Методическая статья

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для высокоточных экспериментов FRET на уровне одиночной молекулы. Кроме того, эта методика может быть использована для идентификации трех конформационных состояний в лиганд-связывающем домене рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Определение точных расстояний является первым шагом на пути к построению структурных моделей, основанных на экспериментах FRET.

Аннотация

Здесь представлен протокол о том, как проводить высокоточные измерения расстояний между точками с использованием резонансной передачи энергии Феррером (FRET) на одномолекулярном уровне в режиме многопараметрического детектирования флуоресценции (MFD). MFD максимизирует использование всех «измерений» флуоресценции для уменьшения фотофизических и экспериментальных артефактов и позволяет измерять междоузельное расстояние с точностью до ~ 1 Å в жестких биомолекулах. Этот метод был использован для идентификации трех конформационных состояний лигандсвязывающего домена рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) для объяснения активации рецептора при связывании лиганда. При сравнении известных кристаллографических структур с экспериментальными измерениями они согласуются в пределах менее 3 Å для более динамичных биомолекул. Сбор ряда дистанционных ограничений, охватывающих всю размерность биомолекул, позволит обеспечить структурную модель динамической биомолекулыэс.

Введение

Основная цель исследований в области структурной биологии - раскрыть связь между структурой и функцией биомолекулярных машин. Первое визуальное впечатление о биомолекулах ( например, белках и нуклеиновых кислотах) произошло в 1950-х годах благодаря развитию рентгеновской кристаллографии 1 , 2 . Рентгеновская кристаллография обеспечивает статическую структурную информацию с высоким разрешением, ограниченную упаковкой кристалла. Таким образом, присущая иммобильность рентгеноструктурных моделей избегает динамической природы биомолекул, фактора, который влияет на большинство биологических функций 3 , 4 , 5 . Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 6 , 7 , 8 предоставил альтернативное решение проблемы путем решения структурных моделей в водных растворах. Большое преимуществоЯМР является его способность восстанавливать внутреннюю динамическую природу биомолекул и конформационных ансамблей, что помогает прояснить внутренние взаимоотношения между структурой, динамикой и функцией 3 , 4 , 5 . Тем не менее, ЯМР, ограниченный размером выборки и большим количеством образца, требует сложных стратегий маркировки для более крупных систем. Поэтому существует острая необходимость в разработке альтернативных методов структурной биологии.

Исторически, резонансная передача энергии Ферстера (FRET) 9 не играла важной роли в структурной биологии из-за неправильного представления о том, что FRET обеспечивает низкие точности измерения расстояния. Цель этого протокола - пересмотреть способность FRET определять расстояния в нанометровом масштабе, чтобы эти расстояния можно было использовать для построения структурных моделей биомолекул. Первая экспериментальная проверкаЗависимость R - 6 от эффективности FRET была сделана Стерьером в 1967 г. 10 путем измерения полипролинов различной длины в качестве «спектроскопической линейки». Аналогичный эксперимент был выполнен на уровне одиночной молекулы в 2005 г. 11 . Молекулы полипролина оказались неидеальными, и, таким образом, молекулы двухцепочечной ДНК позднее были использованы 12 . Это открыло окно для точных измерений расстояния и идею использования FRET для определения структурных свойств биомолекул.

FRET оптимален, когда интервал расстояний между точками составляет от ~ 0,6-1,3 R 0 , где R 0 - расстояние Фёрстера. Для типичных флуорофоров, используемых в одномолекулярных экспериментах FRET, R 0 ~ 50 Å. Как правило, FRET предлагает множество преимуществ по сравнению с другими методами в том, что он способен разрешать и дифференцировать структуры и динамику вГетерогенные системы: (i) Из-за предельной чувствительности флуоресценции, одномолекулярные эксперименты FRET 13 , 14 , 15 , 16 могут разрешать гетерогенные ансамбли, непосредственно подсчитывая и одновременно характеризуя структуры своих отдельных членов. (Ii) Комплексные пути реакции могут быть непосредственно дешифрованы в одномолекулярных FRET исследованиях, поскольку синхронизация ансамбля не требуется. (Iii) FRET может получить доступ к широкому спектру временных областей, которые охватывают более чем 10 десятилетий во времени, охватывая широкий спектр биологически релевантной динамики. (Iv) Эксперименты FRET могут быть выполнены в любых условиях растворения как in vitro, так и in vivo . Комбинация FRET с флуоресцентной микроскопией позволяет изучать молекулярные структуры и взаимодействия непосредственно в живых клетках 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , даже с высокой точностью 20 . (V) FRET может применяться к системам практически любого размера ( например, полипропиновые олигомеры 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , ВИЧ-обратная транскриптаза 26 и рибосомы 27 ). (Vi) Наконец, сеть расстояний, которая содержит всю размерность биомолекул, может быть использована для получения структурных моделей статических или динамических молекул 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Поэтому одномолекулярную FRET-спектроскопию можно использовать для получения достаточно точных расстояний, которые можно использовать для структурного моделирования с дистанционным ограничением 26 . Это возможно, используя многопараметрический детектор флуоресценции (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , который использует восемь измерений информации флуоресценции ( то есть спектр возбуждения, спектр флуоресценции, анизотропию, время жизни флуоресценции, квантовый выход флуоресценции, Макроскопическое время, интенсивность флуоресценции и расстояние между флуорофорами) для точного и точного определения расстояний. Кроме того, импульсное чередованное возбуждение (PIE) комбинируется с MFD(PIE-MFD) 42 для мониторинга флуоресценции акцептора прямого возбуждения и выбора одномолекулярных событий, возникающих из образцов, содержащих стехиометрию донор-акцептор 1: 1. В типичной ПИО-МФД-установке используются двухпульсные лазеров с чередующимся возбуждением, соединенные с конфокальным корпусом микроскопа, где детектирование фотонов разбивается на четыре разных канала в разных спектральных окнах и поляризационных характеристиках. Более подробную информацию можно найти на рисунке 1 .

