в качестве каркасов для гаммы-тубулина небольших комплексов , которые пузырьковых микротрубочкой 4, 5. SPBS зарождаются два класса микротрубочек, микротрубочки веретена и астральных микротрубочек. Шпиндельные микротрубочки проект в нуклеоплазму и имеет важное значение для крепления к хромосомам с помощью кинетохорных микротрубочек и для стабилизации шпинделя с помощью перекрывающегося межполюснома микротрубочки 6. В противоположность этому, астральные микротрубочки проект наружу в цитозоле и относительно редко по сравнению с плотной сетью микротрубочек веретена. Во время митоза, предварительно анафаза клетка имеет только 1-2 астральных микротрубочки, исходящие от любого SPB; они существуют, как яndividual микротрубочки , а не как пучки 7. Ролью астральных микротрубочек во время митоза является перемещение ядра и шпинделя в стык между матерью и бутоном отсеками, известными как бутон шея. Это движение предполагает четко определенные пути , которые генерируют силы на астральных микротрубочках, натягивая ядро и шпиндель в направлении и в конечном счете в шейку почки 8.

Еще одним преимуществом системы дрожжей является полезность его генетики, которые могут быть использованы для исследования регуляторов микротрубочек и тубулина субъединицы с беспрецедентной точностью. Дрожжи также обладают упрощенным репертуаром тубулина изотипов: один β-тубулином гена (TUB2) и два альфа-тубулином генов (TUB1 и TUB3). Мутации могут быть легко введены в эти гены , и , таким образом , исследовались в гомогенной популяции тубулина 9, 10. Есть целый ряд широкоимеющиеся конструкции для маркировки микротрубочек, и они могут быть направлены на интеграцию в хромосомных локусах для стабильной экспрессии (см Обсуждения).

Общая цель этого метода состоит в изображения одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток в четырех измерениях (X, Y, Z и T) для измерений с высокой разрешающей способностью динамики микротрубочек. Способы интеграции конструкций для конститутивной, низкого уровня экспрессии флуоресцентно-меченного тубулина в клетках дрожжей описаны. До начала обработки изображений, живые клетки смонтированы в слайде-камеры, покрытых лектин Конканавалин A, чтобы стабилизировать клетки для долгосрочной визуализации. Оптимальные параметры для получения изображения, а также рабочий процесс для анализа данных, также описаны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Тарелки-Leu отсева

  1. Добавить 800 мл стерильной деионизированной воды (DIH 2 O) в 2 - литровую колбу. Добавить 26,71 г порошка основы отсев (DOB), 0,69 г CSM-Leu, и 20 г агара. Смешать с магнитной мешалкой. Довести до 1 л с DIH 2 O.
  2. Автоклаве при 121 ° C и 19 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 мин.
  3. Удалить колбу из автоклава и дать ему остыть до ~ 65 ° С при осторожном перемешивании.
  4. Налейте 30 мл / планшет в пластинах диаметром 100 мм. Пусть они сидят при комнатной температуре в течение 36-48 ч перед хранением при 4 ° С.