Важно отметить, что FRET должен сочетаться с вычислительными методами для достижения атомно-подобных структурных моделей, которые согласуются с результатами FRET 26 , 30 . Цель настоящего протокола не состоит в том, чтобы перейти к соответствующей методологии для построения структурных моделей с расстояниями, полученными с помощью FRET. Однако эти подходы применяются в сочетании с другими методами ( например, малоугловое рассеяние рентгеновских лучейИли электронный парамагнитный резонанс), порождая область интегративной структурной биологии 43 , 44 , 45 , 46 . Нынешняя цель - проложить путь для FRET как количественного инструмента в структурной биологии. В качестве примера эта методика была использована для идентификации трех конформационных состояний в лиганд-связывающем домене (LBD) рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Конечной целью является преодоление вышеупомянутых ограничений и привлечение FRET среди интегративных методов, используемых для структурного определения биомолекул, путем обеспечения измеренных расстояний с высокой точностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка PBS-буфера и обработка камеры

ПРИМЕЧАНИЕ. Носите лабораторное пальто и одноразовые перчатки при проведении влажных химических экспериментов. При выравнивании лазера используйте средства защиты глаз.

  1. Подготовка буферного раствора PBS
    1. Растворяют 4,5 г Na 2 HPO 4 , 0,44 г NaH 2 PO 4 и 3,5 г NaCl в 400 мл дистиллированной воды. Обеспечьте pH 7,5 и стерилизуйте раствор автоклавированием на жидком цикле в течение 1 ч (в зависимости от системы автоклава).
    2. Возьмите 15 мл раствора PBS и смешайте его с 0,1 г древесного угля. Фильтруйте смесь, используя обычный 20-миллилитровый шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм . Запечатывают и хранят буфер PBS при комнатной температуре.
  2. Обработка покровного стекла с микроскопом
    1. Добавить 500 мкл дистиллированной воды и 5 мкл полисорбата 20 неионогенного поверхностно-активного вещества (см. Список материалов)К системе камерного покровного стекла (см. Список материалов) и хорошо перемешать. Дать настояться 30 мин. Удалите раствор полисорбата 20 и дважды промойте камеру дистиллированной водой. Дайте высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Камера готова к использованию.

2. Подготовка образцов ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте разработанные маркированные нити ДНК (см. Список материалов) для создания стандартных образцов двухцепочечной ДНК (dsDNA). В разработанных олигомерах не должно быть красителей на конце полимера, чтобы избежать артефактов, которые могут скомпрометировать определенное расстояние. Последовательность ДНК следует выбирать так, чтобы она вела себя как твердое тело.

  1. Добавьте 1,5 мкл донорной меченой ДНК-цепи и 4,5 мкл комплементарной (акцептор-меченной или немаркированной) ДНК-цепи в микроцентрифужную пробирку и смешайте их с 24 мкл воды, свободной от нуклеазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от смеси выбранных олигонуклеотидов будут генерироваться следующие образцы: no-FRET, loW-FRET или высоко-FRET-дцДНК.
  2. Гибридизуют ДНК, используя термомиксер и следующий процесс: 95 ° С в течение 10 мин, 90 ° С в течение 10 мин, 80 ° С в течение 10 мин, 70 ° С в течение 10 мин, 60 ° С в течение 10 мин, 50 ° С В течение 10 мин, 40 ° С в течение 10 мин, 30 ° С в течение 10 мин, 20 ° С в течение 10 мин, 10 ° С в течение 10 мин и выдерживания при 5 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сгенерированные стандарты дзДНК могут храниться в морозильнике -20 ° C для длительного хранения или могут быть использованы немедленно.

3. Подготовка образцов белков

Примечание: Начиная с рекомбинантной ДНК для экспрессии представляющего интерес белка в бактериальных системах, возможно мутировать остатки, из которых расстояния должны быть измерены в цистеины. Для этого используйте стандартные методы сайт-направленного мутагенеза 47 . Для облегчения очистки белка клонируют рекомбинантную и мутантную ДНК в вектор, содержащий метку очистки ( например,His-tag). Использовали лигандсвязывающий домен глутаматной субъединицы 1 (LBD) из NMB-глутаматного ионотропного рецептора (GluN1) LBD ( т.е. NMDA GluN1 LBD, клонированный в вектор pET-22b (+)).

  1. Экспрессия белка
    1. Трансформируйте ДНК-плазмиду в систему выбора 48 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. На следующих стадиях предполагается, что экспрессия растворимого белка трансформируется в Escherichia coli . Также возможна очистка, например, от трансфецированных клеток млекопитающих 49 или трансдуцированных клеток насекомых 50 , и подробные этапы могут быть найдены в другом месте. Убедитесь, что выбранный штамм E.coli подходит для интересующего белка. Например, экспрессия белков, которые содержат дисульфидные мостики, требует напряжения компетентных клеток с менее редуцирующим внутриклеточным компартментом (см. Список материалов).
    2. Прививать стартер E. Coli, используя стерильный наконечник пипетки, чтобы собрать одну трансформированную колонию 48 . Бросьте его в 100 мл селективной среды LB (см. Список материалов) и позвольте культуре расти в течение ночи при 37 ° C.
    3. Подготовить бульон LB (см. Список материалов). Автоклавируйте его для стерилизации.
    4. Прививают крупномасштабные культуры трансформированных E. coli , добавляя ночную культуру к 2 л селективной среды LB при соотношении 1: 500.
    5. В течение следующих нескольких часов оценивайте рост культуры, контролируя показания поглощения (Abs) культуры при 600 нм, иногда называемые оптической плотностью при 600 нм (OD 600 ), или с помощью измерителя плотности ячеек. Обратите внимание, что показания увеличиваются с течением времени.
    6. Вызывают экспрессию белка с конечной концентрацией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG), когда культура достигает ОП 600, равную 0,7. Встряхиваемая кишечная палочка при 20 ° С в течение 20-24 ч.
    7. После индукции белка таблетку E. coli центрифугируют в течение 20 мин при 3000 и 4 ° С. Отбрасывают супернатант и хранят таблетку E. coli, содержащую внутриклеточный белок при -80 ° C до использования.
  2. Очистка белков
    1. Lyse E. coli с использованием выбранного метода лизиса ( например, ультразвук, французский пресс, кавитация азота и т . Д.) 51 .
    2. Спинните вниз по мембране и клеточному мусору, центрифугируя лизат в течение 1 часа при 185000 xg и 4 ° C.
    3. Для His-меченого белка загрузите супернатант на уравновешенную, никель-заряженную иммобилизованную колонку аффинной хроматографии (IMAC) с использованием быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC) (см. Таблицу материалов ) 52 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: буфер для уравновешивания для NMDA GluN1 LBD: 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис и 1 мМ глицин, pH 8. Буфер для элюирования для NMDA GluN1 LBD: 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис, 1 мМ глицина и 400 мМ имидазола, pH 8.
      1. Промойте колонку IMAC буфером, содержащим небольшое количество (~ 12 мМ) имидазола.
      2. Элюируют белок из колонки IMAC с использованием линейного градиента имидазола с 12 мМ до 400 мМ.
    4. Диализуют белок в течение ночи в уравновешивающем буфере без имидазола 53 , помещая элюат с этапа 3.2.3.2 в диализную трубку и погружая его в уравновешивающий буфер при непрерывном перемешивании в течение 2-3 часов. Повторите, по крайней мере, еще один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этапы 3.2.3-3.2.6 предполагают очистку His-меченого белка. При очистке с помощью какого-либо другого метода соответствующим образом настройте протокол.
    5. Определите количество белка, взяв поглощение при 280 нм диализованного белка и используя закон Бера ( единица поглощения = ε L c , где ε - коэффициент экстинкции (М -1 см -1), Которую можно получить здесь 54 ; L - длина светового пути (см); И с - концентрация белка (М)).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Существуют различные анализы количественного определения белка, включая анализ Брэдфорда и анализ на бицинхониновую кислоту. Оба дают точные результаты.
  3. Маркировка белков
    1. Добавить к очищенному протеину донор (малеимидный реактивный голубой краситель) и акцептор (малеимидный реактивный крахмальный краситель) к молярному соотношению 1: 1: 8: донор: акцептор.
    2. Инкубируйте смесь белка и флуорофора на льду в течение 30 мин. Возможны более длительные инкубационные периоды.
    3. Упакуйте 0,5 мл агарозную колонку из Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (см. Список материалов) и уравновешите ее, используя тот же буфер для уравновешивания, что и на этапе 3.2.3, в то время как этот белок инкубируют.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте количество загруженного белка в соответствии со способностью связывания смолы.
    4. Через 30 минутКубированием, загружают смесь белок / флуорофор на колонку, полученную на стадии 3.3.3, и очищают гравитационным потоком.
    5. Смыть избыток флуорофора с 5 мл уравновешивающего буфера.
    6. Элюируйте маркированный белок самотеком из колонки четыре раза с 0,5 мл элюирующего буфера. Поскольку белок уже очищен от других белков, градиент не требуется.
    7. Проверяйте каждый элюат спектрофотометром UV-Vis, чтобы определить, какая фракция содержит меченый белок. Сканирование оптической плотности от 230 до 700 нм для обеспечения того, чтобы пики поглощения от белка (280 нм) и каждого флуорофора (493 нм для циан-зеленого флуорофора и 651 нм для дальнего красного флуорофора) были видны в элюат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, белок будет элюироваться во фракции 2.
    8. Равновесили колонку обессоливания (см. Таблицу материалов ) с PBS, обработанным древесным углем (шаг 1.1).
    9. Загрузите меченый протеин на обессоливающую колонку с помощью гравитационного потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте количество загруженного белка в соответствии с выбранной емкостью 55 обессоливающей колонки.
    10. Элюируют, используя 3,5 мл обработанного древесным углеродом PBS, гравитационным потоком и собирают 0,5 мл фракции элюата.
    11. Используйте спектрофотометр для измерения поглощения поглощения каждого элюата от 230 до 700 нм, чтобы определить, какая фракция содержит маркированный белок.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги 3.3.8-3.3.11 в основном служат в качестве шага обмена буфером. Другие протоколы, которые служат этой цели, также возможны ( например, расширенный диализ). В качестве альтернативы, можно перейти сразу к шагу 3.3.8 с шага 3.3.2.