2. Интеграция GFP-Tub1 для конститутивной экспрессии GFP-меченых тубулина

  1. Отварить запас концентрация 10 мг / мл одноцепочечной ДНК (оцДНК) в течение 3 мин.
  2. Смешайте 2 мкл вареного оцДНК с 400 нг очищенного GFP-Tub1 плазмидной ДНК 11.
    Примечание: Существует различные плазмиды, которые могут быть использованы для стабильного, флуоресцентного мечениямикротрубочек у дрожжей, которые используют альтернативные флуорофоры и селективные маркеры. Некоторые из этих альтернатив описаны в разделе обсуждения.
  3. Добавьте смесь ДНК в 50 мкл аликвоты компетентных клеток дрожжей.
    Примечание: Подготовка компетентных клеток дрожжей с раствором сорбита (Сорб; 100 мМ LiOAc, 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА, рН 8, и 1 М сорбита, доводили разбавленной уксусной кислотой до рН 8). Подробное описание создания компетентных клеток дрожжей, см ссылку 12.
  4. Vortex тщательно.
  5. Добавить 6x общего объема полиэтиленгликоль (ПЭГ) раствора (100 мМ LiOAc, 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА / NaOH, рН 8, и 40% PEG3350) к смеси ДНК-клеток.
  6. Vortex тщательно.
  7. Инкубировать в течение по крайней мере 1 ч при 30 ° С при легком помешивании.
  8. Добавить диметилсульфоксид (ДМСО) до 10% от общего объема и вихря.
  9. Инкубируют при 42 ° С в течение 15 мин.
  10. Центрифуга при 2500 мкг в течение 5 мин.
    11. Удалить супернатант и суспендирования клеток в 100 мкл DIH 2 O.
  11. Пластина клеток на качестве -Leu выбывания пластины.
    Примечание: Конструкция GFP-Tub1 содержит лейцин ауксотрофного маркера, в то время как другие конструкции могут использовать альтернативный маркер. Отсев среда должна быть специфической для ауксотрофных маркеров конструкции.
  12. Разрешить трансформированные клетки расти в течение 3-5 дней при 30 ° С.
  13. Re-полоски трансформация отдельные колонии на свежей -Leu отсева пластины путем переноса колоний с использованием автоклавной зубочистки. Инкубируйте планшет в течение ночи при 30 ° C.
  14. Визуально экран каждый трансформант для сигнала GFP суспендированием приблизительно 1 мкл клеток из одной колонии от пластины на этапе 2.14 в 2 мкл воды на чистую слайд. Накройте приостановленные клетки с покровным и наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии.
    1. Возбуждают трансформантов с 488 нм света и посмотреть на наличие сигнала GFP.
      Примечание: Этот шаг может использовать вращающийся диск конфокальной микроскопии, а Widefield микроскоп оснащен объективом 100X и соответствующей оптики для визуализации GFP будет достаточно. Клетки без видимых GFP-меченых микротрубочек, или те, с аномально высокой флуоресценцией, должны быть отвергнуты. После этого, штаммы дрожжей готовы культивировать для получения изображения.

3. Выращивание Жидкое дрожжевая культура

  1. Инокулируйте ~ 1 мкл клеток дрожжей из одной колонии на пластине в 3 мл синтетической полной среды. Разрешить клеткам расти в течение ночи при 30 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
  2. Развести насыщенную культуру на следующий день до OD 600 <0,1 в среде. Возвращение разбавленных культур в 30 ° C шейкер в течение 3-4 ч или до OD 600 составляет от 0,4 до 0,8, когда клетки готовы к загрузке в камеры для обработки изображений.

4. Подготовка потока Камерный Слайды

  1. Порезлист парафиновой пленки в часть 4 в ширину и 7 в длину.
  2. Поместите стандартный микроскоп в продольном направлении по ширине на 4 дюйма из парафиновой пленки и обернуть пленку вокруг слайда в 3-4 раза, так что ползун покрыта пленкой, которая имеет толщину 3-4 слоя. Нажмите слои вместе, чтобы обеспечить там разумное уплотнение; это будет сделать легче резать. Не нажимайте слишком сильно, в результате чего фильм морщин.
  3. Вырезать парафиновую пленку вдоль внешних краев слайда, используя чистую коробку резак бритву. Используйте другой слайд, чтобы обеспечить прямой край для резки.
  4. Пил излишки пленки от рабочего ползуна и выбросить. Остальные стопки пленки будет охватывать одну поверхность слайда и будет использоваться, чтобы сделать стены между камерами формирования изображения.
  5. Использование второго слайда в качестве прямого края, разрезать сложенные слои пленки вдоль длинной оси ползуна в приблизительно десять полос, каждая 2-4 мм в ширину.
  6. Нарезать сложенные слои парафиновой пленки перпендикулярноразрезы, сделанные в шаге 4.5, вдоль короткой оси ползуна, чтобы создать полоски 2-4 мм шириной, 23-24 мм в длину и 3-4 слоев толщиной.
  7. Пил нарезанные полоски с помощью бритвы под углом 45 °. Использование щипцов, равномерно распределить полоски отрезанные пленочные на чистом предметном стекле микроскопа, чтобы создать требуемые количества камер. До 3 камеры (сделанная с 4-парафиновой пленкой полосок) может быть создана на одном слайде.
  8. Поместите один покровный поверх полоски пленки и переместить его в нужном положение при помощи щипцов.
  9. Поместите подготовленный слайд, покровный вверх, на плите, установленной при ~ 95 ° C (это примерно низкая средней установка на большую часть конфорок). Нагреть слайд, пока полоска пленки не являются прозрачными (приблизительно 3 мин), а затем запечатать слайд и покровный вместе, слегка нажав на покровном с помощью пинцета.
    Примечание: Важно только прессы по регионам покровных, которые непосредственно над полосками парафиновой пленки, как и царапать регионы выше сhambers может снизить качество изображения. Позаботьтесь, чтобы не перегреть слайд; испаренный пленка будет покрывать внутри камеры с гидрофобной пленкой, которая предотвращает клетки от присоединения.
  10. Используйте пинцет, чтобы удалить слайд из конфорки (слайд будет жарко) и установить ее в стороне, чтобы охладить с боковым покровным лицевой стороны вверх; как слайд охлаждается, пленка будет возвращаться к белой непрозрачной окраске.
    Примечание: На данный момент, слайды будут готовы к загрузке с культивируемыми клетками дрожжей. Дополнительные слайды могут быть сделаны в эту точку и хранить в чистом и сухом месте в течение неопределенного периода времени.