4. Измерения, необходимые в условиях ансамбля (в кювете)

  1. Определение постоянной Фёрстера
    1. Сканирование f D , флуоресцентное флуоресцентное излучение (cps), во флюориметре путем возбуждения донора на 15 нм до его максимальной длины волны поглощения, чтобы получить полное emСпектр. Контролируйте излучение, начиная с 5 нм после волны возбуждения и заканчивая 150 нм позже. Используйте условия магического угла, установив поляризатор излучения на 54,7 ° И поляризаторы возбуждения до 0 ° 56 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для используемого здесь донорного флуорофора максимальный Abs имеет место при 490 нм; В качестве длины волны возбуждения используется 475 нм, и контролируется излучение 480-650 нм. Для акцептора максимум Abs имеет место при длине волны 645 нм; Для длины волны возбуждения используется 630 нм, и контролируется излучение от 635-735 нм.
    2. Используйте флуориметр, чтобы выполнить сканирование возбуждения флуорофора акцептора (Abs A ) в диапазоне от 400 до 700 нм и использовать условия магического угла, установив поляризатор излучения на 54,7 ° И поляризаторы возбуждения до 0 ° 56 . Установите эмиссионный монохроматор на 15 нм после длины волны максимального излучения. Нормализовать до максимального значения exci.
    3. В опубликованных таблицах найдите коэффициент экстинкции акцептора, ε A (M -1 см -1 ) 56 , или используйте значения, предоставленные производителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение, опубликованное для акцепторного флуорофора, используемого в этой рукописи, составляет ε A647 = 270 000 см -1 М -1 56 .
    4. Вычислить спектральное перекрытие, используя J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , где f D , Abs A и ε A определены выше λ и является длиной волны (нм). Используйте рабочий лист, чтобы отобразить в столбцах все значения, зависящие от длины волны, полученные на этапах 4.1.1-4.1.3. Выровняйте их по длине волны. Выполните суммирование от минимальной длины волны излучения донора (λ min ) до максимальной длины волны поглощающего поглотителяE (λ max ).
    5. Вычислить постоянную Фёрстера (R o ) с использованием следующей формулы R o 6 = 8,79 × 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , где J - это спектральное перекрытие, ранее рассчитанное на этапе 4.1.4, Κ 2 Фактор ориентации, Ф F, D - квантовый выход флуоресценции донорного флуорофора, а n - показатель преломления среды, в которой находится флуорофор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте n = 1.33 (если используется водный буфер) и κ 2 = 2/3.
    6. Найдите квантовое значение выхода донорного флуорофора (Φ F, D , Зависит от среды) в опубликованных таблицах (см. Ссылку 57) и использовать значение спектрального перекрытия, полученное на этапе 4.1.4, для вычисления конечного значения постоянной Фёрстера с использованием уравнения eqИз шага 4.1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если квантовый выход недоступен, выполните шаг 4.2, приведенный ниже, для его вычисления. В этом случае используйте Ф F, D = 0,8, что соответствует времени жизни донора τ D, r = 4,0 нс.
  2. Определение квантового выхода флуоресценции
    ПРИМЕЧАНИЕ. Следующая процедура предполагает только динамическое гашение. Рассмотрение статического тушения см. В ссылке 56. Однако эксперименты PIE-MFD также полезны для определения квантового выхода даже в случае статической закалки (см. Результаты).
    1. Выберите эталонный флуорофор с подобными профилями поглощения и излучения как для акцепторного, так и для донорного флуорофоров, для которых был определен квантовый выход (Φ r ).
      Примечание: для донора Φ r = 0,8 и τ r = 4 нс, тогда как для акцептора Φ r = 0,32 и τ r = 1,17 нс, весКоторые соответствуют Фг и т для циан-зеленого флуорофора- и дальне-красных флуоротор-меченых олигонуклеотидов, соответственно 57 .
    2. Измеряют распад флуоресценции с временным разрешением (f (t)), используя метод корреляции однофотонного отсчета времени (TCSPC) в условиях магического угла.
    3. Установите распад флуоресценции с моно- или мультиэкспоненциальной функцией распада в виде f (t) = Σ i x i e -t / τ i , где x i - доля населения и τ i - время жизни популяционной флуоресценции.
    4. Рассчитать среднее время жизни видов, <τ> x = Σx i τ i , Где x i - доля населения и τ i - время жизни популяционной флуоресценции.
    5. Использовать thФормула Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Для расчета квантового выхода флуоресценции донорного флуорофора путем включения времени жизни флуоресценции и квантового выхода эталона, а также времени жизни флуоресценции донорного флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод предполагает динамическое тушение. Для других определений Φ F, D следуйте Lakowicz 56 .

5. Выравнивание эксперимента для одномолекулярного детектирования PIE-MFD (SMD)

ПРИМЕЧАНИЕ. Лучше отключить свет при проведении измерений.

  1. Регулировка оборудования (рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого эксперимента используется встроенная установка MFD, изображенная на рисунке 1 , с двумя импульсными лазерами и 4 каналами обнаружения в корпусе инвертированного микроскопа. Есть похожие коммерческие системы.
    1. Включите лазеры на 485 нм и 640 нм и все извещатели установки MFD. Откройте программное обеспечение, контролирующее приобретение и лазеры TCSPC. Убедитесь, что частота повторения лазера составляет 40 МГц.
    2. Установите импульсную лазерную мощность 485 нм до 60 мкВт в плоскости изображения объектива с водной иммерсией 60X 1.2 NA и импульсной лазерной мощностью 640 нм до 23 мкВт в импульсном режиме с чередующимся возбуждением (PIE-MFD) 42 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для установки PIE-MFD два лазерных импульса задерживаются в программном обеспечении контроллера лазера. Для лазерного возбуждения 485 нм каналы обнаружения TCSPC (каналы TAC) составляют 1-12 499 («подсказывающий» канал). При возбуждении лазером 640 нм каналы обнаружения TCSPC (каналы TAC) составляют 12,499-50,000 («задержанный» канал).
    3. Добавьте объективную иммерсионную жидкость (каплю дважды дистиллированной воды) между объективом микроскопа и стеклянным предметным стеклом. Чтобы убедиться, что плоскость изображения находится внутри раствора и находится далеко от стеклянной поверхностиCe, поверните регулировочную ручку на полтора оборота после нахождения второй яркой фокальной точки из-за отражения лазеров на границе стекло-жидкость.
    4. Добавить 1 мкл 100 нМ родамина 110 до 50 мкл дистиллированной воды к центру покровного стекла. Убедитесь, что решение также находится в центре объектива микроскопа.
    5. Отрегулируйте положение отверстий (размер: 70 мкм) (направление x и y по одному), контролируя скорость счета фотонов в программном обеспечении для сбора, чтобы максимизировать количество обнаруженных фотонов.
  2. Стандартное измерение SMD (работа в темном помещении)
    1. Используйте образец с шага 5.1.4 и запишите 120 секунд скорости счета, нажав кнопку «Пуск» на панели управления с временным разрешением (TTTR) в формате «* .ht3» 58 на ПО регистрации.
    2. Вычислите офлайновую флуоресцентную корреляционную спектроскопию (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( т. Е. Измерение FCS), чтобы определить характерное время диффузии, число молекул в конфокальном объеме, кинетику триплетного состояния и молекулярную яркость 62 .
      1. Откройте программное обеспечение для FCS (Kristine, MFD suite). Выберите экспериментальные настройки, нажав «Параметры» -> «Выберите Настроить». Выберите файл с похожими экспериментальными настройками и нажмите «получить параметры из файла», чтобы прочитать информацию заголовка в файле.
      2. Выберите «Operate» -> «Correlate» для выполнения FCS.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что номера каналов правильно указаны и что установлен флажок «TAC Gate» (каналы TCSPC), чтобы соответственно выбрать каналы подсказки или задержки.
      3. Выберите «Operate» -> «Global Fit of Correlation Curves», чтобы открыть процедуру подгонки. Используйте «уравнение № 24» на softwarE и нажмите «Старт».
        ПРИМЕЧАНИЕ. Уравнение № 24 в программном обеспечении описывает функцию автокорреляции ( G c ) свободно диффундирующих флуоресцентных молекул по трехмерному гауссовскому профилю освещения, например 61 :
        figure-protocol-1
        Где N - среднее число молекул в объеме детектирования, x T - доля молекул, оказывающих кинетику триплетного состояния, с характерным временем t T , t c - время корреляции, t diff - время диффузии, связанное с геометрическим Параметр ω , а ω описывает гауссовский профиль освещенности. После подгонки обратите внимание на время диффузии и число молекул в конфокальном объеме.
    3. Добавить 10 мкл 100 нМ родамина 101 в 50 мкл дистиллированнойВоды и хорошо перемешать. Поместите эту смесь поверх покрывающего стекла и убедитесь, что капля находится в центре объектива. Нажмите кнопку «Пуск» на панели управления TTTR, чтобы записать 120 секунд данных в формате TTTR.