5. Загрузка дрожжевых клеток в Подготовили Flow камерных Слайды

  1. Оттепель замороженный, 200 мкл аликвоты конконовалина А (2 мг / мл в стерильном DIH 2 O).
  2. Добавьте примерно 100 мкл размороженного конконовалина А в каждой камере подготовленного слайд с помощью пипетки в один из открытых концов. Добавьте достаточно конканавалин А чтобы заполнить камеру. Для этого SТЭФ, то конканавалин А будет извлечены через камеру через капиллярное действие.
  3. Повесьте слайд, покровные вниз, между двумя стойками микрофужных трубок или ручками в течение 5 мин , чтобы позволить конканавалин A присоединиться к покровному (т.е. камеры).
  4. Верните бегунок в положение покровного вверх. Промыть камеру с 2x объем камеры (определено на этапе 5.2, выше; приблизительно 200 мкл) синтетического полной среде , чтобы удалить конканавалин A.
    1. Поток среды через камеру, используя либо угол бумажного полотенца или фильтровальную бумагу, сложенную пополам, чтобы привлечь жидкости из одного конца камеры, одновременно пипетки свежей жидкости в другую. В качестве альтернативы, использовать вакуумный аспиратор тщательно засасывать жидкость из одного конца в то время как жидкость пипетки свежей в другую.
  5. Тензодатчики пропусканием 2x объема камеры (приблизительно 200 мкл) клеточной суспензии (со стадии 3.4) с помощью направленного потока Method описано в шаге 5.4.1.
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы изображение один слой клеток на покровном. Поэтому важно, чтобы загрузить концентрацию клеток достаточно малы, что они не складывают друг на друга, но достаточно большой, что достаточные клетки присутствуют в поле, чтобы собрать максимальное количество данных на приобретение изображения. Оптимальная концентрация клеток в камере может варьироваться и должны быть определены эмпирически. Для того, чтобы повысить концентрацию клеток в проточной камере, осторожно осадить культуры клеток при 1000 х г в течение 2 мин и удалить некоторые из надосадочной жидкости. Для того, чтобы уменьшить концентрацию клеток, добавить свежую синтетическую полную среду к клеточной суспензии. Концентрация клеток может быть оценена после шага 5.7 (ниже) путем проверки камеры на фазово-контрастного микроскопа. На данный момент, дополнительные элементы могут быть добавлены к камере путем пропускания более клеточной суспензии. Однако уменьшение плотности клеток в данный момент не представляется возможным, и лучше всего достигаетсяпутем загрузки новой камеры с разбавленной клеточной суспензии.
  6. Повесьте слайд покровные вниз, как описано на стадии 5.3, в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам придерживаться покровного.
  7. Промыть любую прилипшую клетку, протекающими через 4x объем камеры (приблизительно 400 мкла) синтетическую полную среду. Это позволит устранить свободно плавающие клетки в камере, которые могут загрязнять получение изображения.
  8. Тщательно высушить каждый конец камеры с чистым углом бумажного полотенца, в результате чего мениска к краю покровного стекла.
  9. Уплотнение каждого конца камеры с теплой (75 ° С) герметикой (например, VALAP; равные части вазелина, шерсть воск и парафин).
    Примечание: На данный момент, слайд готов к изображению. Камеры могут быть отображены до 9 ч, в зависимости от плотности клеток в каждой камере. Клетки будут производить углекислый газ (CO 2) в течение долгого времени, который будет постепенно создавать пузырьки , которые вытесняют клетки.