    4. Добавьте 1 мкл 100нМ дальне-красного флуорофора в 50 мкл дистиллированной воды и хорошо перемешайте. Поместите эту смесь в центр объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 120 секунд данных в формате TTTR.
    5. Поместите 50 мкл дистиллированной воды в центр объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 300 секунд данных в формате TTTR.
    6. Поместите 50 мкл буфера PBS в центре объектива. Нажмите кнопку «Пуск» и запишите 300 секунд данных в формате TTTR.
    7. Взять 1 мкл смеси из шага 5.1.4 и смешать с 50 мкл дистиллированной воды. Поместите эту смесь на покровное стекло. Сначала нажмите кнопку «Пуск» и соберите 10 секунд данных в режиме TTTR. Затем проанализируйте ТТTR, используя программное обеспечение для анализа времени жизни флуоресценции (BIFL) (Paris, MFD suite), как описано в шаге 5.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте количество пакетов в секунду из программного обеспечения выбора и анализа пакетов 26 , 61 . Если уровень всплеска составляет около 35 каждые 10 секунд, он подходит для одномолекулярного измерения.
    8. Продолжайте записывать скорость счета в формате TTTR в течение 1,5 ч ( т. Е. TCSPC при SMD), чтобы рассматривать как одномолекулярный стандарт измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Из-за большого размера файла разбейте необработанные файлы «* .ht3» в файлы меньшего размера для загрузки и обработки с использованием BIFL.
  3. Анализ стандартных образцов с использованием BIFL
    1. Откройте программное обеспечение BIFL (Париж).
    2. Выберите настройку PIE в автоматическом всплывающем окне «подтвердить настройку» и прочитайте заголовок, выбрав файл с аналогичными экспериментальными настройками. Нажмите «Получить параметры дляM file ". Нажмите« OK ». Обратите внимание, что всплывающее окно закрывается и интегрируется в парижский интерфейс. Нажмите« OK »в разделе« Далее ».
    3. Выберите файлы для анализа, нажав «Выбрать» в «Массив путей данных», чтобы выбрать измерение для анализа.
      1. Нажмите «Зеленый разброс» (для измерения воды), «Зеленый BG» (для измерения в буфере), «Зеленая толстая» (для измерения 2 Rh измерения уровня Rhodamine 110), «Красный разброс» (для измерения воды) «Красный BG» (для измерения буфера или воды), «Red thick» (для 20-нм измерения Rhodamine 101), «Желтый разброс» (для измерения воды), «Желтый BG» (для измерения буфера) и «Желтая губка» (для 2 нм красного флуорофора).
      2. Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
        ПРИМЕЧАНИЕ. «Зеленый» канал соответствует сигналу зеленых детекторов в «подсказках» каналов TCSPC.4, Красный канал соответствует сигналу красных детекторов в «быстрых» каналах TCSCP. «Желтый» канал соответствует сигналу красных детекторов в каналах задержки TCSPC.
    4. Нажмите «Adjust» («Настроить») рядом с «Data cut Burstwise» для настройки параметров выбора одной молекулы. В новом всплывающем окне выберите одномолекулярные события с двумя стандартными отклонениями от среднего времени прибытия интерфотонов («dt»), изменив время прихода на интерфотон в «Threshold» и минимальное количество фотонов на одно событие молекулы при «min . #. " Нажмите «Вернуться», чтобы закрыть всплывающее окно. Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Порог, в единицах мс, зависит от скорости счета фона. Типичное минимальное количество используемых фотонов равно 60.
    5. Отрегулируйте начальное время жизни флуоресценции «Параметры цветового подбора» ( например , от, до и свертку) для генерацииD-флуоресценции на «зеленый», «красный» и «желтый» цвета. В том же окне настройте значения «от» и «до» для «Приглашение» и «Задержка». Нажмите «Вернуться», чтобы закрыть всплывающее окно. Нажмите «ОК» в разделе «Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что установлен флажок двухцветного возбуждения. «От» и «до» соответствуют начальной и конечной ячейкам на гистограмме распада флуоресценции (номер канала TAC). Если исходные параметры подгонки выбраны правильно, функция фитирования добавляется к флуоресцентным спадам на каждом канале.
    6. Выберите местоположение на жестком диске, в которое необходимо сохранить все обработанные файлы ascii в родительской папке.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Париж обрабатывает все выбранные пакеты и создает несколько выходных файлов ascii, которые могут использоваться другими программами для визуализации ( например, пакет Margarita MFD).