6. Image Acquisition

  1. Доведите слайд инвертированного микроскопа, оснащенного 1,45 цели Н.А. 100X CFI Plan Apo, пьезоэлектрического стадии, вращающийся диск конфокальной блок сканера, осветительной лазера и камерой EMCCD. Поддерживать температуру стадии при комнатной температуре (25 ° C) во время приобретения.
    Примечание: Высокая числовая апертура позволяет получить более высокое разрешение изображения, и пьезоэлектрический этап обеспечивает высокую скорость приобретение г-стеку. Минимальные требования микроскопа цель 100X, освещение лазер, и камера EMCCD.
  2. Принесите клетки в фокусе. Убедитесь в том, что поле приобретения имеет по крайней мере 5-6 клеток, собранных вместе, ища слайд для клеток, сгруппированных вместе.
    Примечание: Несмотря на то, что нет необходимости изображения более чем одной ячейки в то время, визуализации несколько ячеек в том же поле повышает эффективность сбора данных без ухудшения качества данных. Тем не менее, это очень важно, чтобыклетки находятся на одной и той же фокальной плоскости, а не сложено на верхней части друг друга.
  3. Программирование многомерного приобретения собрать несколько Z-серию с течением времени.
    1. Настройка параметров в пределах текущих параметров сбора к следующему: общая Z-глубина = 6 мкм, чтобы охватить всю дрожжевую клетку; Z-размер шага = 300 нм, чтобы максимизировать свет коллекцию без передискретизации; Общая продолжительность времени = 10 мин; интервалы времени = Z-серии каждые 4 с; и время экспозиции = 90 мс для каждой плоскости г.
      Примечание: Оптимальное время экспозиции будет варьироваться в зависимости от камеры, источника света возбуждения, и других факторов. В целом, оптимальное время экспозиции будет минимальное время, необходимое для достижения соотношения 3: 1 сигнала от GFP-меченого астральных микротрубочек, чтобы сигнал от цитоплазмы на основе значений пикселов, измеренных с помощью EMCCD.
  4. Начало приобретения, нажав кнопку «Выполнить». Позвольте ему работать в течение всего периода 10 мин. Сохраните данные в виде изображенияряд (.tiff или .nd2).
  5. Выберите новое поле для изображения в камере и повторите шаги 6.2-6.4.
    Примечание: Одна камера должна давать между 15 и 20 полей клеток, в зависимости от плотности клеток в камере. Более высокая плотность клеток будет давать более низкие суммарные поля, как СО 2 в камере будет накапливаться быстрее.