6. Стандарты и выборка dsDNAurements

  1. Добавить 500 мкл PBS-буфера в камеру с покровным стеклом и поместить каплю дистиллированной воды между камерой и линзой. Нажмите кнопку «Пуск» на педали управления и соберите 5 минут данных в режиме TTTR, чтобы использовать их для анализа.
  2. Возьмите небольшое количество (обычно около 0,1 мкл, концентрация около 1 мкМ) стандарта dsDNA, добавьте его в буфер PBS и хорошо перемешайте. Сначала соберите 10 с данных, нажав «Пуск». Затем проверьте пакет, чтобы получить 35 всплесков за 10 секунд (как на этапах 5.2.7 и 5.3). Наконец, собрать> 2 часа данных в формате TTTR, как описано выше.
  3. Проанализируйте собранные данные для образцов ДНК, как на этапе 5.3.3.
  4. Визуализируйте гистограммы пакетов, используя набор MFD (Margarita) и покажите эффективность FRET по сравнению с <τ D (A) > f или F D / F A против <τ D (A) > f .
    1. Открыть tОн программное обеспечение Margarita и выберите «Файл» -> «Импортировать все файлы *. ?? 4 и * .mti». Выберите родительскую папку, содержащую различные подпапки.
    2. Выберите параметры для визуализации, щелкнув рядом с «X» (абсцисса) одного из параметров, полученных из Парижа ( например, tau green или <τ D (A) > f ); Аналогично повторите это для ординаты «Y», чтобы выбрать желаемый параметр для визуализации ( например, эффективность FRET, F D / F A или S PIE PIE).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае эффективность FRET, F D / F A или S PIE правильна для правильной скорости счета фона в зеленых, красных и желтых каналах; Для квантовых выходов донора и акцептора; Для коэффициента эффективности обнаружения (g G / g R ); И для перекрестных помех (α). Здесь g G / g R = 3,7 и α = 0,017, в зависимости от инструмента. Скорость счета фонаЗависят от используемого буфера, и значения квантового выхода ранее определены.
    3. Добавьте строку FRET, открыв окно «Оверлейное уравнение», нажав «Экран» -> «Наложение уравнения». Выберите статическую строку FRET во всплывающем меню. Выберите правильное время жизни донора и параметры квантового выхода, чтобы сформировать правильную линию FRET.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Строки FRET для корреляции различных индикаторов FRET могут генерироваться.
  5. Определите поправочный коэффициент для возбуждения акцептора источником донорного возбуждения (β), используя параметр стехиометрии, показав эффективность FRET относительно стехиометрии (S PIE ) в Margarita (уравнение 1 ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ: β выбирают так, чтобы образец донора имел пик при S PIE = 1,0 в стехиометрической шкале; Образец только для акцептора должен иметь стехиометрию S PIE = 0,0, а дцДНК с обеими метками должна иметь стехиометрию S PIE ~ 0,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Инструмент готов, и можно измерить образцы, помеченные FRET.
  6. Измеряйте и анализируйте образцы, меченные FRET, полученные в разделе 3, следуя этапам 6.3-6.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В типичных экспериментах smFRET с использованием установки MFD (лазерные линии: 485 нм при 60 мкВт и 640 нм при 23 мкВт, раздел 5.1) образец флуоресценции разбавляют до низкой пикомолярной концентрации ( 10-12 М = 1 пМ) и помещают В конфокальном микроскопе, где субнаносекундный лазерный импульс возбуждает меченые молекулы, свободно диффундирующие через объем возбуждения. Типичный конфокальный объем <4 фемтолитров (фЛ). При таких низких концентрациях только отдельные молекул...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе представлен протокол для выравнивания, калибровки и измерения междисковых расстояний с высокой точностью с использованием одномолекулярных FRET-экспериментов PIE-MFD. Путем тщательной калибровки всех инструментальных параметров можно повысить точность измеренных расстояний и достичь точности ангстрема. Для этого различные многомерные гистограммы используются для анализа и идентификации популяций для дальнейшей характеристики. Используя среднее время макроскопии для проверки стабильности измеренных образцов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов с содержанием этой статьи.

Благодарности

VJ и HS подтверждают поддержку от NIH R01 GM094246 до VJ. HS признает стартовые фонды в Программе творческих исследований Университета Клемсона и в Центре по оптическим материалам и инженерным технологиям в Университете Клемсона. Этот проект также был поддержан учебным стипендиатом Центра Кека по междисциплинарному обучению в области бионауки Консорциумов побережья Мексиканского залива (грант NIGMS № 1 T32GM089657-05) и стипендий Фонда Schissler для трансляционных исследований распространенных заболеваний человека в отношении DD. Содержимое является исключительно авторами и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
угольMerck KGaAK42964486 320
шприц фильтрFisherbrand09-719Cразмер: 0.20 &; m
камерное покровное стеклоFisher Scientific1554091,5 боросиликатное стекло, 8 лунок
покровное стекло микроскопаFisher Scientific063014-9размер: 24 x 60-1,5
Вода без нуклеазыFisher Scientific148859без нуклеазы
tween-20Thermo Scientific2832010% раствор полисорбата 20
цепь акцептора ДНК ( High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
акцепторная цепь ДНК (Low FRET)Integrated DNA Technologies1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
цепь донорской ДНК DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
цепь ДНК (без FRET)Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
термоамплификаторEppendorfE6331000025градиент
нексусаAlexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254назван голубым зеленым флуорофором в манускрипте
Alexa Fluor 647 C2  МалеимидThermo ScientificA20347назван дальним красным флуорофором в манускрипте
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426Для культивирования E. coli
AmpicillinSigma-AldrichA0166Используется при 100 & микро; г/мл конечной концентрации в селективной среде LB для поддержания плазмидного отбора
Тетрацилин Calbiochem58346Используется при 12,5 & микро; г/мл конечной концентрации в селективной среде LB для поддержания мутации gor (флутатионредуктазы) в штаммах Origami B(DE3) для облегчения окисления дисульфидной связи
KanamycinScientificBP906-5Используется при 15 & микро; г/мл конечной концентрации в селективной среде LB для поддержания мутации trxB (риоредоксина редуктазы) в красителях B(DE3) для облегчения окисления дисульфидных связей
Оригами B(DE3) Компетентные клеткиMillipore70837-3Компетентные клетки E. coli для экспрессии белка с дисульфидными мостиками
Изопропил-&бета;-D-тиогалактопиранозид (IPTG)Fisher ScientificBP1755Для индукции экспрессии белка E. coli
хелатирование HiTrap HPGE Life Sciences17-0409-01Для крупномасштабной очистки FPLC меченого His-меченного белка
ImidazoleSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose Qiagen30210
PD-10 Колонна для обессоливанияGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC Инструмент
Диализные трубкиСпектр лабораторий13256215 кД MWCO 24 мм Ширина плоскости, 10 метров/рулон
DichroicsSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Поляризатор светоделительQioptiq Linos G33 5743 00010 x 10 пленочный поляризатор
Зеленый проходной фильтрChromaET525/50mET525/50m Крепление диаметром 25 мм
Красный проходной фильтрChromaET720/150mET720/150m Крепление диаметром 25 мм
Измеритель мощностиThorLabdPM200
UV-Vis спектрофотометрVarianCary300Bio
Fluorolog 3 флуориметрHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC контроллерHoribaFluorohub-BTCSPC электроника для ансамблевых измерений
NanoLed 485LHoriba485LСиний диодный лазер
NanoLed 635LHoriba635LКрасный диодный лазер
Olympus IX73РамкаIX73P2FРамка микроскопа
PMA 40 Гибридный детекторPicoQuant GmbH932200, PMA 40Оптимизирован для обнаружения зеленого цвета
PMA 50 Гибридный детекторPicoQuant GmbH932201, PMA 50Оптимизирован для ed shifter
чувствительность 485 нм лазерPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 нм лазерPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 и программное обеспечение для приобретения TTTRPicoQuant930021Пикосекундный таймер событий и коррелированный по времени блок однофотонного контроля, включает в себя программное обеспечение для приобретения TTTR
SEPIA II SLM 828 и программное обеспечение SEPIAPicoQuant910028лазерный драйвер для пикосекундных импульсов, включает в себя программный контроллер SEPIA.
компьютерDelloptiplex 7010процессор: i7-3770 оперативная память: 16 ГБ
программного обеспечения FRET Positioning and Screening (FPS)Heinrich Heine UnviersityОн включает в себя клакуалтор Accesibel Volume, доступный в
http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html MFD suiteHeinrich Heine UnviersityОн включает в себя программный пакет BIFL Paris; Margarita для визуализации многопараметрических гизотрамов, а программное обеспечение для анализа распределения вероятностей доступно на http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
интегрированная микроскопа Olympus

Ссылки

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838(2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121(2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791(2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256(2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792(2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206(2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432(2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104(2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRETNMDA

Похожие статьи