Анализ 7. Изображение

  1. Открыть файл изображения в ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) в качестве HyperStack с использованием био-форматы импортер плагин.
    1. Открытое ImageJ и перетащить полученные стек изображения из секции 6 непосредственно на панели управления. Био-форматы импортер будет запускаться автоматически. Выберите «Ok», чтобы загрузить стек изображения в качестве HyperStack.
      Примечание: «Био-форматы Импорт Опции» подсказки будут открывать и гарантировать, что под «Stack Просмотр», раздел «Просмотр стека с:» установлен в положение «HyperStack»; и "Stack Order:" установлен в положение "XYCZT."
  2. Collapse каждого Z-серию в максимальную интенсивность, 2-мерная проекция с помощью функции Z-проекта.
    1. Выберите меню «Изображение», подменю «Стек» и функцию «Z-проект». Выберите «Максимальную проекцию» из выпадающего списка и нажмите кнопку «Ok».
  3. Применяют медианный фильтр в стек изображения для уменьшения шума зернистость путем выбора меню «Process», «Фильтры» подменю, и «Median» функцию. Введите 2,0 пикселей в поле радиуса и нажмите кнопку «Ok».
  4. Определение предварительно анафазе клеток в этой области.
    Примечание: Они характеризуются средним бутонов и короткой митотического веретена, 1-1,5 мкм в длину (фиг.1; стрелку указывает на короткий митотического веретена). Клетки на данном этапе являются идеальными для анализа динамики микротрубочек, потому что они обычно имеют только Feж астральные микротрубочки , исходящие полюса шпинделя 7. Астральные микротрубочки могут быть идентифицированы в виде линейных волокон, которые демонстрируют равномерную интенсивность сигнала GFP от минус конца, в СПБ, в конце плюс, в цитоплазме.
  5. Начиная с первой временной точкой в ​​серии изображений, с помощью инструмента сегментированных линий, чтобы нарисовать линию вдоль одной астральной микротрубочки, от минус конца, расположенном на стыке между астральной микротрубочкой и более интенсивно меченым шпинделем микротрубочками, к положительному концу , который находится в цитоплазме (см красные линии на рисунке 1). Дважды щелкните на конце микротрубочки, чтобы завершить сегментированную линию.
  6. Запишите измерения в таблице результатов, используя «меру» функцию, нажав на кнопку «M» на клавиатуре.
    Примечание: Дополнительные функции, такие как серые интенсивности, может быть записано путем установки измерения в меню «Анализ» и «Set измерение» подменит.
  7. Переход к следующей временной точке либо нажав правую стрелку в строке Z-слайдер или нажав кнопку «./>» клавишу на клавиатуре. Повторите шаги 7.5 и 7.6 для всех временных точек в последовательности изображений.
  8. Скопируйте данные из таблицы результатов и вставить их в таблицу. Сохраните данные, выбрав пункт «Сохранить как».
    Примечание: Эти измерения будут включать несколько значений, но наиболее важных значения срез, который указует временную точку в серии, и длину, что указует на длину линии (то есть, астральные микротрубочки). Столбцы , содержащие другие измерения (например, область, среднее значение пикселя, угол, и т.д.) могут быть либо сохранить или выбросить.
  9. Создайте новый столбец в таблицу, щелкнув правой кнопкой мыши и с помощью функции «Вставить». Ввод времени (ов) каждой временной точке.
  10. Создание XY график рассеяния длины микротрубочек (мкм) в зависимости от времени (ы) с помощью «Вставить линиюДиаграмма»особенность, выберите измерение длины, как„Y“и столбец время как„X“
    1. Определение области полимеризации, деполимеризации, и паузы, глядя на положительные и отрицательные изменения длины с течением времени на график рассеяния с шагом 7.10.
      Примечание: Полимеризация события увеличивают длину микротрубочек , по меньшей мере , 0,5 мкм , через минимум 3 временных точек и соответствуют линейной регрессии с R 2 ≥ 0,9 и R-значение> 0 (фиг.1В и D, зеленые точки). Деполимеризации событие уменьшает длину микротрубочек , по меньшей мере , 0,5 мкм , через минимум 3 временных точек и соответствует линейной регрессии с R 2 ≥ 0,9 и R-значением <0 (фиг. и D, розовые точками). Пауза событие отделено от полимеризации и деполимеризации. Паузы определяются как чистые изменения в длине микротрубочек менее чем 0,5 мкм через минимум 3 моментов времени;соответствовать линейной регрессии с R-значение между -0.4 и 0.4; и имеют наклон, что статистически не отличается от нуля, как определено с помощью F-теста.
    2. Используя график рассеяния в качестве руководства, определить участки времени, когда изменение длины положительно и выделить их в зеленом цвете. Выделите области времени, когда изменение длины отрицательно в розовом цвете.
    3. Расчет линейная регрессии каждого выделенная раздел и запись R- и R 2 -значения для каждого раздела в столбцах проксимальнее регионы. Классифицировать каждый цветной регион либо как событие полимеризации или событие деполимеризации.
  11. Вычислить скорость полимеризации пути деления чистого изменения длиной изменения во время для каждого события роста. Запишите эти результаты в колонке рядом с линейными значениями регрессии с шага 7.10.3.
  12. Расчет ставки деполимеризации пути деления чистого изменения длиной изменение во время для каждого shrinkinг событие. Записать эти результаты в столбце, прилегающие к значениям скорости полимеризации со стадии 7.11.
  13. Вычислить частоту катастроф путем деления числа полимеризации-к-деполимеризации переходов на общее время всех событий роста 13. Записать эти результаты в колонке рядом значений скорости деполимеризации с шага 7.12.
  14. Вычислить частоту спасательного путем деления числа деполимеризации-к-полимеризации переходов на общее время всех событий усадки 13. Записать эти результаты в столбце, прилегающих к значениям частоты катастрофы с шага 7.13.
  15. Вычислить динамичность путем деления суммы абсолютной величины всех изменений длины по общей продолжительности получения изображения, вычисленных на этапе 7.10.1, и умножения на 27.0833 , чтобы получить тубулин субъединиц в секунду 14. Запишите эти результаты в столбец, примыкающие к спасательной частоте ВалуЕЭС от этапа 7.14 и сохранить таблицу результатов.
    Примечание: Можно автоматизировать процесс анализа , описанный в шагах 7,10-7,15 с использованием заказной программы (. Estrem и др рукопись представлена). Программа предназначена для определения периодов полимеризации и деполимеризации в измерениях длины, следуя параметры, подробно описанные выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Измерение динамики микротрубочек в живых клетки дрожжей предоставляет убедительный инструмент для оценки, как мутации в генах, кодирующих регуляторы микротрубочек или тубулин субъединицы полимеризации удара и скорость деполимеризации, а также частоте перехода между этими состояниями. Рисунок 1 отображает временные ряды астральных динамиков микротрубочек в клетке дикого типа и мутантный клеток с мутацией в бета-тубулине (tub2- 430Δ). Микротрубочки помечены GFP-ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Почкование модель дрожжей предлагает значительные преимущества для сбора измерений с высоким разрешением динамики микротрубочек в обстановке в естественных условиях, в том числе способности к изображению одиночным микротрубочкам с течением времени и способностью манипулировать тубулин и регуляторы микротрубочек с помощью инструментов дрожжей генетики.

Камеры конканавалин A-покрытие обеспечивают ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными аппаратами, в том числе расплавленного аг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Керри Блум (Университет Северной Каролины), Кайунг Ли (NCI), Стивен Маркус (Colorado State University) и Эльмар Шибел (Universität Heidelberg) для совместного использования различных FP-TUB1 плазмид. Мы благодарны Мелисса Гарднер (Университет Миннесоты) для обучения нас в способе подготовки слайд-камеры. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) грант R01GM112893-01A1 (до Jkm) и T32GM008730 (до н.э.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DOB (базы отсева)Sunrise science 1650
CSM-LeuSunrise science 1005
AgarAmerescoN833
100 мм полистирольные пластиныFisher ScientificFB0875713
ssDNA (Samon Sperm)   в стерильном DiH2OSigma-Aldrich   D7656ресуспендирован в концентрации 10 мг/мл в DiH2O. Храните аликвоты при -20 °Ордм; C
Синтетические полные среды Восход солнца наука 1459-100
Конканавалин АСигма-Олдрич L7647ресуспендирует в концентрации 2 мг/мл в DiH2O. Храните аликвоты при -20 °Ордм; C Предметные
стекла для микроскопаFisher Scientific12-544-1
Покровные стекла для микроскопаFisher Scientific12-541-B
ПарапленкаFisher Scientific13-374-12парафиновая пленка
VALAP (Равные части вазелина, ланолина и парафина) C перед использованием
щипцов Fisher Scientific16-100-106
Пойетиленгликоль (ПЭГ) 3350Сигма-Олдрич 202444
Название<strong>Company>Каталожный номерКомментарии
Microscope
Ti E инвертированный микроскоп с идеальным фокусомNikon InstrumentsMEA53100
объектив 1.45 NA 100X CFI Plan ApoNikon InstrumentsMRD01905
Пьезоэлектрическая сцена Physik InstrumenteP-736
Сканер вращающегося дискаYokogawaCSU10
Модуль лазерного сумматораAgilent TechnologiesMCL400B
камера EMCCDAndor TechnologyiXon Ultra 897 
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
Software
NIS Elements программное обеспечениеNikonInstruments MQS31100
Microsoft Excel программное обеспечениеMicrosoft
Программное обеспечение MATLABMathWorks, Inc
ImageJ64NIHRasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, США, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Плагин импорта био-форматовОткрытая среда
NameCompany>Номер в каталоге>Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1pSK1050источник: Сонг, С. и Ли, К. С. Новая функция Saccharomyces cerevisiae CDC5 в цитокинезе. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)
плавится при 75º микроскопии

Ссылки

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи